仿生提取—電感耦合等離子體—質(zhì)譜法測定柏子養(yǎng)心片中可溶性重金屬

蔣秋桃 曾麗 馬杰 彭玲娜 李文莉??丁野 李潔

摘要 國家食品藥品監(jiān)督管理總局的2014年國家藥品抽驗計劃將柏子養(yǎng)心片定為抽驗品種，本實驗利用人工胃液仿生提取樣品可溶性重金屬，通過微波消解技術(shù)對提取液進(jìn)行消解處理，建立了仿生提取ICPMS法測定18批柏子養(yǎng)心片中Co， Cr， Cu， Ba， Cd， Mn， Ni， Pb， Hg， Sr， Zn 11種可溶性重金屬的含量的分析方法。本方法各元素標(biāo)準(zhǔn)系列線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9989～1.0000，檢出限為0.19～5.6 μg/L，方法的重復(fù)性RSD值均小于6.2%，精密度的RSD值均小于5.6%，加標(biāo)回收率在87.7%～101.9%之間，滿足檢測要求。參照《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)，18批樣品中Pb， Cd， Cu均未超過標(biāo)準(zhǔn)，Hg含量平均值為7.68 mg/kg，超過標(biāo)準(zhǔn)值。仿生提取ICPMS法的建立為柏子養(yǎng)心片的安全性研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 柏子養(yǎng)心片； 朱砂； 仿生提?。?電感耦合等離子體質(zhì)譜法

1引言

中藥作為中華民族傳統(tǒng)文化的瑰寶，是我國具有國際競爭優(yōu)勢的產(chǎn)業(yè)之一 [1 ]。重金屬問題已成為影響中藥出口和阻礙中醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的主要問題，因此準(zhǔn)確檢測和限定重金屬的量是保障人民用藥安全，促進(jìn)中藥走向國際化的關(guān)鍵 [2～5 ]。中藥中重金屬主要來自于藥材的生長環(huán)境，如土壤、大氣、水、化肥等；或與藥材本身特性相關(guān)，如對重金屬的自主吸收和富集功能。此外，儲存環(huán)境、加工炮制等因素也可能導(dǎo)致中藥的重金屬污染。

國家食品藥品監(jiān)督管理總局的2014年國家藥品抽驗計劃將柏子養(yǎng)心片定為抽驗品種。柏子養(yǎng)心片是《中國藥典》2010版收載的品種，由柏子仁、朱砂、川芎等13 味中藥材配伍而成 [6 ]，產(chǎn)品劑型有薄膜衣片和糖衣片兩種。對于柏子養(yǎng)心片中的朱砂毒理藥理尚未明確，朱砂的主成分為硫化汞（HgS），按國家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每片柏子養(yǎng)心片含朱砂以HgS計，應(yīng)為30.0～38.0 mg。HgS為難溶物質(zhì)，簡單地以總汞量來評價顯然不能準(zhǔn)確反映其中重金屬含量。基于此，本實驗重點考察分析柏子養(yǎng)心片中可溶性汞，同時也對柏子養(yǎng)心片中其它可溶性重金屬進(jìn)行分析。利用人工胃液模擬柏子養(yǎng)心片在人體內(nèi)的吸收情況，提取藥物利用過程中的可溶性重金屬進(jìn)行評價，即：采用胃液模擬仿生提取法提取，利用微波消解法對提取液進(jìn)行消解，再通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS法）檢測柏子養(yǎng)心片中可溶性重金屬含量 [7～9 ]。ICPMS法近年來在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境、化學(xué)和食品科學(xué)等分析領(lǐng)域的微量、痕量元素測定中被廣泛應(yīng)用 [10～17 ]。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

7700 ICPMS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技公司），KS 4000i 恒溫培養(yǎng)搖床（德國IKA公司），AE200 電子分析天平（德國梅特勒托利多公司），MARS 6 CLASSIC 微波消解儀（美國培安科技公司），X3離心機（美國熱電公司），MilliQ超純水儀（美國Millipore公司）。

HCl（優(yōu)級純），HNO3（MOS級），實驗用水均為MilliQ超純水（18.2 MΩ·cm）。ICPMS儀使用的5% HNO3及清洗用的水均來自安捷倫科技公司。

10 mg/L混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（Ag， Al， As， Ba， Be， Ca， Cd， Co， Cr， Cs， Cu， Fe， Ga， K， Li， Mg， Mn， Na， Ni， Pb， Rb， Se， Sr， Tl， U， V和Zn，lot No.884YPY2）、10 mg/L汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（安捷倫科技公司）、100 mg/L內(nèi)標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（Bi， Ge， In， 6Li， Lu， Rh， Se， Tb）和1.0 μg/L質(zhì)譜調(diào)諧液（Ce， Co， Li， Mg， Tl， Y）均購自安捷倫科技公司。胃蛋白酶（酶活力1∶3000上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）。人工胃液：按照《中國藥典》2010 版二部附錄85要求配制人工胃液。即：取稀HCl 16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1000 mL，即得。

取混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液和汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2% HNO3逐級稀釋成各種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為：0， 5.0， 10， 25， 50， 100和200 μg/L，搖勻，待測。

采集柏子養(yǎng)心片糖衣片18批，分別編號1～18，樣品覆蓋吉林等9個省（區(qū)、市），柏子養(yǎng)心片糖衣片的現(xiàn)行質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》2010版一部。

2.2儀器工作條件

ICPMS儀器優(yōu)化條件為： 冷卻氣流量， 15 L/min； 輔助氣流量， 0.8 L/min； 載氣流量， 0.8 L/min； 補償氣流量， 0.8 L/min； 功率， 1250 W； 數(shù)據(jù)采集模式， 跳峰； 掃描次數(shù)， 3次。

2.3實驗步驟

采用模擬人體消化藥物的參數(shù)條件。即：取柏子養(yǎng)心片0.3 g左右，準(zhǔn)確稱定，放入50 mL離心管中，加50 mL人工胃液，在恒溫振蕩器中（37℃，250 r/min）振蕩，4 h后，5000 r/min離心分離5 min。取上清液，過0.45 μm 水溶性濾膜。取4 mL過濾后的胃液，置聚四氟乙烯消解罐中，加入3 mL HNO3消解液，按表1所示程序進(jìn)行微波消解，消解完畢后，設(shè)置趕酸儀的溫度為120℃，趕酸2～3 h，至溶液體積剩余2～3 mL。用超純水定容至20 mL， 待測。同時制備空白樣品。按照ICPMS儀器優(yōu)化條件進(jìn)

3結(jié)果與討論

3.1提取液的處理方法考察

取3批柏子養(yǎng)心片進(jìn)行胃液仿生提取4 h，平行3組。提取液離心分離后取上清液。經(jīng)0.45 μm水溶性濾膜過濾，直接用ICPMS檢測，會出現(xiàn)等離子猝滅現(xiàn)象。為避免猝滅現(xiàn)象發(fā)生，實驗采用微波消解技術(shù)對胃液模擬后的提取液進(jìn)行消解處理。對胃液模擬提取液采用直接微波消解及添加適量HNO3的提取液消解兩種模式。從消解后的澄清度表觀分析，添加HNO3的消解液透明程度明顯優(yōu)于未添加HNO3的消解液。

3.2方法學(xué)考察

考察了加入2， 3和4 mL HNO3的影響。加入2 mL HNO3，組重金屬含量波動較大；加入3或4 mL，HNO3組重金屬含量基本無變化，本實驗選擇加入3 mL HNO3處理胃液提取液。采用表1所示的微波消解程序進(jìn)行消解。

考慮該儀器ICPMS的記憶效應(yīng)，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度并未高于200 μg /L，因而將線性考察范圍確定為檢出限值～200 μg/L之間。依次將已經(jīng)配制好的各個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以每個濃度測得的3次讀數(shù)的平均值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其相關(guān)系數(shù)及線性范圍，各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式及相關(guān)系數(shù)等見表2。

利用仿生提取法制備11個空白試劑，按與樣品測定完全相同的實驗條件同時測定，計算11次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，取其結(jié)果的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對應(yīng)的濃度值為每種元素的檢出限，檢出限結(jié)果見表2。

取編號為“4”的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，所得各金屬元素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別見表2。準(zhǔn)確稱取樣品0.4 g，按照樣品處理的方法平行制備6份樣品，按上述儀器條件進(jìn)行測定，計算6次測定的各金屬的平均含量和RSD分別見表2。

稱取樣品0.2 g，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照仿生提取法對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，平行測定6次。結(jié)果見表2。

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，共有28種元素進(jìn)行方法學(xué)考察，有11種元素通過方法學(xué)考察，結(jié)果見表2。

從表2可知，線性相關(guān)系數(shù)為0.9989～1.0000，檢出限在0.19～8.8 μg/L之間，滿足檢測要求。本方法重復(fù)性RSD值均小于6.2%，精密度的RSD值均小于5.6%，加標(biāo)回收率在87.7%～101.9%之間。結(jié)果表明，本方法能夠滿足柏子養(yǎng)心片中11種元素檢測的要求。

3.3樣品分析

根據(jù)實驗優(yōu)化條件下的仿生提取微波消解技術(shù)對柏子養(yǎng)心片進(jìn)行前處理，利用ICPMS儀器優(yōu)化工作條件對樣品進(jìn)行測定，柏子養(yǎng)心片中通過方法學(xué)考察的11種元素檢測結(jié)果見表3。

參照中華人民共和國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》 [18 ]規(guī)定重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)：Pb≤5.0 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg，Cu≤20.0 mg/kg，Hg≤ 0.2 mg/kg。根據(jù)表3結(jié)果，經(jīng)過4 h的胃液模擬仿生提取，18個樣品的胃液模擬后的結(jié)果顯示，Pb， Cd， Cu含量均低于限量標(biāo)準(zhǔn)。Hg含量均高于標(biāo)準(zhǔn)限量值，18批樣品的平均值為7.68 mg/kg，其中17號樣品含量最高達(dá)22.5 mg/kg?？扇苄怨砍瑯?biāo)。柏子養(yǎng)心片為含礦物朱砂的中成藥，盡管朱砂在中成藥的藥理作用機制不明確，眾所周知，高濃度汞含量對人類具有一定的毒性。因此，含朱砂中成藥應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范。研究表明，汞的毒性還與其形態(tài)密切相關(guān) [19～21 ]。 所以，對柏子養(yǎng)心片中可溶性重金屬含量分析有助于其質(zhì)量分析研究。

4結(jié) 論

通過建立的仿生提取微波消解ICPM法對柏子養(yǎng)心片中主要可溶性重金屬進(jìn)行檢測，利用人工胃液模擬柏子養(yǎng)心片在人體內(nèi)的消化分解，通過仿生提取的可溶性重金屬檢測更能在一定程度上反應(yīng)柏子養(yǎng)心片中重金屬真實作用情況的含量大小。

應(yīng)對柏子養(yǎng)心片中汞的形態(tài)進(jìn)一步進(jìn)行分析和確定，合理科學(xué)地評價柏子養(yǎng)心片中汞的毒性和藥效作用。對抽檢柏子養(yǎng)心片的可溶性重金屬含量檢測，在一定程度上反饋抽檢廠家的柏子養(yǎng)心片的整體水平，并為柏子養(yǎng)心片的炮制加工等工藝提供技術(shù)參考，為該藥品的質(zhì)量監(jiān)控提供數(shù)據(jù)參考。

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