艾克巴爾·阿不都熱西提,程國杰,王晶,王磊
(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院,新疆烏魯木齊830001)
FoxO1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足的相關性研究*
艾克巴爾·阿不都熱西提,程國杰,王晶,王磊
(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院,新疆烏魯木齊830001)
目的探索FoxO1基因多態(tài)位點rs3751436、rs199728685、rs139436481與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足(ICTEV)的相關性。方法選取70例維吾爾族ICTEV患兒和30例正常健康兒童為研究對象,應用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應研究實驗對象rs3751436、rs199728685、rs139436481多態(tài)性位點基因型。運用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童肌肉組織FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析基因型分布頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律,運用χ2檢驗法分析FoxO1基因多態(tài)位點基因型、等位基因與ICTEV的相關性。結(jié)果維吾爾族ICTEV患兒肌肉組織中FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平與正常健康兒童比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào);Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示,新疆維吾爾族ICTEV患兒與正常健康兒童的FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)?;蛐?、等位基因關聯(lián)分析表明,ICTEV組和正常健康兒童rs3751436、rs199728685、rs139436481位點基因型、等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論維吾爾族ICTEV與FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點可能無相關性,但不能排除FoxO1與ICTEV的關聯(lián)性。
FoxO1;基因多態(tài)性;先天性馬蹄內(nèi)翻足
先天性馬蹄內(nèi)翻足(idiopathic congenital talipes equinovarus,ICTEV)是一種常見的嚴重危害兒童健康的先天畸形,由足下垂、內(nèi)翻、內(nèi)收3個主要畸形綜合而成。ICTEV病因尚未明確,僅推測遺傳、環(huán)境、易感基因等因素可能影響胚胎發(fā)育而導致馬蹄內(nèi)翻足[1]。國外研究表明,血管發(fā)育異常可直接影響肌肉及骨骼的發(fā)育,ICTEV發(fā)病與幼兒血管發(fā)育異常有關[2]。FoxO1作為Forkhead蛋白家族中重要一員,在維持動物血管穩(wěn)定和保持造血干細胞的健康方面發(fā)揮著重要作用[3],實驗顯示,缺失FoxO1的基因工程小鼠會出現(xiàn)嚴重的血管畸形現(xiàn)象,致畸原因可能與FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點調(diào)控血管壁細胞分裂有關。新疆維吾爾族ICTEV發(fā)病率約為0.83‰,高于新疆漢族ICTEV發(fā)病率(0.43‰),維吾爾族ICTEV患者同胞發(fā)病率為15.69%,遺傳度為92.86%[4-5]。因此,以新疆ICTEV高發(fā)人群維吾爾族為研究對象,探討FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點多態(tài)性與維吾爾族ICTEV的關系,是進一步了解ICTEV致病機制的有效手段。
1.1研究對象
選取2012~2014年新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷骨科收治的70例維吾爾族ICTEV患兒外周靜脈血、足部肌肉組織標本,且所有患兒均符合骨科診療常規(guī)中ICTEV診斷標準(北京協(xié)和醫(yī)院編寫),經(jīng)X線和手術確診。其中,男性52例,女性18例;年齡(6.45±2.11)歲。同期收集正常健康兒童30例(維吾爾族20例、漢族10例),男性16例,女性14例;年齡(7.11±2.10)歲。所有血液、組織標本采集均征得研究對象的知情同意,并簽署知情同意書。
1.2方法
1.2.1DNA提取使用K3EDTA抗凝真空采血管采集ICTEV患兒、正常健康兒童外周靜脈血5ml,置入-20℃冰箱冷凍保存。運用血液全基因組提取試劑盒進行DNA提取,核酸-蛋白分析儀測定260nm和 280nm處吸光值,計算全基因組DNA的濃度和純度。
1.2.2R NA提取運用組織和細胞總RNA提取法提取ICTEV患兒組、正常健康兒童組足部肌肉組織的總RNA,溶于脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP)水。使用美國Invitrogen公司莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄,將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-70℃冰箱冷凍保存、備用。
1.2.3引物設計與合成利用Primer 5.0軟件設計rs3751436、rs199728685、rs139436481位點正反向以及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測FoxO1和內(nèi)參基因β-actin引物。見表1。
表1 引物設計
1.2.4rs3751436、rs199728685和rs139436481位點限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-R FLP)擴增反應總體系25μl,包括10×PCR緩沖液2.5μl,10 mmol dNTP混合液0.5μl,50 mmol MgCl20.8μl,正向引物(5μmol)1μl,反向引物(5μmol)1μl,DNA模板1μl,Platinum Taq DNA聚合酶0.2μl,ddH2O 18μl。PCR反應條件為:94℃預變性5 min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸50 s,共35個循環(huán),72℃繼續(xù)延伸5min。
1.2.5PCR擴增產(chǎn)物限制性酶切采用BstuⅠ限制性內(nèi)切酶對ICTEV患兒、正常健康兒童的rs3751436、rs199728685、rs139436481位點P擴增產(chǎn)物進行消化。在10μl酶切反應體系中,取5μl PCR擴增產(chǎn)物,加入限制性內(nèi)切酶BstuⅠ0.5μl、10×buffer 1μl、去離子水3.5μl。37℃孵育過夜,用3%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物,根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。
1.2.6qR T-PCR檢測FoxO1在維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童肌肉組織中的基因轉(zhuǎn)錄水平按照Invitrogen公司Platinum SYBR Green qPCR Super MIX kit使用說明書加入所需試劑及引物。PCR反應條件:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共35個循環(huán)(注:βactin為內(nèi)參基因)。
1.3統(tǒng)計學方法
采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,應用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析基因型分布頻數(shù)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律,用χ2檢驗法分析FoxO1基因多態(tài)位點基因型、等位基因分布頻率與ICTEV的關聯(lián)性,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139 436481位點分析結(jié)果
ICTEV患兒、正常健康兒童的rs3751436、rs199728685、rs139436481位點擴增產(chǎn)物經(jīng)BstuⅠ限制性內(nèi)切酶消化后,rs3751436位點有A、G 2種等位基因,3種基因型:AA、AG、GG;rs199728685位點有C、T 2種等位基因,2種基因型:CC、TT;rs139436481位點有C、T 2種等位基因,2種基因型:CC、TT。見圖1。
圖1 rs3751436、rs199728685和rs139436481位點PCR-RFLP電泳圖
2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果
rs3751436、rs199728685、rs139436481位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律,研究對象具有遺傳代表性。見表2。
表2 rs3751436、rs199728685和rs139436481位點基因型分布頻率的Hardy-Weinberg平衡檢驗
2.3ICTEV患兒組與正常健康兒童組rs3751436、rs199728685、rs139436481位點基因型、等位基因分布差異
rs3751436、rs199728685、rs139436481位點基因型、等位基因分布頻率在ICTEV患兒組與正常健康兒童組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。
2.4FoxO1在維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄水平
qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,新疆維吾爾族ICTEV患兒足部肌肉組織FoxO1基因與β-actin基因平均密度比值為(0.224±0.015),正常健康兒童足部肌肉組織FoxO1基因與β-actin基因平均密度比值為(0.937±0.026)。ICTEV患兒足部肌肉組織FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平低于正常健康兒童(t=4.201,P=0.017)。見圖2。
表3 ICTEV患兒組與正常健康兒童組中rs3751436、rs199728685和rs139436481位點基因型、等位基因分布差異的比較例(%)
圖2 維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童足部肌肉組織中FoxO1基因的轉(zhuǎn)錄水平
先天性小兒馬蹄內(nèi)翻足是一種較為常見的先天畸形,患兒一出生即在神經(jīng)、肌肉、骨骼及軟骨等方面表現(xiàn)出病理變化,且難以矯正。目前,關于ICTEV的具體病因仍未明確,僅提示遺傳因素、環(huán)境、毒性物質(zhì)、易感基因、骨骼發(fā)育等可能導致ICTEV的發(fā)生[6-7]。相關研究表明,血管斷裂或者血管發(fā)育缺陷,可發(fā)生缺血或血栓導致缺氧,影響肢芽的形成,最后導致馬蹄內(nèi)翻足畸形[8-9]。
FoxO1是FoxO家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員,它既能促進脂肪、血管等細胞的分化,又在細胞凋亡、DNA損傷/修復、血管形成和腫瘤發(fā)生等生物過程中發(fā)揮重要作用[10]。FoxO1作為機體重要的轉(zhuǎn)錄因子,受PI3K/AKT信號通路調(diào)控,使其發(fā)生磷酸化,導致轉(zhuǎn)錄活性下調(diào),從而抑制FoxO1所調(diào)控的下游基因的表達,血管細胞基因譜顯示,F(xiàn)oxO1和FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子通過AKT/HIF通路對血管細胞增殖分化起負向調(diào)節(jié),抑制血管形成[11-12]。此外,F(xiàn)oxO1同樣能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT或PI3K/PKB信號通路中的下游基因[13],譬如:PI3K/AKT下游信號AKT-mTOR-p70s6k(促進肌肉合成)、AKT-FoxOs-Atrogin-MuRF信號通路(抑制肌肉分解)[14-15]。在本研究中,維吾爾族ICTEV患兒的FoxO1基因相較于正常健康兒童下降,實驗中筆者雖然未能發(fā)現(xiàn)FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點與新疆維吾爾族ICTEV存在關聯(lián)性,但結(jié)合以上研究成果,并不能排除其他FoxO1基因多態(tài)位點與ICTEV之間的相關性。
研究中,新疆維吾爾族ICTEC患兒足部肌肉組織中FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于正常健康兒童,F(xiàn)oxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。在FoxO1基因多態(tài)位點基因型、等位基因分布頻率與ICTEV相關性分析中,未能證明rs3751436、rs199728685、rs139436481位點與ICTEV存在相關性,其原因可能為:研究對象樣本量不足,未能檢測出關聯(lián)連鎖信號;FoxO1與ICTEV具有相關性,但rs3751436、rs199728685、rs139436481位點并非關聯(lián)位點,可能存在其他未被發(fā)現(xiàn)的FoxO1基因SNP與ICTEC之間存在聯(lián)系。因此,在不排除FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平的變化而引起ICTEV發(fā)病的基礎上,擴大研究對象樣本量,并探索FoxO1基因其他未知SNP位點,是進一步了解ICTEV致病機制的有效手段。
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(申海菊編輯)
Association betweenFOXO1gene polymorphisms and idiopathic congenital talipes equinovarus of Uighur from Xinjiang*
Aikebaer·Abudurexiti,Guo-jie Cheng,Jing Wang,Lei Wang
(The Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830001,China)
Objective To investigate the association betweenFOXO1gene polymorphisms of rs3751436,rs199728685,rs139436481 and idiopathic congenital talipes equinovarus(ICTEV)of Uighur from Xinjiang. Methods There were 70 Uighur children with ICTEV and 30 normal controls in this study.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detect their genotypes of polymorphism loci rs3751436,rs199728685 and rs139436481.The qRT-PCR was performed to evaluate the mRNA levels ofFOXO1from the ICTEV patients and the normal controls.The Hard-Weinberg equilibrium for genotypic distribution was estimated by the goodness of fit χ2tests.The relationships of genotype frequency and allelic frequency ofFOXO1with ICTEV were analyzed by χ2tests.Results Compared with the normal controls,the ICTEV patients showed down-regulation ofFOXO1gene transcription(P<0.05).The result of goodness of fit χ2tests showed that the genotypic distribution of rs3751436,rs199728685 and rs139436481 of thetwo groups was in Hard-Weinberg equilibrium(P>0.05).There was no significant difference in the distribution of the genotype frequency or allelic frequency between both groups(P>0.05).Conclusions The rs3751436,rs199728685 and rs139436481 gene loci may not be associated with ICTEV of Uighur from Xinjiang,but the correlation betweenFOXO1and ICTEV could not be excluded.
FOXO1;gene polymorphism;idiopathic congenital talipes equinovarus
R 726.8
A
10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.011
1005-8982(2016)17-0054-05
2015-02-05
國家自然科學基金(No:81160215)
程國杰,E-mail:king-2032169@163.com;Tel:18109913261