茶多酚改善代謝綜合征大鼠糖脂代謝的作用機(jī)制研究*

夏燕萍，俞茂華，陳蔚，陳剛

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科，上海200040）

論著

茶多酚改善代謝綜合征大鼠糖脂代謝的作用機(jī)制研究*

夏燕萍，俞茂華，陳蔚，陳剛

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科，上海200040）

目的探討茶多酚對(duì)代謝綜合征（MS）大鼠糖脂代謝的干預(yù)作用及其分子作用機(jī)制。方法高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立MS大鼠模型，經(jīng)茶多酚干預(yù)16周后測(cè)定各組大鼠血脂、血糖、空腹胰島素及游離脂肪酸水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)各組大鼠脂肪組織過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體-γ、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子-α、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B的mR NA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)大鼠脂肪組織上述細(xì)胞因子在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果茶多酚干預(yù)組大鼠血三酰甘油、膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、游離脂肪酸水平均較MS對(duì)照組下降（P<0.05），經(jīng)茶多酚干預(yù)后MS大鼠胰島素抵抗指數(shù)較對(duì)照組下降（P< 0.05）。干預(yù)組脂肪組織過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體-γ、脂聯(lián)素、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B的mR NA及蛋白表達(dá)水平較代謝綜合征對(duì)照組均有上調(diào)（P<0.05），藥物干預(yù)組腫瘤壞死因子-α的mR NA及蛋白表達(dá)水平較MS對(duì)照組下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論茶多酚可以通過(guò)降低游離脂肪酸水平及腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，增加過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體-γ、蛋白激酶B、磷脂酰肌醇3-激酶、脂聯(lián)素的表達(dá)來(lái)改善MS大鼠的糖脂代謝。

茶多酚；胰島素抵抗；代謝綜合征；動(dòng)物模型

由于人們飲食結(jié)構(gòu)以及生活習(xí)慣的改變，代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）及2型糖尿病的患病率日漸上升，心腦、大血管、微血管并發(fā)癥已嚴(yán)重危害到人們的身體健康。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)茶葉的保健功效，尤其是在降脂、降糖方面的作用成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。茶多酚是茶葉提取物中含多酚羥基的一類(lèi)物質(zhì)，本研究以高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立MS大鼠模型[1]，探討茶多酚對(duì)代謝綜合征相關(guān)指標(biāo)的干預(yù)作用及其分子作用機(jī)制，為茶多酚用于臨床治療MS提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

茶多酚純度為98%，采用溶劑萃取法提取，由上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)院魏新林教授惠贈(zèng)。30只健康雄性SD大鼠（8周齡），購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2儀器及試劑

DNA純化試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，Trizol為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，探針由上海捷蘭生物技術(shù)有限公司合成（采用Primer Express軟件設(shè)計(jì)）。胰島素放免試劑盒為天津中外DPC合資公司產(chǎn)品，顯微攝像機(jī)（Nikon UFX-Ⅱ型）由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理教研室提供，電動(dòng)勻漿器為美國(guó)Backman公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)（Unico UV-2000）為上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品，臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16B）購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠，基因擴(kuò)增儀TC-96/T/H（a）購(gòu)于杭州大和熱磁電子有限公司，凝膠成像系統(tǒng)GIS-2008購(gòu)于上海天能科技有限公司。

1.3大鼠代謝綜合征模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組：A組為茶多酚干預(yù)組（10只），高糖、高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，予茶多酚800mg/（kg·d）溶于生理鹽水灌胃；B組為MS對(duì)照組（10只），持續(xù)給予高糖高脂飲食；C組為正常對(duì)照組（10只），與A、B組在相同環(huán)境下予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。藥物干預(yù)時(shí)間共計(jì)16周。

1.4各指標(biāo)檢測(cè)

每隔2周測(cè)量體重、身長(zhǎng)、尾動(dòng)脈收縮壓、空腹血糖，16周后處死大鼠，取血檢測(cè)空腹胰島素、血脂[膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白（high density lipidcholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）]及游離脂肪酸水平，同時(shí)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model as sessment of insulin resistance，HOMA-IR），HOMAIR=空腹血糖（mmol/l）×空腹胰島素（μU/ml）/22.5。其中血清胰島素水平測(cè)定采用放射免疫法，血清游離脂肪酸水平測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法，血脂測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)酶法。

1.5RT-PCR法檢測(cè)大鼠白色脂肪組織（腹腔大網(wǎng)膜脂肪組織）PPAR-γ、脂聯(lián)素、TNF-α、PI3K、蛋白激酶B的表達(dá)

藥物干預(yù)16周后處死大鼠，取腹腔脂肪組織保存于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）冷凍管，置入液氮罐待用。抽提各組大鼠脂肪組織的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，取2μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，結(jié)束后各管置冰上冷卻，取2μl cDNA用以做PCR擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作內(nèi)參照，分別檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體-γ（peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ）、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的mRNA表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1　各檢測(cè)基因的引物序列

1.6Western blot法檢測(cè)大鼠脂肪組織PPAR-γ、脂聯(lián)素、TNF-α、PI3K、PKB在蛋白水平的表達(dá)

在檢測(cè)樣品中加入磷酸緩沖鹽溶液沖洗裂解，然后測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過(guò)夜，再分別加入一抗、二抗孵育后洗膜，顯影后應(yīng)用凝膠成像分析儀測(cè)定蛋白條帶灰度，并計(jì)算各蛋白條帶和內(nèi)參照比值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行正態(tài)性檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1茶多酚干預(yù)后大鼠空腹血糖、體重、身長(zhǎng)、尾動(dòng)脈收縮壓、膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、空腹胰島素及游離脂肪酸水平

經(jīng)茶多酚干預(yù)后，MS大鼠體重增加有延緩趨勢(shì)，自第12周起與MS對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028），茶多酚干預(yù)后的MS大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的升高趨勢(shì)有所減緩，自第16周起差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。而各組大鼠的身長(zhǎng)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.158）。第14周起茶多酚干預(yù)組空腹血糖水平較MS未干預(yù)組下降，茶多酚干預(yù)組游離脂肪酸水平、血三酰甘油、膽固醇、LDL-C、空腹血糖水平較MS對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017、0.021、0.029、0.041和0.030）。見(jiàn)表2、3。

表2　不同時(shí)間各組大鼠體重、身長(zhǎng)、血糖、尾動(dòng)脈收縮壓及空腹血糖變化（±s）

表2　不同時(shí)間各組大鼠體重、身長(zhǎng)、血糖、尾動(dòng)脈收縮壓及空腹血糖變化（±s）

注：1）與A、C組比較，P12周體重=0.028和0.018，P14周體重=0.015和0.015，P16周體重=0.012和0.010，P16周尾動(dòng)脈壓=0.026和0.027,P14周空腹血糖= 0.041和0.027，P16周空腹血糖=0.030和0.010；2）與C組比較，P=0.040

時(shí)間體重/g身長(zhǎng)/cm尾動(dòng)脈收縮壓/mmHg空腹血糖/（mmol/L）A B ABABABC C C C 0周201±15201±16205±1519.0±1.1 19.0±1.1 19.4±1.096±698±4100±55.0±0.25.2±0.35.0±0.2 2周220±18220±20224±2119.5±1.3 19.5±1.2 19.6±1.196±795±596±45.0±0.34.9±0.35.1±0.3 4周238±20245±21236±2319.9±1.3 19.8±1.3 20.0±1.097±697±698±75.1±0.35.3±0.45.3±0.3 6周255±26268±30249±2620.0±1.1 20.2±1.3 20.5±1.397±899±596±45.2±0.25.4±0.35.3±0.4 8周270±25299±31268±2320.5±1.4 20.5±1.4 20.5±1.298±8100±795±65.1±0.45.3±0.55.1±0.3 10周310±33338±29301±3121.0±1.4 20.7±1.5 20.5±1.498±699±896±55.2±0.55.4±0.55.0±0.4 12周330±35362±301）326±2822.0±1.3 21.5±1.6 21.3±1.397±7101±998±65.2±0.6 5.6±0.52）5.2±0.3 14周355±38418±351）351±2622.5±1.5 22.0±1.6 22.0±1.598±8105±897±55.3±0.5 5.8±0.61）5.1±0.4 16周399±40451±361）382±2523.2±1.7.0 22.5±1.7 22.5±1.699±7109±71）99±55.3±0.4 6.2±0.71）5.0±0.3

表3　各組大鼠血脂、胰島素及游離脂肪酸水平變化（±s）

表3　各組大鼠血脂、胰島素及游離脂肪酸水平變化（±s）

注：1）與A、C組比較，P三酰甘油=0.021和0.002，P膽固醇=0.029和0.001，PLDL=0.041和0.028，P空腹胰島素=0.018和0.001，P游離脂肪酸=0.017和0.001；2）與C組比較，PHDL-C=0.035

組別血脂/（mmol/L）空腹胰島素/（μU/ml）游離脂肪酸/（μmol/L）三酰甘油膽固醇HDL-CLDL A 2.32±1.214.58±2.640.81±0.351.34±0.4819.8±11.6178.4±35.6 B 3.98±1.691）6.98±2.881）0.79±0.252）1.98±0.561）32.5±13.91）259.5±56.91）C 0.99±0.411.56±0.640.96±0.341.19±0.319.68±2.11126.9±26.71

2.2各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)比較

以HOMA-IR作為衡量大鼠胰島素抵抗水平的指標(biāo)，茶多酚干預(yù)組的HOMA-IR為（4.66±0.39），MS對(duì)照組為（8.96±0.88），正常對(duì)照組為（2.15± 0.33），經(jīng)茶多酚干預(yù)后MS大鼠的胰島素抵抗水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3各組大鼠脂肪組織相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示，經(jīng)茶多酚干預(yù)16周后大鼠脂肪組織PPAR-γ[（0.419±0.021）vs（0.202±0.015），P=0.009]、脂聯(lián)素[（0.141±0.008）vs（0.118±0.005），P=0.040]、PI3K[（0.628±0.024）vs（0.548±0.015），P=0.037]、PKB[（0.724±0.020）vs（0.613±0.015），P=0.032]的mRNA表達(dá)與MS對(duì)照組比較均有上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茶多酚干預(yù)組TNF-α的mRNA表達(dá)與MS對(duì)照組比較[（0.518±0.016）vs（0.721±0.013），P=0.028]均有下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1、2。

圖1　各組大鼠脂肪組織細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)（RT-PCR）

圖2　各組大鼠脂肪組織相關(guān)細(xì)胞因子與內(nèi)參照泳道面積比值比較（RT-PCR法）

圖3　各組大鼠脂肪組織細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)（Western blot法）

2.4各組大鼠脂肪組織相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，茶多酚干預(yù)后大鼠脂肪組織PPAR-γ[（0.529±0.018）vs（0.192±0.015），P=0.006]、脂聯(lián)素[（0.619±0.021）vs（0.222±0.013），P=0.003]、PI3K [（1.119±0.031）vs（0.8202±0.025），P=0.027]、PKB [（0.568±0.008）vs（0.452±0.010），P=0.042]在蛋白水平的表達(dá)較MS對(duì)照組均有增加，茶多酚干預(yù)組TNF-α的蛋白表達(dá)與MS對(duì)照組比較有減少[（0.489±0.009）vs（0.582±0.011），P=0.030]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3、4。

圖4　大鼠脂肪組織相關(guān)細(xì)胞因子與內(nèi)參照泳道面積比值比較（Western blot法）

3 討論

MS的發(fā)病并不是由某一因素單獨(dú)構(gòu)成病因，而是眾多因素相互影響、相互作用的結(jié)果，但胰島素抵抗是目前公認(rèn)的MS的致病因素，MS的病理生理基礎(chǔ)是起源于胰島素抵抗的發(fā)生并進(jìn)一步導(dǎo)致相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)[2]。目前關(guān)于MS的治療策略從西醫(yī)角度多是針對(duì)MS單個(gè)組份（高血糖、高血壓、高血脂等）的處理，雖然在大多數(shù)情況可以使患者的血糖、血壓、血脂紊亂得以改善，但是這樣的治療策略常常存在“頭痛醫(yī)頭、腳痛醫(yī)腳”的弊端，并不能針對(duì)MS病理生理機(jī)制從根源上進(jìn)行治療。如果能找到一種針對(duì)MS發(fā)病機(jī)制、全面改善胰島素抵抗、同時(shí)降糖降脂降壓的綜合性治療藥物是MS研究的熱點(diǎn)。

茶多酚是從茶葉中提取的一類(lèi)含多酚羥基的物質(zhì)，約占茶葉干重的30%，其主要成分為兒茶素類(lèi)化合物，占65%～80%。茶多酚具有抗炎、抗氧化、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗凝血以及促進(jìn)纖溶等多方面的藥理作用[3-4]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)茶多酚在降脂降糖治療MS方面也具有調(diào)節(jié)作用[5-8]。本研究通過(guò)高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立MS大鼠模型，給予茶多酚干預(yù)后大鼠體重增加有延緩趨勢(shì)，茶多酚干預(yù)組尾動(dòng)脈收縮壓、空腹血糖水平均有明顯好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，血三酰甘油、膽固醇、LDL-C、胰島素水平及游離脂肪酸水平、HOMA-IR均較MS對(duì)照組下降，這與BOSE、NAGAO、SHIMADA等的研究結(jié)果相一致[9-12]。

關(guān)于茶多酚降糖作用的機(jī)制，目前報(bào)道較多的是它可以改善胰島素抵抗、抑制碳水化合物的吸收、減少糖異生、增加胰島素分泌及敏感性、加速骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用等機(jī)制[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚干預(yù)后大鼠游離脂肪酸水平下降。而在MS患者中，常常存在高游離脂肪酸血癥，高濃度的游離脂肪酸可以干擾糖、脂代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)，并且在干擾胰島素受體后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，是加重胰島素抵抗的主要物質(zhì)。因此茶多酚可能通過(guò)降低游離脂肪酸水平、改善MS大鼠胰島素抵抗來(lái)發(fā)揮其降糖降脂的作用。

本研究進(jìn)一步探索茶多酚改善糖脂代謝的分子生物機(jī)制，發(fā)現(xiàn)茶多酚干預(yù)后大鼠脂肪組織PPAR-γ、PI3K、PKB、脂聯(lián)素的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。PPARγ作為調(diào)控脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)以及胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的主要參與者，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，它在脂肪細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝紊亂、增強(qiáng)胰島素敏感性、抗炎和抗腫瘤等方面有著積極的作用[16-18]。而TNF-α、PI3K、PKB均是PPAR-γ的下游基因。本課題組前期研究已證實(shí)，茶多酚可以顯著上調(diào)MS大鼠脂肪組織PPAR-γ的表達(dá)[19]，而文獻(xiàn)報(bào)道PPAR-γ激動(dòng)劑能夠通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞表達(dá)TNF-α，并進(jìn)一步增加c-CBL相關(guān)蛋白及胰島素受體底物-2的表達(dá)，從而增強(qiáng)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20-21]。因此茶多酚可能通過(guò)上調(diào)PPARγ從而抑制TNF-α的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其作用。此外，PI3K/PKB信號(hào)通路的作用也與PPARγ密切相關(guān)。有研究顯示，PPAR-γ可以促進(jìn)PI3K的基因表達(dá)，而PI3K是葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4所必需的信號(hào)分子。PI3K被激活后在細(xì)胞膜上生成磷脂酰肌醇3磷酸（phos phatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3），PIP3又作為第2信使激活其下游的PKB，從而促進(jìn)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕胰島素抵抗[22]。因此筆者推測(cè)茶多酚在上調(diào)MS大鼠PPARγ的表達(dá)后，進(jìn)一步促進(jìn)PI3K基因的表達(dá)，并通過(guò)激活其下游PKB的表達(dá)發(fā)揮減輕胰島素抵抗的作用。

脂聯(lián)素作為脂肪細(xì)胞的特異性蛋白，在白色脂肪組織呈高度表達(dá)，與機(jī)體胰島素的敏感性密切相關(guān)，已有研究證實(shí)在發(fā)生胰島素抵抗的情況下血漿脂聯(lián)素水平明顯降低，低脂聯(lián)素血癥可以作為一種預(yù)測(cè)指標(biāo)提示糖尿病大血管病變的發(fā)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚干預(yù)后大鼠脂肪組織的脂聯(lián)素表達(dá)明顯上調(diào)，這可能也是茶多酚改善胰島素抵抗的另一作用機(jī)制。

綜上所述，茶多酚具有改善MS大鼠的糖脂代謝，減輕胰島素抵抗的作用，而該作用可能是通過(guò)降低游離脂肪酸水平，增加MS大鼠PPAR-γ的表達(dá)，并進(jìn)一步影響其下游PKB、腫瘤壞死因子-α、磷脂酰肌醇3-激酶的表達(dá)以及上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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（申海菊編輯）

Effect of tea polyphenols on improving insulin resistance of rats with metabolic syndrome*

Yan-ping Xia，Mao-hua Yu，Wei Chen，Gang Chen
（Department of Geratology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China）

Objective To observe the effect of tea polyphenols on rats with metabolic syndrome（MS）and its molecular mechanism.Methods A rat model of metabolic syndrome was induced by high-glucose and high-fat diet.After intervention of tea polyphenols for 16 weeks the levels of blood glucose，blood fat，fasting insulin and free fatty acid were detected，and the index of insulin resistance（HOMA-IR）was calculated.The mRNA expressions of peroxisome proliferators activiated receptor-γ（PPAR-γ），adiponectin，TNF-α，phosphatidylinositol-3 kinase（PI3K）and protein kinase B in adipose tissue were detected by RT-PCR；and their protein expressions were detected by Western blot.Results The levels of fasting blood glucose，triglyceride，cholesterol，LDL，free fatty acid and HOMR-IR in the tea polyphenol group were significantly lower than those in the control group（P＜0.05）.Compared with the control group，the mRNA and protein expressions of PPAR-γ，adiponectin，PI3K and protein kinase B in the adipose tissue of the tea polyphenol group were upregulated（P＜0.05）.The mRNA and protein expressions of TNF-α in the tea polyphenol group were significantly lower than those in the control group（P＜0.05）.Conclusions Tea polyphenols can improve glucolipid metabolism in MS rats through decreasing the levels of free fatty acid and TNF-α while increasing the expressions of PPARγ，protein kinase B，PI3K and adiponectin.

tea polyphenol；insulin resistance；metabolic syndrome；rat model

R 589

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.001

1005-8982（2016）17-0001-06

2015-09-30

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金項(xiàng)目（No：20134459）