前處理對咖啡中咖啡因高效液相色譜檢測的影響

王賢智 郝淑美 王志洪等

摘要[目的] 分析比較幾種不同的前處理方法對咖啡因含量檢測的影響，篩選較優(yōu)的咖啡因提取方法。[方法]以國標(biāo)水提取方法為對照，研究乙醇提取、氯仿提取、超聲提取和微波提取對咖啡因含量檢測的影響，并對較優(yōu)的提取方法進一步優(yōu)化。[結(jié)果] 與國標(biāo)水提取方法相比，超聲提取方法準(zhǔn)確度更高，相對誤差更小。進一步對超聲提取的前處理時間進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)：超聲處理45 min以上的咖啡因提取效率與國標(biāo)方法相比，沒有顯著差異。[結(jié)論]綜合考慮咖啡因提取效率及處理時間，確定超聲提取45 min為該試驗最優(yōu)的咖啡因提取前處理方法，該方法操作更簡單、耗時更少、精密度更高。

關(guān)鍵詞咖啡；咖啡因；超聲輔助提取；高效液相色譜

中圖分類號S571.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2016）04-110-03

Influence of Different Pretreatment Methods on the Determination of Caffeine Content in Coffee by HPLC

WANG Xianzhi1，HAO Shumei1，WANG Zhihong2，HE Feifei1* （1. School of Agriculture，Yunnan University，Kunming，Yunnan 650091； 2. Yunnan Sanbiao Nonglin Sci. & Tech. Co.，Ltd，Kunming，Yunnan 650032）

Abstract[Objective] To study the influence of five pretreatment methods on the determination of caffeine content by HPLC， and to screen a superior method for caffeine extraction in coffee. [Method] With national standard of water pretreatment as the control， we studied the influence of ethanol extraction， chloroform extraction， ultrasonic extraction and microwave extraction on the determination of caffeine content in coffee， and further optimized the processing time for the superior pretreatment method.[Result] Compared with national standard of water extraction method，ultrasonic extraction had higher accuracy and less relatively error. Optimization of pretreatment time of ultrasonic extraction showed that the extraction rate of caffeine by ultrasonic extraction had no significant differences with that by national standard method，when the extraction time was greater than 45 min. [Conclusion] Considering the extraction rate of caffeine and treatment time，45 min ultrasonic extraction is the optimal pretreatment method for caffeine extraction. This method is simple，accurate and needs less operation time.

Key wordsCoffee； Caffeine； Ultrasonicassisted extraction； HPLC

咖啡因（caffeine，CAF）又名咖啡堿，是一種生物堿類化合物。研究表明，咖啡因具有刺激中樞神經(jīng)的作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤化療的生化調(diào)節(jié)、神經(jīng)官能癥和偏頭痛等均有積極作用[1-2]。然而，長期攝入過量咖啡因可能會引起流產(chǎn)、誘發(fā)骨質(zhì)疏松以及高血壓、心率失常等心血管系統(tǒng)疾病[3-5]。

咖啡因是衡量咖啡質(zhì)量的一項重要指標(biāo)，因此準(zhǔn)確測量咖啡中咖啡因的含量十分重要。目前，測定咖啡因的方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法、碘量法和重量法等[6-9]，其中常用的方法為高效液相色譜法。傳統(tǒng)的HPLC測定前處理方法操作繁瑣或涉及氯仿等有害物質(zhì)，且咖啡因提取率不高，導(dǎo)致重復(fù)性差、準(zhǔn)確度低。為建立快速準(zhǔn)確、安全無毒、操作簡便的咖啡因HPLC測定的前處理方法，筆者通過比較現(xiàn)有不同前處理方法下咖啡因測定結(jié)果的差異性，選擇相對快速簡便且安全無毒的前處理方法，并對該方法進行優(yōu)化。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1咖啡樣品與標(biāo)準(zhǔn)品。生咖啡豆收集自云南保山潞江壩，樣品經(jīng)粉碎并過25目篩后待測。準(zhǔn)確稱取50 mg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99.8%，編號GBW（E） 100063，精確至0.1 mg，放入100 mL棕色玻璃容量瓶內(nèi)，加入適量乙醇-水混合液（1∶4），待咖啡因溶解后，再加入乙醇-水混合液定容，制成濃度為0.5 g/L的儲備液。

1.1.2主要儀器。Alliance 2695型高效液相色譜儀，配2489型紫外可見檢測器。

1.2方法

1.2.1色譜條件。色譜柱為C18型；流動相為甲醇∶水（30∶70，V/V）混合液；流速在0.5～1.5 mL/min；柱溫度40 ℃；檢測波長272 nm。

1.2.2不同提取方法的比較。咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照以下不同前處理方法，比較不同處理方法檢測咖啡因的準(zhǔn)確度，每種處理方法重復(fù)6次。

處理①（水提取法，GB 5009.139-2014[7]）：準(zhǔn)確吸取0.8 mL咖啡因儲備液于250 mL錐形瓶中，加入約90 mL水，沸水浴30 min，不時振搖，取出流水冷卻1 min，加入 5 g氧化鎂，振搖，再放入沸水浴20 min，取出錐形瓶，冷卻至室溫，將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，靜置，取10 mL濾液通過混纖微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，棄去最初的5 mL，保留后5 mL備用。

處理②（乙醇提取法）：準(zhǔn)確吸取0.8 mL咖啡因儲備液于250 mL錐形瓶中，加入約100 mL乙醇，沸水浴30 min，不時振搖。取出錐形瓶，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度。搖勻，靜置，取10 mL濾液通過混纖微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，棄去最初的5 mL，保留后5 mL備用。

處理③（氯仿提取法）：準(zhǔn)確吸取0.8 mL咖啡因儲備液于250 mL錐形瓶中，先加2～3 mL超純水，再加50 mL三氯甲烷，加蓋搖勻，在超聲處理機上萃取5 min，靜置30 min，分層，將萃取液移入另一250 mL的錐形瓶中。在試樣中再加40 mL三氯甲烷，重復(fù)上述萃取操作步驟。棄去試樣，合并2次萃取液。加入5 mL飽和氯化鈉和少量無水硫酸鈉（至液面無水花），過濾100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗錐形瓶和濾紙2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.0 mL濾液到50 mL蒸餾瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。濾液通過混纖微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，棄去最初的5 mL，保留后5 mL備用。

處理④（超聲提取法）：準(zhǔn)確吸取0.8 mL咖啡因儲備液于250 mL錐形瓶中，加入約100 mL水，超聲提取60 min，冷卻。將提取液移入100 mL的容量瓶，用水定容至100 mL。取10 mL濾液通過混纖微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，棄去最初的5 mL，保留后5 mL備用。

處理⑤（微波提取法）：準(zhǔn)確吸取0.8 mL咖啡因儲備液于250 mL錐形瓶中，加入約100 mL提取液（95%乙醇-水為4∶1），搖勻，置于微波爐內(nèi)，用微波火力為“高”（350 W）作用3 min，將溶液靜置，冷卻至室溫后過濾，濾液移入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。取10 mL濾液通過混纖微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，棄去最初的5 mL，保留后5 mL備用。

1.2.3超聲提取時間的優(yōu)化。稱取過25目篩生咖啡粉0.1 g（精確至0.000 1 g），按照“1.2.1”所述處理④（超聲提取法）設(shè)置超聲提取時間優(yōu)化試驗。同時，對上述處理方法進行加標(biāo)回收率試驗。加標(biāo)回收處理時，添加咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度為5 mg/mL。

處理A：按照GB 5009.139-2014處理方法；處理B：超聲波處理30 min；處理C：超聲波處理45 min；處理D：超聲波處理60 min。

2結(jié)果與分析

2.1咖啡因色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線對咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品進行HPLC檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)品的咖啡因色譜圖（圖1），咖啡因的保留時間約為7.3 min。以樣品濃度x（mg/L）對峰面積y求出回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？Х纫驑?biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=30 962x-251.8，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 4。圖1咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的咖啡因色譜

Fig. 1Chromatogram of caffeine in coffee standard sample2.2不同提取方法的比較該研究中，處理②（乙醇提取法）未能獲得結(jié)果，處理⑤（微波提取法）測得的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品濃度太低（低于3 mg/L），所以不納入不同前處理方法的比較。由表1可知，與處理①（國標(biāo)）相比，處理④（超聲提取法）的RSD和相對誤差更小，精密度更高，因此選擇處理④（超聲提取法）作為該試驗的備選方法。

2.3不同超聲處理時間對咖啡因提取效果的影響方差分析表明，不同超聲處理時間對咖啡因的提取效果存在顯著影響（表2）。超聲處理45 min以上的咖啡因提取效果與國標(biāo)方法

3結(jié)論與討論

該研究擬通過比較國標(biāo)水提取法（GB 5009.139-2014）、乙醇提取法、氯仿提取法、超聲提取法和微波提取法5種前處理方法對咖啡中咖啡因含量檢測的影響，從而建立準(zhǔn)確、快速、安全的咖啡因提取測定方法。研究表明，除乙醇提取法沒有獲得結(jié)果及微波提取法提取效率太低外，其他3種前處理的咖啡因提取檢測方法均得出有效結(jié)果。與國標(biāo)水提取方法相比，超聲提取方法準(zhǔn)確度更高，相對誤差更小，且檢測過程中不涉及氯仿等有害藥品，因此是更為理想的咖啡因提取前處理方法。

進一步對超聲提取的前處理時間進行優(yōu)化表明，超聲處理45 min以上的咖啡因提取效率與國標(biāo)方法相比沒有存在顯著差異；不同超聲處理時長的加標(biāo)回收率比較表明，超聲提取法可以獲得比國標(biāo)水提取法更高的加標(biāo)回收率。因此，綜合考慮提取效率及處理時間，該試驗確定超聲提取45 min為最優(yōu)的咖啡因提取方法。和國標(biāo)方法相比，45 min超聲前處理咖啡因提取產(chǎn)量差異不顯著且用時更少，同時該方法操作更簡單、精密度高，可以作為今后咖啡因含量檢測的參考方法。

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