復(fù)合免疫親和柱凈化—液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇類真菌毒素殘留量

孫雪 郗存顯 唐柏彬 王國(guó)民 陳冬東 趙華

摘要 建立了動(dòng)物源食品（豬肉、魚(yú)肉、豬肝）中6種黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2）和6種玉米赤霉醇類真菌毒素 （α玉米赤霉醇、β玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮）殘留量的復(fù)合免疫親和柱凈化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）檢測(cè)方法。樣品經(jīng)β葡萄糖苷酸/硫酸酯復(fù)合酶酶解后， 用甲醇乙腈（20∶80， V/V）提取，提取液經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾，濾液用PBS溶液稀釋，復(fù)合免疫親和柱富集和凈化后，采用HPLCMS/MS法分析。12種目標(biāo)分析物中AFB2和AFG2的線性范圍為0.03～6.0 μg/L，其余目標(biāo)分析物的線性范圍為0.05～20 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限在0.01～0.03 μg/kg范圍內(nèi)，定量限在0.04～0.09 μg/kg范圍內(nèi)。分別以0.5， 1.0 和5.0 μg/kg添加濃度水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，平均回收率為73.6%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%～11.2%。本方法簡(jiǎn)便、靈敏，能夠滿足動(dòng)物源食品中痕量黃曲霉毒素和玉米赤霉醇類真菌毒素殘留的測(cè)定要求。

關(guān)鍵詞 動(dòng)物源食品； 復(fù)合免疫親和柱； 黃曲霉毒素； 玉米赤霉醇類真菌毒素； 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

真菌毒素來(lái)源于各種霉菌的次生代謝產(chǎn)物，包含多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)。常見(jiàn)的真菌毒素包括T2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素、嘔吐毒素等。玉米赤霉烯酮（ZON）是由鐮刀霉菌產(chǎn)生的一種雷索酸內(nèi)酯類真菌毒素，在腸道和肝臟經(jīng)3α和3β羥基類固醇脫氫酶（HSDs）羥基化，生成α玉米赤霉烯醇（αZOL）、β玉米赤霉烯醇（βZOL），之后進(jìn)一步還原生成α玉米赤霉醇（αZAL）、β玉米赤霉醇（βZAL）和玉米赤霉酮（ZAN） [1，2 ]，這幾種物質(zhì)與ZON合稱為玉米赤霉醇類真菌毒素（Zeranol， ZER）。黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是由曲霉菌代謝產(chǎn)生的一組致毒基團(tuán)相同、化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素，常見(jiàn)的有黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）等，其中AFB1和AFB2可在機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)生黃曲霉毒素M1（AFM1）以及黃曲霉毒素M2（AFM2） [3 ]。

ZER及其代謝產(chǎn)物具有雌激素類物質(zhì)的生物活性，能與雌激素受體相互作用， 產(chǎn)生一系列的毒副作用，包括生殖毒性 [4，5 ]、遺傳毒性 [6 ]、基因毒性 [7 ]、免疫毒性 [8 ]等，還可影響機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，影響激素調(diào)節(jié)水平 [9，10 ]。AFs對(duì)人和動(dòng)物的健康具有嚴(yán)重的威脅，其毒性包括DNA損傷和基因突變 [11 ]、致癌性 [12 ]、免疫毒性 [13 ]、生殖和生長(zhǎng)毒性 [14 ]等，其中AFB1毒性比砒霜大68倍，致癌性是3，4苯并芘的4000倍 [15 ]，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為一類致癌物質(zhì)。農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告明確規(guī)定玉米赤霉醇在動(dòng)物性食品中不得檢出 [16 ]；食品中黃曲霉毒素多以AFB1和AFM1的形式檢出，我國(guó)食品中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5～20.0 μg/kg，AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg [17 ]。

動(dòng)物被喂食真菌毒素污染的谷物及飼料后，組織（如牛羊肉、動(dòng)物肝臟等）中可能會(huì)殘留真菌毒素，等通過(guò)食物鏈傳給食用者，對(duì)其健康構(gòu)成潛在危害。因此建立高靈敏度、特異性、簡(jiǎn)便、快速的毒素殘留分析方法非常必要。目前，有關(guān)ZER和AFs的測(cè)定方法有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA） [18～20 ]、高效液相色譜法（HPLC） [21～23 ]、液相色譜質(zhì)譜法（LCMS/MS） [24～26 ]等。ELISA具有較好的特異性及敏感性，且操作簡(jiǎn)便、快速，但容易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；HPLC雖無(wú)GCMS的化學(xué)衍生化過(guò)程，但其靈敏度低、定性準(zhǔn)確度不高；而HPLCMS/MS可對(duì)多組分同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，且具有專屬性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)了前述方法的不足，使得該技術(shù)在分析檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。

與傳統(tǒng)的液液萃取和固相萃取相比，免疫親和柱具有特異性好、凈化能力好、富集能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中建立了免疫親和柱測(cè)定動(dòng)物源食品中磺胺類藥物 [27 ]、玉米赤霉醇類真菌毒素 [21 ]殘留量的檢測(cè)方法，但由于動(dòng)物源食品中常多種殘留獸藥，采用單一的免疫親和柱一次僅能測(cè)定其中的某種或者某類藥物的含量。為了滿足動(dòng)物源食品中不同種類獸藥殘留的同時(shí)測(cè)定要求，本研究組進(jìn)行了復(fù)合免疫親和柱在食品分析中的應(yīng)用研究 [28 ]。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了復(fù)合免疫親和柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇類真菌毒素殘留量的方法，考察了復(fù)合免疫親和柱的性能，優(yōu)化了樣品前處理方法。本方法的提取效率高，重現(xiàn)性好。相比本實(shí)驗(yàn)室前期建立的玉米赤霉醇類真菌毒素殘留的檢測(cè)方法，本研究采用復(fù)合免疫親和柱，可同時(shí)對(duì)ZER和AFs兩類物質(zhì)富集凈化；樣品采用混合溶劑一步提取，更加簡(jiǎn)便、快速，檢出限和定量限更低，方法更加靈敏。本方法為動(dòng)物源食品中ZER和AFs的同時(shí)檢測(cè)提供了重要參考。

3結(jié)果和討論

3.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.1.1待凈化溶液中有機(jī)相的含量考察了待凈化溶液中有機(jī)相含量對(duì)IACAZ柱富集效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)有機(jī)相含量≤20%時(shí)，ZER和AFs的回收率無(wú)明顯差別；當(dāng)有機(jī)相含量>20%時(shí)，隨著有機(jī)相含量的增加，ZER和AFs的回收率明顯下降。因此，待凈化上載溶液中有機(jī)相的含量控制在20%以內(nèi)。

3.1.2柱洗脫劑的選擇

取0.5 mL 1 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS稀釋至10 mL，上柱、淋洗后，分別用6 mL的甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液進(jìn)行分析。結(jié)果表明，5 mL水和5 mL PBS淋洗柱子， 能夠洗脫雜質(zhì)且無(wú)目標(biāo)分析物洗脫，當(dāng)使用乙腈作為洗脫劑時(shí)，各目標(biāo)待測(cè)物的洗脫率大于90%，故本實(shí)驗(yàn)最終選定乙腈作為柱洗脫劑。隨著乙腈的用量增加，目標(biāo)物的回收率隨之提高，當(dāng)乙腈體積大于3 mL 時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定。因此，本方法采用3 mL乙腈作為柱洗脫液。

3.1.3提取溶劑的選擇玉米赤霉醇及其類似物為脂溶性物質(zhì)，不溶于純水，溶于堿性水溶液和大多數(shù)有機(jī)溶劑，文獻(xiàn)報(bào)道的常用提取溶劑有乙醚、乙腈、叔丁基甲醚等 [21，29 ]。黃曲霉毒素類真菌毒素難溶于水，易溶于油及甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，文獻(xiàn)報(bào)道的常用提取溶劑為甲醇水或者乙腈水的混合溶劑 [30，31 ]，本實(shí)驗(yàn)在樣品中添加5 μg/kg 目標(biāo)物，比較了甲醇、乙腈、甲醇水、乙腈水、甲醇乙腈的提取效率（圖1）。結(jié)果表明，單一溶劑的提取效率都不理想，甲醇乙腈（20∶80， V/V）的提取效果較好，12種目標(biāo)待測(cè)物的提取回收率均大于90%。

圖1不同溶劑對(duì)基質(zhì)中ZER 和AFs 的提取回收率

Fig.1Extraction recoveries of ZER and AFs in matrices with different solvents

3.2基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

本研究采用空白基質(zhì)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制相同濃度的基質(zhì)效應(yīng)曲線，基質(zhì)效應(yīng)ME（%）如下式[32]。

ME（%）=（K1/K2-1）×100%

其中K1和K2分別為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液所作曲線的斜率和無(wú)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液所作曲線的斜率。對(duì)12種真菌毒素進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：豬肉中各分析物的基質(zhì)效應(yīng)值在

Symbolm@@ 4%～2%之間，魚(yú)肉中各分析物的基質(zhì)效應(yīng)值在

Symbolm@@ 12%～7%之間，肝臟中各分析物的基質(zhì)效應(yīng)在

Symbolm@@ 1%～13%之間，均在±15%以內(nèi)，表明樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后沒(méi)有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，可以用無(wú)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。

3.3方法驗(yàn)證

3.3.1線性方程、檢出限及定量限分別配制6種玉米赤霉醇類真菌毒素（0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L）和6種黃曲霉毒素類真菌毒素（AFB1， AFG1， AFM1和AFM2為0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L；AFB2和AFG2為0.03，0.15，0.3，1.5，3.0和6.0 μg/L）系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最優(yōu)條件下測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（μg/L） 為橫坐標(biāo)（x），得到線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明各真菌毒素在其線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（見(jiàn)表3）。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測(cè)定，以定量離子信噪比（S/N≥3）計(jì)算方法的檢出限為0.01～0.03 μg/kg；以信噪比（S/N≥10） 計(jì)算方法的定量限為0.04～0.09 μg/kg。

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