直接進(jìn)樣—液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水中的5種苯胺類化合物

周琛 駱春迎 余輝菊 鄒海民 謝沛寧 陳曉雨 李永新

摘要 建立了直接進(jìn)樣測定生活飲用水及其水源水中5種苯胺類化合物（苯胺、3硝基苯胺、4硝基苯胺、2，6二氯4硝基苯胺和六硝基二苯胺）的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。水樣經(jīng)0.22 μm聚醚砜濾膜過濾后直接進(jìn)樣，目標(biāo)化合物在HSS T3色譜柱上經(jīng)梯度洗脫，于4 min完成分離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。5種苯胺類化合物在各自線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R≥0.995。方法的檢出限為0.773～1.88 μg/L（S/N=3），定量限為2.58～6.27 μg/L（S/N=10）；峰面積的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.8%～1.9%和3.3%～4.9%；樣品加標(biāo)回收率為84.1%～105.0%，加標(biāo)樣品的RSD為1.0%～3.1%。應(yīng)用本方法對(duì)35份水樣進(jìn)行了分析。 結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、靈敏、快速，適用于生活飲用水及其水源水的常規(guī)分析，可為苯胺類化合物的污染評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 苯胺類化合物； 飲用水；水源

1引言

苯胺類化合物常用作染料、橡膠、塑料和油漆等的原料，由于工業(yè)污廢水的不合理排放對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染 [1，2 ]。同時(shí)，由于苯胺類化合物很難被生物降解，易在環(huán)境中造成累積污染，且苯胺類化合物具有致癌、致畸、致突變性，可通過呼吸道、消化道進(jìn)入人體內(nèi)，亦可經(jīng)皮膚吸收，美國EPA已將其列入優(yōu)先控制污染物 [3 ]。我國也將苯胺、4硝基苯胺、2，6二氯硝基苯胺等列入環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單，同時(shí)在《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB38382002）中也規(guī)定集中式生活飲用水地表水源中苯胺的含量不得超過100 μg/L [4 ]。由于苯胺具有長期殘留性、生物蓄積性、致癌性等特點(diǎn)，因此開發(fā)高靈敏度并且簡單實(shí)用的檢測技術(shù)，對(duì)控制水體中苯胺類化合物的污染、保證人類用水安全，具有重要意義。

目前， 苯胺類化合物的檢測方法主要有萘乙二胺偶氮光度法 [5，6 ]、液相色譜法 [7，8 ]、毛細(xì)管電泳法 [9，10 ]、離子色譜法 [11 ]、氣相色譜法 [12～14 ]等。紫外差示分光光度法 [15，16 ]不經(jīng)過分離直接測定工業(yè)廢水中的苯胺，該方法簡單快速，但是靈敏度較低。采用液/液萃取 [17 ]的方式對(duì)水源水中的苯胺、甲苯胺等苯胺類化合物進(jìn)行富集，氣相色譜氫火焰離子化檢測器檢測，該法靈敏度高但是前處理步驟較繁瑣， 且液/液萃取的回收率也較低。梯度淋洗離子色譜測定苯胺，靈敏度較高但分析時(shí)間較長。而液相色譜質(zhì)譜法（LCMS）靈敏度高，無需對(duì)大量水樣富集濃縮 [18～21 ]， 采用直接進(jìn)樣方式檢測水中的苯胺類化合物，其檢出限可達(dá)0.1～3.0 μg/L，且該法分析速度快，滿足對(duì)生活飲用水及其水源水快速準(zhǔn)確檢測的要求。

目前文獻(xiàn)多集中于水中苯胺的檢測方法研究，而氯苯胺、二硝基苯胺等的LCMS檢測卻鮮有報(bào)道。本研究建立一種無需繁瑣樣品前處理， 靈敏度高和抗干擾能力強(qiáng)的同時(shí)檢測生活飲用水及其水源水中苯胺及3硝基苯胺等多種衍生物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，實(shí)現(xiàn)苯胺類化合物的快速、簡便分析。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

液相色譜儀（Dionex UltiMate 3000，德國Thermo Fisher公司），配有在線脫氣裝置、雙三元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器；3200 QTRAP 雜交串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）；電噴霧電離（ESI）源和Analyst軟件（版本1.6.2）。電子天平（萬分之一，德國Sartorius公司）；純水儀（PURELAB Pulse，德國ELGA公司）。

苯胺（Aniline，AN，純度≥99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；六硝基二苯胺（Hexanitrodiphenylamine，HND，純度≥99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；2，6二氯硝基苯胺（2，6Dichloro4nitroaniline，2，6DC4NA，純度≥98.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；3硝基苯胺（3Nitroaniline，3NA，純度≥99.9%， 美國Supelco公司）；4硝基苯胺（4Nitroaniline， 4NA， 純度≥99.0%，美國SigmaAdlrich公司）。甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；乙酸銨（LCMS級(jí)，美國SigmaAdlrich公司）；甲酸（色譜純，美國Dikma公司）。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

3結(jié)果和討論

3.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將濃度為1.00 mg/L的50%甲醇水配制的單標(biāo)溶液通過注射泵以20 μL/min的速度直接注入質(zhì)譜儀，在一級(jí)全掃描模式下，AN， 3NA， 4NA在ESI+模式下的響應(yīng)較高，而2，6DC4NA和HND在ESI-模式下的響應(yīng)較高。除了上述5種苯胺類化合物，預(yù)實(shí)驗(yàn)中還對(duì)2硝基苯胺和2，4二硝基苯胺進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無論是在ESI+還是ESI-模式下，其響應(yīng)均較低。這可能是因?yàn)?硝基苯胺和2，4二硝基苯胺不適合在ESI源下電離，因此本實(shí)驗(yàn)未對(duì)二者進(jìn)行測定。5種組分在各自最佳的電離模式下選擇母離子。在子離子掃描模式下改變碰撞能量，選擇在變化的碰撞能量條件下能相對(duì)穩(wěn)定存在、豐度較高、質(zhì)荷比（m/z）相對(duì)較大的碎片離子作為子離子，每種組分選擇2～3個(gè)子離子。在MRM模式下檢測所選的母子離子對(duì)，選擇穩(wěn)定性好（信號(hào)值波動(dòng)±15%范圍內(nèi)）的離子對(duì)作為實(shí)際監(jiān)測的離子對(duì)。同時(shí)，在MRM模式下對(duì)去簇電勢、入口電勢、碰撞池入口電勢、碰撞能量、碰撞池出口電勢等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。5種被測物的最佳質(zhì)譜檢測條件見表1。

離子源其它參數(shù)大多不能針對(duì)單個(gè)離子對(duì)分別優(yōu)化，其中重要的包括CUR， Gas1， Gas2， IS和TEM。利用質(zhì)譜儀自帶軟件在FIA模式下， 選擇響應(yīng)值較低的3NA和HND， 分別在ESI+和ESI

Symbolm@@ 模式下混合標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)色譜柱分離后對(duì)它們進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)離子源條件見2.4.2節(jié)。

3.2色譜條件的優(yōu)化

3.2.1色譜柱的選擇文獻(xiàn) [21 ]報(bào)道，苯胺一般采用C18柱分析。本實(shí)驗(yàn)首先選用Xtimate C18柱（100 mm×2.1 mm， 3 μm， 月旭科技公司）進(jìn)行目標(biāo)化合物的分離，結(jié)果表明，3NA和4NA未能實(shí)現(xiàn)基線分離。實(shí)驗(yàn)考察了目標(biāo)化合物在極性稍強(qiáng)的HSS T3色譜柱上相同洗脫條件下的分離情況，結(jié)果表明，5種苯胺類化合物均實(shí)現(xiàn)了較好分離（見圖1）。因此，本實(shí)驗(yàn)選用HSS T3色譜柱。

3.2.2流動(dòng)相的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)比較了等度和梯度洗脫條件對(duì)目標(biāo)物分離的影響。由于前3種目標(biāo)物的極性較相近，等度洗脫需采用低比例的有機(jī)相才能實(shí)現(xiàn)較好的分離，但這樣會(huì)使得后兩種極性相對(duì)較弱的物質(zhì)難以被洗脫，導(dǎo)致分析時(shí)間太長。多次梯度洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.0～2.0 min內(nèi)B相由30%升至43%后再立即升至90%，并保持1.9 min，在此模式下5種組分均可實(shí)現(xiàn)較好的分離。

苯胺類化合物為弱堿性有機(jī)化合物，以甲醇水為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰展寬，且嚴(yán)重拖尾，尤其是HND。酸性條件下，鍵合相表面未烷基化的硅醇羥基電離被抑制，削弱了二次相互作用，能夠改善峰形。因此考察了濃度分別為0.00%， 0.01%， 0.02%， 0.03%， 0.04%， 0.05%（V/V）的甲酸與甲醇組成流動(dòng)相對(duì)待測組分的分離情況（見圖2）。結(jié)果表明，不加甲酸時(shí)，HND峰拖尾較嚴(yán)重，造成相近峰分離度降低；隨著甲酸濃度的增加，峰形變尖銳，分離度逐漸改善。當(dāng)甲酸濃度≥0.02%時(shí)，分離度較好， 且各物質(zhì)的響應(yīng)較高，所以選用0.02%甲酸組成流動(dòng)相。

苯胺類化合物被質(zhì)子化后以銨鹽的形式存在，ESI+模式下離子化效率會(huì)提高，為了進(jìn)一步提高待測組分的靈敏度，考慮在水相再加入一定濃度的乙酸銨。實(shí)驗(yàn)考察了乙酸銨濃度分別為5， 6， 7和8 mmol/L時(shí)目標(biāo)物的色譜峰形和響應(yīng)值。結(jié)果如圖3所示，在ESI+模式下，當(dāng)乙酸銨濃度由5 mmol/L升至6 mmol/L時(shí)，3種物質(zhì)的色譜峰均變窄，且峰面積均增大；乙酸銨濃度升至8 mmol/L時(shí)，3種物質(zhì)的色譜峰開始變寬，峰面積也減小。因此實(shí)驗(yàn)選擇含0.02%甲酸、6 mmol/L乙酸銨與甲醇組成最佳流動(dòng)相。

3.3方法學(xué)評(píng)價(jià)

3.3.1線性范圍和檢出限取一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按2.4節(jié)的方法進(jìn)樣測定，每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，以待測物濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積（y，cps·min）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)r≥0.995）。以3倍和10倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的各組分含量計(jì)算得到的方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.773～1.88 μg/L和2.58～6.27 μg/L（見表2），與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的檢出限相當(dāng)，滿足國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

3.3.2精密度實(shí)驗(yàn)取5種苯胺類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)液（濃度均為50 μg/L），按2.4的方法測定，在一天內(nèi)連續(xù)測定7次，以定量離子的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察日內(nèi)精密度；在30天內(nèi)取同一個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分7天進(jìn)行測定，考察日間精密度。結(jié)果表明，各待測組分的日內(nèi)RSD為0.8%～1.9%，日間RSD為3.3%～4.9%（見表2）。

3.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品測定

選取水源水和生活飲用水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別加入3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平測定6個(gè)平行樣，并以定量離子的峰面積的RSD考察加標(biāo)樣品溶液的精密度（表3）。結(jié)果表明，各組分的加標(biāo)回收率為8際情況84.1%～105%，加標(biāo)樣品的RSD為1.0%～3.1%，能滿足水樣分析測定的要求。

采集某地10份水源水、20份生活飲用水和5份地表水水樣，按照本方法對(duì)35個(gè)水樣進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，34份水樣中均未檢出5種待測物，1份某染料廠附近池塘水中檢出3.01 μg/L 六硝基二苯胺（見圖4）。同時(shí)，所有樣品在MRM模式下均無共流出干擾組分。

4結(jié) 論

本研究建立了生活飲用水及其水源水中5種苯胺類化合物的LCMS方法，與《GB 5750.82006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法有機(jī)物指標(biāo)》中采用固相萃取填充柱氣相色譜法測定苯胺相比，本研究采用可有效“屏蔽”樣品基體干擾的MRM模式，水樣過濾后直接進(jìn)樣分析，僅需簡單的前處理即可完成對(duì)復(fù)雜基體樣品的定性與定量分析。本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于生活飲用水及其水源水中5種苯胺類化合物的定性定量檢測，可滿足水質(zhì)監(jiān)測的要求。

References

1Santos C B， Neuparth T， Torres T， Martins I， Cunha I， Sheahan D， Mcgowan T， Santos M M. Aquat. Toxicol.， 2015， 163： 60-70

2Dom N， Knapen D， Benoot D， Nobels I， Blust R. Chemosphere.， 2010， 81（2）： 177-186

3JIA Li， WANG YanJun， DONG ShuYing， SHANG Lei， NA XiaoLin. Carcinogenesis， Teratogenesis & Mutagenesis， 2012， 24（04）： 283-285

賈 莉， 王彥軍， 董淑英， 商 蕾， 那曉琳. 癌變

SymbolWC@ 畸變

SymbolWC@ 突變， 2012， 24（4）： 283-285

4GB 38382002 Environmental quality standards for surface water. National Standards of the People′s Republic of China.

地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn). 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB 38382002

5GB118891989 Water qualityDetermination of aniline compoundsSperctrophotometric method with N（1naphthyl） ethylenediamine. National Standards of the People′s Republic of China.

水質(zhì) 苯胺類化合物的測定N（1萘基）乙二胺偶氮分光光度法. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB 118891989

6Ghasemi J， Niazi A. Talanta， 2005， 65（5）： 1168-1173

7LIU Peng， ZHANG LanYing， JIAO YanLin， LIU Na， LIU YingYing， GAO Song. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（5）： 741-744

劉 鵬， 張?zhí)m英， 焦雁林， 劉 娜， 劉瑩瑩， 高 松. 分析化學(xué)， 2009， 37（5）： 741-744

8Tong C L， Guo Y， Liu W P. Chemosphere， 2010， 81（3）： 430-435

9Guo X F， Lv J， Zhang W D， Wang Q J， He P G， Fang Y Z. Talanta， 2006， 69（1）： 121-125

10GUO XiFeng， WANG ZhenHui， ZHOU SuPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2004， 32（5）： 651-653

郭喜鳳， 汪振輝， 周漱萍. 分析化學(xué)， 2004， 32（5）： 651-653

11ZHU Yan， WANG MuHua， MOU ShiFen. Chinese J. Anal. Chem.， 2002， 30（7）： 774-778

朱 巖， 王慕華， 牟世芬. 分析化學(xué)， 2002， 30（7）： 774-778

12Farajzadeh M A， Nouri N. Talanta， 2012， 99： 1004-1010

13GAO Song， LIU YuanYuan， LIU Na， LV ChunXin， WANG Lin， ZHANG LanYing， PANGYingMing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1353-1359

高 松， 劉園園， 劉 娜， 呂春欣， 王 琳， 張?zhí)m英， 龐英明. 分析化學(xué)， 2012， 40（9）： 1353-1359

14Jnsson S， Gustavsson L， van Bavel B. J. Chromatogr. A， 2007， 1164（12）： 65-73

15LI HuiPing， WANG WanYi. Environmental Monitoring in China， 2011， 27（5）： 28-29

李會(huì)平， 王婉儀. 中國環(huán)境監(jiān)測， 2011， 27（5）： 28-29

16YANG XiaoFen， ZHAO MeiPing， LI YuanZong， ZHANG XinXiang， CHANG WenBao. Chinese J. Anal. Chem.， 2002， 30（5）： 540-543

楊曉芬， 趙美萍， 李元宗， 張新祥， 常文保. 分析化學(xué)， 2002， 30（5）： 540-543

17WANGHongMing， JIANG PiSen， HOU XiaoHong， LUN XiaoWen， ZHANG CongLu， LIANG Ning. Petrochemical Technology， 2012， 41（3）： 342-346

王洪明， 江丕森， 侯曉虹， 倫小文， 張聰璐， 梁 寧. 石油化工， 2012， 41（3）： 342-346

18Delépée R， Chaimbault P， Antignac J P， Lafosse M. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2004， 18（14）： 1548-1552

19XIONG Jie， QIAN Shu， XIE YongHong， XIE ZhenWei， LI HaiXia. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（1）： 93-98

熊 杰， 錢 蜀， 謝永洪， 謝振偉， 李海霞. 分析化學(xué)， 2014， 42（1）： 93-98

20ZHAO YunZhi， YANG Ping， QIAN Shu. Chinese Journal of Chromatography， 2015， 33（5）： 508-513

趙云芝， 楊 坪， 錢 蜀. 色譜， 2015， 33（5）： 508-513

21ZHU LiBo， XU NengBin， FENG JiaYong， QIAN FeiZhong， CHEN ZhongQuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（4）： 594-597

朱麗波， 徐能斌， 馮加永， 錢飛中， 陳鐘佺. 分析化學(xué)， 2013， 41（4）： 594-597