酶Sevag法除酸漿果實(shí)多糖蛋白工藝的研究

徐丹鴻 王爽 林道鵬

摘要[目的]優(yōu)化木瓜蛋白酶Sevag法去除酸漿（Physalis alkekengi L.）果實(shí)多糖中蛋白質(zhì)的工藝條件。[方法]以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)酶解溫度、時(shí)間、pH及酶添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)及L9（34）正交試驗(yàn)確定酶解條件，并結(jié)合Sevag試劑除蛋白。[結(jié)果]各因素對(duì)酶解法脫酸漿果多糖液蛋白的影響程度大小依次為：酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、酶添加量。在酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間2.0 h、pH 6.0、酶添加量2.5%條件下，粗多糖液蛋白脫除率為62.07%，多糖保留率為93.16%。原料經(jīng)酶處理后，可使游離蛋白和部分與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)被水解，再經(jīng)Sevag試劑（氯仿∶正丁醇為4∶1）處理2次，蛋白質(zhì)脫除率為81.65%，多糖保留率為89.43%，可達(dá)到較理想的脫蛋白質(zhì)效果和較高的粗多糖保留率。[結(jié)論] 采用酶和Sevag試劑相結(jié)合的方法除酸漿果多糖中的蛋白質(zhì)，效果良好，操作簡(jiǎn)單，可為酸漿果多糖的純化提供理論依據(jù)，但其對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和生物活性的影響還有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞酸漿果多糖；脫蛋白；木瓜蛋白酶；Sevag法

中圖分類(lèi)號(hào)S509.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2016）04-113-03

Protein Removal from Polysaccharide by EnzymesSevag Process

XU Danhong， WANG Shuang， LIN Daopeng（Heilongjiang Ecological Engineering Professional College， Harbin， Heilongjiang 150025）

Abstract[Objective] The aim was to optimize conditions for removing protein from Physalis alkekengi polysaccharide with papainSevag method. [Method] With protein removal rate and polysaccharide retention rate as indicators， the single factor experiment was carried out by the enzyme hydrolysis temperature， time， pH and enzyme addition and L9 （34） orthogonal experiment. And combined Sevag reagent for removing protein. [Result] Influence of enzymatic deacidification of polysaccharide protein was the enzymolysis temperature > hydrolysis time>pH enzyme dosage. The optimum technological conditions were 60 ℃of hydrolysis temperature， hydrolysis time of 2.5 h， pH 6.0， enzyme adding amount of 2.5%， the removal rate of protein was 62.07% and the retention rate of polysaccharide was 93.16%. After the material processed by the enzyme， the free protein and the part of the protein which is combined with the polysaccharide can be hydrolyzed， and then treated for 2 times by Sevag reagent（chloroform Butyl alcohol 4∶1）， the removal rate of protein was 81.65% and the retention rate of polysaccharide was 89.43%. [Conclusion] Using papainSevag method to remove protein from Physalis alkekengi polysaccharide has a good effect and simple operation， which can provide theoretical basis for purification of Physalis alkekengi polysaccharide， but its effect on polysaccharide structure and biological activity remains to be further studied.

Key wordsPhysalis alkekengi L. polysaccharide； Removal of protein； Papain； Sevag method

酸漿（Physalis alkekengi L.）在我國(guó)分布廣泛，尤其是在東北地區(qū)，具有對(duì)氣候適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒、耐旱，易于人工栽培等特點(diǎn)，其全草皆可入藥，是我國(guó)醫(yī)書(shū)中記載的一種常用中藥[1]。關(guān)于酸漿果實(shí)中的活性成分，已有學(xué)者對(duì)酸漿果實(shí)的多糖進(jìn)行了分析和測(cè)定[2-3]，但從天然動(dòng)植物中提取的多糖，常與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物，使蛋白質(zhì)的脫除比較困難，因此脫蛋白是多糖制備過(guò)程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)[4]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)粗多糖脫蛋白的方法主要有Sevag法、三氟三氯乙烷法、外三氯乙酸法、酶法、鹽酸法、樹(shù)脂法等[5]。其中，酶法利用蛋白酶將粗多糖中的蛋白質(zhì)水解，條件溫和，效率高，但會(huì)引入新的蛋白質(zhì)雜質(zhì)；而Sevag法是利用蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，達(dá)到去除蛋白質(zhì)的目的，可避免糖降解，但效率不高[6]。所以，酶與Sevag法結(jié)合除蛋白，可取得較好的效果。

目前關(guān)于酸漿果實(shí)多糖中除蛋白方法的研究報(bào)道并不多見(jiàn)，筆者在酸漿果實(shí)多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，采用酶和Sevag試劑相結(jié)合的方法研究酸漿果實(shí)多糖脫蛋白工藝，通過(guò)對(duì)各工藝參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳工藝條件，以期為酸漿果實(shí)多糖分離純化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原材料。酸漿果實(shí)購(gòu)買(mǎi)于哈爾濱地區(qū)，經(jīng)烘干、粉碎，過(guò)40目篩備用，經(jīng)熱水浸提制得酸漿果實(shí)粗多糖粉末。

1.1.2主要試劑。木瓜蛋白酶（>50萬(wàn)U/g）、考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、苯酚等，均為分析純化學(xué)試劑。

1.1.3主要儀器。紫外分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)），北京普析通用儀器有限公司；循環(huán)水真空抽濾泵（SHZD），鞏義市予華儀器有限公司；電子分析天平（ESJ4），沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（TY10RE2000A），北京中儀友信有限公司；離心機(jī)（TD5A），湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1酸漿果實(shí)粗多糖液的制備。準(zhǔn)確稱(chēng)取酸漿果粗多糖粉末0.501 0 g，室溫下加入少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)置于250 mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2木瓜蛋白酶法除蛋白的單因子試驗(yàn)。

1.2.2.1酶解溫度的篩選。量取等量的粗多糖液，加入底物1.5%的木瓜蛋白酶，分別在溫度30、40、50、60、70 ℃條件下，pH 6.0，水解1.0 h，研究不同酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。

1.2.2.2酶解時(shí)間的篩選。量取等量的粗多糖液，加入底物1.5%的木瓜蛋白酶，在溫度60 ℃，pH 6.0，分別水解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，研究不同酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。

1.2.2.3酶解pH的篩選。量取等量的粗多糖液，加入底物1.5%的木瓜蛋白酶，在溫度60 ℃，分別在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的條件下酶解1.0 h，研究不同酶解pH對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。

1.2.2.4酶添加量的篩選。量取等量的粗多糖液，分別加入底物0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的木瓜蛋白酶，在溫度60 ℃，pH 6.0，水解1.0 h，研究不同酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。

1.2.3 木瓜蛋白酶法除酸漿果實(shí)粗多糖的正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、酶添加量4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.4酶Sevag法。在酶法脫蛋白的最佳條件下處理酸漿果實(shí)粗多糖液，然后置于100 ℃沸水浴中使蛋白酶失活，冷卻至室溫，按樣液與Sevag試劑（氯仿∶正丁醇4∶1）比為4∶1，充分振搖30 min，離心（4 000 r/min，5 min）去除沉淀，分出上清液，測(cè)糖濃度和蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.2.5測(cè)定項(xiàng)目及方法。多糖含量測(cè)定方法采用苯酚-硫酸法[7]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法[8-9]采用考馬斯亮藍(lán)法。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：精密稱(chēng)取牛血清蛋白0.100 g溶于蒸餾水中，定容得到1 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別取1、2、3、4、5、6 mL于100 mL容量瓶中定容至100 mL，配成濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的溶液，再分別取1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液5 mL（100 mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1 000 mL），在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率計(jì)算公式如下：

2結(jié)果與分析

2.1木瓜蛋白酶法除蛋白的單因素試驗(yàn)

2.1.1酶解溫度對(duì)酸漿果實(shí)粗多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。由圖2可知，酶解溫度30～60 ℃時(shí)蛋白質(zhì)脫除率隨著溫度的升高而增加，多糖保留率變化不顯著，而超過(guò)60 ℃后，蛋白脫除率有所下降，同時(shí)多糖保留率也有所下降，說(shuō)明隨著溫度過(guò)高，木瓜蛋白酶的活力降低，也會(huì)造成多糖的少量分解。故酶法脫蛋白選用溫度為40、50、60 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2酶解時(shí)間對(duì)酸漿果實(shí)粗多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。由圖3可知，酸漿果實(shí)粗多糖液的蛋白質(zhì)脫除率隨著酶解時(shí)間增加而增加，反應(yīng)時(shí)間在2.0～3.0 h時(shí)，脫蛋白率由55.42%增加至59.41%，而此時(shí)多糖保留率由93.46%降2.1.3酶解pH對(duì)酸漿果實(shí)粗多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響。如圖4所示，酶的活力受pH的影響，在pH 5.5時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最高，為55.22%；而多糖保留率卻隨著pH的升高而增加，說(shuō)明較低的pH條件下，會(huì)導(dǎo)致多糖水解，含量下降。因此，綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率，選擇選木瓜蛋白酶反應(yīng)的pH為5.5、6.0、6.5進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4酶添加量對(duì)酸漿果實(shí)粗多糖蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率的影響。如圖5所示，不同酶的添加量對(duì)粗多糖保留率影響不顯著，而蛋白質(zhì)脫除率隨著酶添加量的增加而增加，當(dāng)酶的添加量為2.0%，蛋白質(zhì)脫除率增加趨于平緩。因此，選木瓜蛋白酶的添加量為2.0%、2.5%、3.0%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2木瓜蛋白酶法除酸漿果實(shí)粗多糖的正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)確定的酶解條件下，粗多糖保留率變化不明顯，因此正交試驗(yàn)中以蛋白質(zhì)脫除率為參考指標(biāo)確定最佳酶處理?xiàng)l件，結(jié)果見(jiàn)表2。

正交試驗(yàn)分析結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)酶解法脫蛋白的影響程度大小依次為：酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、酶添加量。正交試驗(yàn)優(yōu)化條件為：A3B2C2D2，即酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間2.0 h、酶解pH 6.0、酶添加量2.5%，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下粗多糖液蛋白質(zhì)脫除率為62.07%，多糖保留率為93.16%。說(shuō)明試驗(yàn)效果良好，驗(yàn)證了最佳酶解條件的正確性。

44卷4期徐丹鴻等酶-Sevag法除酸漿果實(shí)多糖蛋白工藝的研究2.3酶Sevag法按照酶法脫蛋白質(zhì)的最佳條件，即在酸漿果實(shí)粗多糖液添加2.5%的木瓜蛋白酶，pH 6.0，溫度60 ℃、酶解2.0 h后置于100 ℃沸水浴中使蛋白酶失活，冷卻至室溫，按樣液與Sevag試劑（氯仿∶正丁醇4∶1）比為4∶1，充分振搖30 min，離心（4 000 r/min，5 min）去除沉淀，分出上清液，測(cè)糖濃度和蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

從圖6可看出，酶法與Sevag法連用條件下，粗多糖中蛋白質(zhì)的脫除率也隨著處理次數(shù)的增加而升高，多糖保留率有所下降。酶Sevag法處理2次與酶Sevag法處理3次，蛋白質(zhì)脫除率差異不明顯。原料經(jīng)酶處理后，可使游離蛋白和部分與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)被水解，經(jīng)過(guò)2次處理后基本可達(dá)到理想的去除蛋白質(zhì)的效果，同時(shí)提高了粗多糖的保留率。