高三尖杉酯堿與伊馬替尼協(xié)同誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞凋亡

殷世亮，張弘，金戈，王俊平，周凡

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生理學(xué)教研室；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科）

高三尖杉酯堿與伊馬替尼協(xié)同誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞凋亡

殷世亮1，張弘2*，金戈1，王俊平1，周凡3

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生理學(xué)教研室；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科）

目的：考察高三尖杉酯堿（HHT）與伊馬替尼（STI571）對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）細(xì)胞株KU812細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。方法：采用AO-EB熒光染色法及PI染色的流式細(xì)胞術(shù)，考察HHT和STI571分別和聯(lián)合給藥對(duì)KU812細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；采用Western blot技術(shù)考察HHT和STI571對(duì)KU812細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果：HHT能夠與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡，且兩者的協(xié)同誘導(dǎo)作用呈時(shí)間及劑量依賴效應(yīng)；能顯著引起PARP蛋白裂解，并顯著下調(diào)Bcl-XL蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：HHT與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡，具有協(xié)同抗CML作用。

高三尖杉酯堿；伊馬替尼；細(xì)胞凋亡；慢性粒細(xì)胞

［Abstract］Objective：To investigate the apoptotic induction effects of homoharringtonine（HHT）combined with imatinib（STI571）on human chronic myeloid leukemia（CML）KU812 cells.Methods：KU812 cells were treated with HHT or/and STI571.Total cell numbers were counted by using hemocytometer.Apoptotic cells were determined by using fluorescence microscope and FACS after staining with AO-EB and PI respectively.The cleavage of poly ADP-ribose polymerase（PARP）and the expression of anti-apoptotic proteins were determined by Western blot.Results：HHT could prompt the apoptotic induction of imatinib in KU812 cells，which was in a time and dose dependent manner.Apoptosis induced by HHT and imatinib was correlated with the down-regulation of Bcl-XL and the cleavage of PARP.Conclusion：HHT prompt apoptotic induction of imatinb in KU812 cells and the combination of HHT with imatinib will provide a more effective strategy for the clinical treatment of CML.

［Key words］homoharringtonine；imatinib；apoptosis；CML

高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）是從紅豆杉科三尖杉屬三尖杉（Cephalotaxus fortumei Hook f.）的枝葉、種子、樹皮和根部分離出的具有抗腫瘤活性的生物堿［1-3］。HHT和它的類似物能夠抑制蛋白質(zhì)和DNA的合成。甲磺酸伊馬替尼（STI571）是基于人慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）特異表達(dá)的融合蛋白BCR/ABL的酪氨酸激酶活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的小分子化合物，2001年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療慢性期CML。臨床報(bào)道表明，STI571耐藥的CML細(xì)胞對(duì)HHT仍然敏感［4-5］。本研究將HHT和BCR/ABL蛋白的小分子抑制劑STI571聯(lián)合，考察HHT與STI571對(duì)CML細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，以期為CML的臨床治療提供更為有效的治療方案。

1　材料與方法

1.1材料人CML細(xì)胞株KU812（美國(guó)ATCC公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；碘化丙啶（PI）、丫啶橙（AO）、溴化乙啶（EB）（美國(guó)Sigma公司）；Western blot抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；鼠抗PARP和鼠抗Mcl-1單克隆抗體（美國(guó)Cell-Signaling公司）；化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒（英國(guó)Amersham Biosciences公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人CML細(xì)胞株KU812細(xì)胞均培養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%（v/v）經(jīng)加熱滅活的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3AO-EB雙染法進(jìn)行凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×105/ml的細(xì)胞密度接種于24孔板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)液。藥物作用后，取1 ml細(xì)胞懸液，3 000 r/min離心1 min，棄上清液，重懸于50 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）中，然后加入AO/EB等體積混合液5 μl（100 μg/ml AO，100 μg/ml EB），混勻。取12 μl混合液點(diǎn)于潔凈載玻片上，用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡490 nm波長(zhǎng)下記錄并觀察細(xì)胞的染色情況和形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞呈現(xiàn)AO著色的綠色熒光同時(shí)EB拒染，并出現(xiàn)核皺縮、邊緣化、發(fā)芽、發(fā)泡以及凋亡小體等典型凋亡形態(tài)的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞若呈現(xiàn)EB著色的紅色熒光，說明細(xì)胞已經(jīng)死亡，為壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞。

1.4細(xì)胞PI染色的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)藥物處理相應(yīng)時(shí)間后離心收集細(xì)胞（2×106個(gè)），經(jīng)PBS洗滌后用300 μl PBS重懸細(xì)胞，加入20 ml冰預(yù)冷的70%乙醇中固定12 h后收集樣品。離心收集細(xì)胞，于800 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育20 min后，加入PI染色液。待測(cè)樣品DNA含量采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，吸收波長(zhǎng)為625 nm?？v坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量，橫坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度即DNA含量。樣品經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)采集10 000個(gè)細(xì)胞。所得數(shù)據(jù)采用CELLQuest軟件（Becton Dickinson）進(jìn)行處理分析。

1.5Western blot檢測(cè)研究表明，HHT可以誘導(dǎo)CML細(xì)胞的凋亡并下調(diào)Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)水平，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［3］，因此應(yīng)用Western blot法檢測(cè)了HHT和STI571分別及聯(lián)合處理KU812細(xì)胞后Bcl-XL的蛋白水平，以及細(xì)胞凋亡指示蛋白PARP（poly-（ADP-ribose）-polymerase）的活化情況。凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞總蛋白（300 μg）通過RIPA裂解緩沖液［60 mmol/L Tris鹽酸，180 mmol/L氯化鈉，0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS），1%NP-40，0.6%脫氧膽酸鈉，1 mmol/L PMSF，200 μmol/L leupeptin和3 μg/ml aprotinin，pH 8.0］裂解得到。應(yīng)用Bradford蛋白定量法定量蛋白，通過SDS-凝膠電泳法分離蛋白，采用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀將蛋白濕轉(zhuǎn)到

PVDF膜上。采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后，加入20 ml稀釋濃度的待測(cè)蛋白特異性單克隆抗體，于4℃結(jié)合12 h。TBST洗滌3次后與標(biāo)記的二抗室溫結(jié)合1 h后TBST洗滌1次，PVDF膜經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL kit，Amersham Biosciences）處理5 min，PVDF膜與富士膠片于曝光板中壓片曝光，經(jīng)顯影液和定影液處理后掃描采集圖像。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HHT與STI571聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察通過AO-EB染色的熒光顯微鏡觀察HHT和STI571分別給藥以及聯(lián)合給藥對(duì)KU812細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。0.2 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571單獨(dú)處理KU812細(xì)胞24 h，均不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；聯(lián)合給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h，可觀察到顯著的細(xì)胞凋亡形態(tài)圖，HHT能夠協(xié)同STI571誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡，見圖1。

2.2HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的時(shí)間依賴性關(guān)系分別將0.1 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571單獨(dú)以及聯(lián)合處理KU812細(xì)胞12、24、48 h，及培養(yǎng)12、24、48 h的KU812細(xì)胞作為對(duì)照組，采用AO-EB染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法，結(jié)果顯示，單獨(dú)給予0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞12、24、48 h，誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡無明顯的的時(shí)間依賴關(guān)系；1 μmol/L STI571聯(lián)合0.1 μmol/L HHT處理細(xì)胞12、24、48 h，分別有20%、47%、86%細(xì)胞凋亡，可見HHT與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡具有顯著的時(shí)間依賴關(guān)系，見圖2。

2.3HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的劑量依賴性關(guān)系分別將不同濃度HHT和STI571單獨(dú)以及聯(lián)合處理KU812細(xì)胞24 h，采用AO-EB染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法，結(jié)果顯示，單獨(dú)給予0.1、0.2 μmol/L HHT或單獨(dú)給予1、2 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡均無明顯的劑量依賴關(guān)系；1 μmol/L STI571聯(lián)合0.1、0.2 μmol/L HHT處理細(xì)胞24 h，分別有42%和66%細(xì)胞凋亡，2 μmol/L STI571聯(lián)合0.1、0.2 μmol/L HHT處理細(xì)胞48 h，分別有72%和87%細(xì)胞凋亡，HHT與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡具有顯著的劑量依賴關(guān)系，見圖3。

圖1　HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×400）

圖2　HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的時(shí)間依賴性關(guān)系

圖3　HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的劑量依賴性關(guān)系

2.4HHT與STI571聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571單獨(dú)處理KU812細(xì)胞24 h，PI染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，分別有8.5%和4.9%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，未出現(xiàn)顯著的凋亡誘導(dǎo)作用。0.1 μmol/L HHT和1 μmol/LSTI571聯(lián)合處理KU812細(xì)胞24 h，采用PI染色的流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)到顯著的SubG1凋亡峰，約42%的KU812細(xì)胞發(fā)生凋亡，見圖4。

2.5HHT與STI571聯(lián)合給藥對(duì)KU812細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響分別給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h，并不顯著改變抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)水平，聯(lián)合給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h，可以顯著下調(diào)Bcl-XL蛋白的表達(dá)水平，并協(xié)同活化PARP凋亡指示蛋白，見圖5。

圖4　HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

圖5　HHT聯(lián)合STI571對(duì)KU812細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

3　討論

近年來的臨床研究顯示，STI571不能完全根除CML惡性克隆，并已出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性，據(jù)報(bào)道，對(duì)STI571耐藥的CML細(xì)胞對(duì)HHT仍然敏感，并且HHT對(duì)帶有T315I BCR/ABL酪氨酸激酶點(diǎn)突變的STI571耐藥細(xì)胞仍然有治療效果［6-7］。因此將HHT與STI571聯(lián)合給予CML患者將會(huì)取得良好的治療效果，并克服腫瘤的耐藥。

本實(shí)驗(yàn)中HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)CML細(xì)胞系KU812細(xì)胞凋亡，并呈良好的時(shí)間依賴和劑量依賴關(guān)系。0.1和0.2 μmol/L HHT處理KU812細(xì)胞24、48 h不能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同樣單獨(dú)給予1和2 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24、48 h也不能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但將兩者聯(lián)合給藥可顯著地誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，HHT與STI571聯(lián)合能夠顯著誘導(dǎo)CML細(xì)胞系KU812凋亡，二者具有協(xié)同抗CML作用。

HHT聯(lián)合STI571可以顯著地引起KU812細(xì)胞Bcl-XL的表達(dá)下調(diào)，并伴隨著凋亡標(biāo)準(zhǔn)性蛋白PARP的裂解活化。Bcl-XL為Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白，Bcl-XL的下調(diào)表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞的凋亡［8］。本研究提示HHT可能通過下調(diào)Bcl-XL抗凋亡蛋白發(fā)揮協(xié)同STI571誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗CML作用。

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Homoharringtonine Prompt Apoptotic Induction of Imatinib in CML Cells

YIN Shiliang1，ZHANG Hong2*，JIN Ge1，WANG Junping1，ZHOU Fan3
（1.Department of Pharmacology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Physiology，School of Life Science and Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University；3.Shenyang Military General Hospital）

R965

A

1008-2344（2016）05-0332-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.004

2016-03-16

（文敏 編輯）

沈陽醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才項(xiàng)目（No.20123045）；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目（No.L2013402）

殷世亮（1980—），男（漢），博士，講師，研究方向：抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究.E-mail：yslal@163.com

張弘（1981—），女（漢），博士，講師，研究方向：抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究.E-mail：song0688@sina.com