單頭腫腿蜂DNA提取方法及多個基因片段PCR反應(yīng)體系建立

姜嫄 李志強 吳曉云等

摘要[目的]采用分子生物學(xué)技術(shù)研究腫腿蜂類天敵昆蟲近緣種關(guān)系。[方法]利用SDS法和試劑盒法2種方法對8種腫腿蜂的單頭個體進(jìn)行基因組DNA提取。[結(jié)果]瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，試劑盒法提取的單頭腫腿蜂基因組DNA雖成本較高，但提取總量大、提取成功率高、單位濃度高。且利用試劑盒法提取的基因組DNA進(jìn)行多個基因片段PCR擴增，均得到正確的擴增產(chǎn)物。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步分析腫腿蜂種類及遺傳進(jìn)化關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞腫腿蜂；DNA提??；基因片段；PCR

中圖分類號S476文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2016）04-186-04

DNA Extraction Method of Sclerodermus and Establishment of Gene Segment PCR Reaction System

JIANG Yuan， LI Zhiqiang， WU Xiaoyun， ZHANG Yinan* et al（Department of Horticulture， Beijing Vocational College of Agriculture， Institute of Biological Control， Beijing 102442）

Abstract[Objective] To research the sibling species relationship of natural enemy insects of Sclerodermus. [Method] Genome DNA extraction of eight species of Sclerodermus was carried out by SDS method and kit method. [Result] Results of agarose gel electrophoresis showed that genome DNA extraction costed relatively high by kit method with the characteristics of large extraction amount， high successful extraction rate and high concentration per unit milliliter. PCR amplification of multiple genes could obtain correct products. [Conclusion] This research provides basis for the further analysis of the types and genetic evolution of Sclerodermus.

Key wordsSclerodermus； DNA extraction； Gene sequences；PCR

腫腿蜂（Sclerodermus）是用于蛀干害蟲生物防治的一類重要寄生性天敵昆蟲，目前我國已發(fā)現(xiàn)多種具有生物防治應(yīng)用潛能的腫腿蜂，其中管氏腫腿蜂（S.guani）、川硬皮腫腿蜂（S.sichuanensis）和白蠟吉丁腫腿蜂（S.pupariae）已有較多的研究和應(yīng)用[1-11]。研究表明，用松脊吉丁腫腿蜂寄生馬尾松木段中的松褐天牛，其寄生率較高[12]。蘋小吉丁腫腿蜂和落葉松吉丁腫腿蜂被用來防治新疆蘋小吉丁，具有一定的防治成果[13]。昆蟲分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，為腫腿蜂的分子鑒定提供了研究基礎(chǔ)。然而，腫腿蜂單頭個體體積較小，雌蜂體長3～4 mm，如何提取單頭腫腿蜂的基因組DNA成為首要解決的問題。不同腫腿蜂在形態(tài)上十分相近，很難鑒別，利用分子生物學(xué)手段對不同寄主腫腿蜂的分子鑒定研究，有利于生物防治過程中有針對性地釋放天敵，從而達(dá)到更好的控制效果。因此，筆者參考小型昆蟲和寄生蜂的DNA提取方法[14-16]，對我國已發(fā)表的種和北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院生物防治研究所采集保存的腫腿蜂進(jìn)行基因序列研究，以明確其特定基因的異同，為確定其親緣關(guān)系、明確種類奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料試驗于2013年在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院農(nóng)藥分子生物學(xué)實驗室進(jìn)行。8種腫腿蜂取自中國林業(yè)科學(xué)研究院生物防治中心，為在室內(nèi)用替代寄主人工繁育多代后的活體雌蟲，8種腫腿蜂包括管氏腫腿蜂，川硬皮腫腿蜂，白蠟吉丁腫腿蜂，蘋小吉丁腫腿蜂寄生蘋小吉丁Agrilus mali幼蟲和蛹，松脊吉丁腫腿蜂寄生日本松脊吉丁Chalcophora japonica Gory幼蟲，落葉松吉丁腫腿蜂寄生落葉松吉丁Chrysobothris sp.幼蟲，沙蒿吉丁腫腿蜂寄生沙蒿吉丁Sphenoptera sp.幼蟲，松褐天牛腫腿蜂寄生松褐天牛Monochamus alternatus幼蟲和蛹。每種腫腿蜂提取15頭單頭個體以備用。

1.2主要試劑及儀器蛋白酶K，提取裂解液（STE），酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），氯仿/異戊醇（24∶1），RNA酶，無水乙醇，瓊脂糖，溴化乙錠10 mg/mL（EB）（100 mg溴化乙錠溶于10 mL水中，1 mL每管分裝，于4 ℃棕色瓶中保存），電泳緩沖液：10×TAE（48.4 g Tris堿，3.27 g EDTA（pH 8.0），11.42 mL冰醋酸，滅菌水定容至1 000 mL），10×Loading buffer，Marker：2000bp ladder marker。

TW2水浴鍋（Julabo公司），DYY6C電泳儀（北京六一廠），水平電泳槽，高壓滅菌鍋，sartorius電子天平，UVI凝膠成像系統(tǒng)（UNITEC），CT15RE離心機（Hitachi公司），微波爐（SAMSUNG公司），渦旋儀（QILINBEIER公司），-86 ℃超低溫冰箱（Thermo公司），fiveeasy pH計，冰箱（容聲公司），Eppendorf移液槍若干。1.5 mL離心管，試劑瓶等。

1.3方法

1.3.1SDS法。①在1.5 mL離心管內(nèi)加入10 μL STE（0.1 mmol/L NaCl，10 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L EDTA，滅菌后使用）。②將單頭腫腿蜂雌蟲活體裝入離心管中，再將離心管放入液氮5～10 s后夾出，用塑料研杵快速研碎成蟲，再加入90 μL STE、9 μL 10%SDS和5 μL蛋白酶K，搖勻10 min。③65 ℃水浴3.5 h，期間多次搖勻。④抽提：加入100 μL酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混勻10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液；加入100 μL氯仿/異戊醇（24∶1）與上清液混勻10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液。⑤重復(fù)步驟④1次。⑥在上清液中加入2倍體積冰凍的無水乙醇，于-20 ℃沉淀過夜。⑦ 4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液。⑧漂洗：加入100 μL 75%乙醇，搖勻，以除去殘留的鹽，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，吸去上清液。⑨重復(fù)步驟⑧1次（漂洗2次）。⑩風(fēng)干：在室溫下放置20 min左右至乙醇完全揮發(fā)或在通風(fēng)廚放5～8 min。DNA溶解：加入10～13 μL ddH2O，室溫放置溶解20 min。

1.3.2試劑盒法。選用TianGen公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（DP30402），方法步驟參照說明書并稍作改動。①將單頭腫腿蜂雌蟲活體裝入離心管中，再將離心管放入液氮5～10 s后夾出，用塑料研杵快速研碎成蟲，加入200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。加入40 μL 10 mg/mL RNaseA溶液振蕩15 s，室溫放置5 min。②加入20 μL Proteinase K溶液（20 mg/mL），混勻。在56 ℃水浴鍋中放置2 h，每30 min顛倒混合樣品1次。③加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃水浴鍋中放置10 min，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。④加入200 μL無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。⑤將上一步驟④所得溶液和絮狀沉淀均加入一個吸附柱CB3中，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。⑥向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入700 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑧重復(fù)步驟⑦1次。⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑩將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加60～80 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.3.3基因組DNA樣品檢測。利用瓊脂糖凝膠電泳對提取出的基因組DNA樣品進(jìn)行檢測，配制1%的瓊脂糖凝膠溶液（0.3 g瓊脂糖，30 mL 1×TAE，1 μL EB），取3 μL基因組DNA樣品，與10×Loading buffer 混勻后點樣，電壓100 V，電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。

1.3.4腫腿蜂多個基因片段PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序。反應(yīng)引物參考Simon等[17]的通用引物。反應(yīng)體系參考天根試劑盒TaqDNA聚合酶說明書中的體系，線粒體COI、12S、16S、cytb，核糖體28S基因片段以及核糖體間隔區(qū)ITS序列的擴增反應(yīng)體系相同（25.0 μL）：1.5 μL模板DNA，3.0 μL 10×Taq buffer，2.0 μL dNTP mixture（2.5 mmol/L），正反向引物各1.0 μL（10 pmol/μL），0.5 μL TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL），16.0 μL二次滅菌水。

反應(yīng)程序參考試劑盒中所列出的反應(yīng)程序并結(jié)合其他研究人員[17-21]擴增相近物種相同基因片段反應(yīng)程序，若擴增不成功再稍降低退火溫度及增加循環(huán)次數(shù)，最終擴增出所需片段。PCR引物信息見表1。

COI基因片段反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸3 min。

線粒體12S基因序列反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。

線粒體cytb基因序列反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。

線粒體16S基因序列反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。

28S基因片段的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。

核糖體ITS基因序列反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。

2結(jié)果與分析

2.1SDS法提取的單頭腫腿蜂基因組DNA結(jié)果SDS法提取腫腿蜂的基因組DNA檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，并非所有的腫腿蜂個體基因組DNA都被成功地提取出來，且有個別腫腿蜂提取出的DNA有拖尾現(xiàn)象。

2.2試劑盒法提取的單頭腫腿蜂基因組DNA結(jié)果試劑盒法提取腫腿蜂的基因組DNA檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，所有的腫腿蜂個體基因組DNA都可被成功地提取出來，且無拖尾現(xiàn)象。試劑盒法最后溶解DNA的總量為75 μL，而SDS法僅有13 μL所得到的電泳圖譜亮度與試劑盒法提取的DNA電泳圖譜亮度相當(dāng)，所以試劑盒法優(yōu)于SDS法。該研究要擴增多個基因序列，且為首次擴增，故使用試劑盒提取出的基因組DNA為模板。

2.3PCR檢測結(jié)果線粒體基因COI片段和28S核糖體基因片段的擴增結(jié)果見圖3。由圖3可知，線粒體基因COI片段大小為620 bp左右，28S核糖體基因片段大小為770 bp左右。其中泳道16未能成功擴增出目標(biāo)產(chǎn)物，可能是由于基因組濃度較低所致。

8種腫腿蜂的部分個體核糖體間隔區(qū)ITS全序列的擴增結(jié)果見圖4。由圖4可知，每個個體均能擴增出2 000左右的目的條帶。

3結(jié)論與討論

該研究分別利用SDS法和試劑盒法提取腫腿蜂基因組DNA，結(jié)果表明，利用試劑盒法提取出的基因組DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象。試劑盒法提取DNA的成功率為100%，明顯高于SDS法，且最終獲得的DNA量大，為SDS法的6～7倍，可滿足多個基因的PCR擴增及測序分析，能夠用于類似腫腿蜂這種小的昆蟲。并且試劑盒法提取基因組DNA所用時間較短，省時省力。但試劑盒法價格較貴，僅測序分析單個基因時，可考慮用SDS方法。

該研究參考其他相近物種的基因擴增體系與程序，當(dāng)擴增效果差時稍加改動反應(yīng)程序，而保持反應(yīng)體系不變，最終均能成功擴增出所需要的基因片段，這些基因片段序列增加了NCBI數(shù)據(jù)庫的物種基因信息，便于其他學(xué)者進(jìn)行比較。

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