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    發(fā)酵低醇西瓜果酒產(chǎn)香酵母的分離篩選及香氣成分分析

    2016-10-21 05:11:59申光輝黎梅王玥楊紅霞唐倩劉小英張志清
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:西瓜汁果酒酵母菌

    申光輝,黎梅,王玥,楊紅霞,唐倩,劉小英,張志清

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)

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    發(fā)酵低醇西瓜果酒產(chǎn)香酵母的分離篩選及香氣成分分析

    申光輝*,黎梅,王玥,楊紅霞,唐倩,劉小英,張志清

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)

    為獲得適宜低醇西瓜果酒發(fā)酵的酵母菌株,以嗅聞香氣和總酯產(chǎn)量為指標(biāo),從傳統(tǒng)白酒酒曲中分離篩選獲得5株產(chǎn)香酵母。通過菌株形態(tài)、生理生化特征,結(jié)合26SrRNA序列分析,將菌株Z133鑒定為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus),菌株Z2、Z31、Z32和Z43鑒定為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。菌株Z133可產(chǎn)濃郁的果香氣味,對糖、SO2及乙醇均有良好的耐受性,可發(fā)酵西瓜汁獲得乙醇體積分?jǐn)?shù)5.6%的低醇西瓜果酒。采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析發(fā)現(xiàn),酒體中醇類和酯類香氣成分種類和相對含量高于未發(fā)酵西瓜汁,主要香氣成分苯乙醇、乙酸香葉酯和乙酸異戊酯的相對含量分別為25.65%、6.41%和3.93%。結(jié)果表明,從酒曲獲得的產(chǎn)香酵母菌株Z133在低醇西瓜果酒發(fā)酵中具有一定的應(yīng)用價值。

    產(chǎn)香酵母;低醇西瓜果酒;香氣成分;頂空固相微萃取

    西瓜(Citrullus lanatusThunb.)瓤甜多汁,富含糖類、有機(jī)酸、維生素等營養(yǎng)功能成分,深受消費者喜愛。由于產(chǎn)期集中、不耐貯存,常以鮮食為主。利用西瓜汁發(fā)酵果酒是緩解西瓜滯銷問題,提高產(chǎn)品附加值的有效途徑。風(fēng)味淡薄是目前大部分果酒生產(chǎn)中迫切需要解決的問題[1]。發(fā)酵菌種是影響果酒口感風(fēng)味的重要因素之一,而目前西瓜果酒多用葡萄酒酵母發(fā)酵[2],篩選適合西瓜果酒發(fā)酵的優(yōu)良酵母菌種的研究工作開展較少,且多以菌株產(chǎn)乙醇能力為指標(biāo)[3],忽視了菌種的發(fā)酵產(chǎn)香性能對果酒風(fēng)味的積極影響。產(chǎn)香酵母屬于可產(chǎn)醇、醛、酯等多種芳香物質(zhì)的非釀酒酵母,能夠積極改變酒體的化學(xué)成分,對酒的感官風(fēng)味品質(zhì)有特別的貢獻(xiàn),可改善傳統(tǒng)釀酒酵母釀制的果酒風(fēng)味,在果酒生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大[4-11]。酒曲是我國傳統(tǒng)白酒釀造的發(fā)酵生香劑,蘊(yùn)含著產(chǎn)香酵母在內(nèi)的多樣化釀酒功能菌資源[12-14]。本實驗從酒曲中分離篩選適于低醇西瓜果酒發(fā)酵的產(chǎn)香酵母,進(jìn)行菌株分類鑒定和發(fā)酵性能測定,并檢測發(fā)酵低醇西瓜果酒香氣成分,以評價該菌株用于發(fā)酵低醇西瓜果酒的可行性。

    1 材料與方法

    1.1材料

    酒曲:中溫曲和中高溫成熟曲,由四川省瀘州市某酒廠提供。西瓜:市售成熟西瓜。

    1.2培養(yǎng)基

    麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基(g/L):葡萄糖1.0,氯化鉀1.8,酵母膏2.5,醋酸鈉8.2,pH自然,115 ℃滅菌15min。YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母膏10.0,瓊脂15.0,pH6.0,115 ℃滅菌15min。PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯(去皮)200.0,葡萄糖20.0,瓊脂15.0,pH自然,121 ℃滅菌20min。豆芽汁培養(yǎng)基:取黃豆芽200.0g加適量水煮沸30min,紗布過濾得豆芽汁,加葡萄糖20.0g溶解,補(bǔ)水至1 000mL,121 ℃滅菌15min[10]。西瓜汁培養(yǎng)基:鮮西瓜取瓤榨汁過濾,用蔗糖調(diào)整糖度至18°Bx,pH自然,115 ℃滅菌15min。

    1.3儀器與設(shè)備

    SHP-160生化培養(yǎng)箱,上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;GI54DWS高壓滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;SW-CJ-2D雙人單面潔凈工作臺,蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;NikonEclipseE100光學(xué)顯微鏡,南京貝登生物科技有限公司;UV-3100PC紫外分光光度計,上海美普達(dá)儀器有限公司;JA1203B電子天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司;ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司。PX-B32T型水果糖度儀,廣州市普析通儀器有限公司;Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司;SPME手動進(jìn)樣器、15mL進(jìn)樣瓶、57328-U手動固相微萃取裝置、50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭,美國Supelco公司。

    1.4產(chǎn)香酵母菌分離與純化

    稱取5.00g酒曲粉碎樣品加入到100mL無菌水制成懸液,取1.0mL加入到9.0mL麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基試管中,28 ℃,120r/min振蕩富集培養(yǎng)24h。富集培養(yǎng)液梯度稀釋,取10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋液各100μL,分別涂布于YPD平板,28 ℃培養(yǎng)48h。挑取酵母樣菌落進(jìn)行鏡檢,反復(fù)平板劃線法純化后接種于PDA斜面,28 ℃培養(yǎng)48h,4 ℃保藏備用。

    1.5產(chǎn)香酵母篩選

    將分離菌株劃線接種于YPD平板上,28 ℃培養(yǎng)3~5d,通過嗅聞法[15]初步判斷是否有酯香或醇香,篩選具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。將初篩獲得的酵母菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中,28 ℃活化培養(yǎng)24h至酵母菌數(shù)為108CFU/mL。將酵母菌活化液用按體積分?jǐn)?shù)0.4%接入裝有200mL豆芽汁液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,28 ℃下靜置培養(yǎng)3d。取150mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入250mL圓底燒瓶中,采用回流皂化法[16]測定培養(yǎng)液總酯含量(以乙酸乙酯計),篩選出產(chǎn)酯量較高的菌株。

    1.6產(chǎn)香酵母菌鑒定

    1.6.1形態(tài)及生理生化鑒定

    參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[17],進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征測定。

    1.6.226SrRNAD1/D2區(qū)序列分析

    采用酵母基因組提取試劑盒提取酵母總DNA。引物采用NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’,NL4:5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。50μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:Taq酶0.25μL、Buffer5μL、dNTP4μL、DNA模板1μL、引物NL1/NL4各1μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5min,94 ℃變性1min,48 ℃退火1min,72 ℃延伸1min,30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化后,送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,選取相似度較高的模式菌株序列,用ClustalX1.83軟件進(jìn)行序列比對,用MEGA5.1軟件,Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.7產(chǎn)香酵母Z133生長耐受性能測定

    制備不同初始糖度、不同pH、不同SO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)及不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的滅菌西瓜汁培養(yǎng)基,按1×105CFU/mL接種量接入酵母菌種子液,28 ℃培養(yǎng)48h,血球計數(shù)法測定酵母細(xì)胞總數(shù),以考察菌株對糖度、酸度、SO2及乙醇的耐受性。同時將相同接種量的西瓜汁培養(yǎng)基在不同溫度下培養(yǎng)48h計數(shù),考察菌株溫度耐受性。

    1.8產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵低醇西瓜果酒揮發(fā)性香氣成分分析

    1.8.1低醇西瓜果酒發(fā)酵及理化指標(biāo)測定

    將榨汁過濾的西瓜汁,用蔗糖調(diào)整糖度至20°Bx,檸檬酸調(diào)pH至4.0,添加80mg/LSO2,按1×105CFU/mL接種量接入酵母菌種子液,30 ℃發(fā)酵6d后過濾澄清,獲得低醇西瓜果酒。發(fā)酵過程中總糖、總酸及乙醇體積分?jǐn)?shù)測定參考GB/T15038—2006[18]。

    1.8.2果酒揮發(fā)性香氣成分分析

    采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[8, 15]。取5mL果酒(或西瓜汁)于15mL頂空瓶中60 ℃恒溫水浴平衡5min,將老化好的固相微萃取頭插入頂空瓶中萃取30min,移入GC-MS進(jìn)樣口解吸3min,分析香氣成分。色譜條件:毛細(xì)管色譜柱AgilentHP-5MS(30m×250μm,0.25μm);手動不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫:初始溫度40 ℃,保留2min,以5 ℃/min到220 ℃,保留2min;檢測器溫度250 ℃;載氣He,流速1mL/min。質(zhì)譜條件:EI電離源,230 ℃,電子能量70eV,四極桿溫度150 ℃,質(zhì)量掃描范圍50~550u。未知化合物經(jīng)計算機(jī)檢索同時與NIST11譜庫匹配,對匹配度大于80的化合物進(jìn)行分析,峰面積歸一法計算香氣成分的相對含量。

    1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用DPS7.05軟件,Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行結(jié)果顯著性差異分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1產(chǎn)香酵母篩選

    從YPD平板上挑出具有酵母菌典型特征的菌落,結(jié)合顯微形態(tài)觀察從中溫酒曲分離獲得36株酵母菌株,中高溫曲未分離到酵母菌。

    將分離純化的36株酵母菌劃線于YPD平板上,28 ℃培養(yǎng)3~5d,通過嗅聞初步篩選出風(fēng)味柔和、有發(fā)酵香氣的5株菌Z133、Z2、Z31、Z32、Z43,其中Z133菌株具有特殊的果香味。將具有發(fā)酵香氣的5株酵母菌接種到豆芽汁培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)3d,測定培養(yǎng)液總酯含量。由表1可見,酵母菌株Z31培養(yǎng)液總酯含量最高,為0.48g/L,菌株Z133培養(yǎng)液總酯含量最低,但其發(fā)酵具有濃郁的果香香氣,而其他4株酵母香氣較淡。

    表1 五株酵母菌培養(yǎng)液總酯含量

    注:不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

    2.2產(chǎn)香酵母鑒定

    2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

    5株產(chǎn)香酵母菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征見表2和圖1。

    表2 五株產(chǎn)香酵母菌落特征

    圖1 五株產(chǎn)香酵母菌落特征Fig.1 Colony morphology of five aroma-producing yeast strains on PDA plates

    2.2.2生理生化鑒定

    表3是5株酵母生理生化特征結(jié)果,根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》初步將Z133鑒定為威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces,Z2、Z31、Z32和Z43鑒定為復(fù)膜孢酵母屬Saccharomycopsis。

    2.2.326SrRNA序列分析鑒定

    將菌株26SrRNAD1/D2片段序列測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中酵母模式菌株基因序列進(jìn)行BLAST比對,選取相似度較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列,Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    由圖2可見,菌株Z133與異常威克漢姆酵母Wickerhamomyces anomalusNRRLY-366(GenBank登錄號:U74590)聚在同一分支,且支持率100%,Z2,Z31,Z32,Z43四株菌與扣囊復(fù)膜酵母Saccharomycopsis fibuligera(GenBank登錄號:U40088)聚在同一分支。因此,結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征,將Z133鑒定為異常威克漢姆酵母W. anomalus,Z2,Z31,Z32,Z43鑒定為扣囊復(fù)膜酵母S.fibuligera。

    表3 5株產(chǎn)香酵母生理生化特性

    注:“+”為陽性,“-”為陰性。

    2.3產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵耐受性

    果酒發(fā)酵酵母生長發(fā)酵的耐受性能是評價菌株發(fā)酵能力的重要方面,同時也是進(jìn)行果酒發(fā)酵條件控制的主要依據(jù)。由表4可知,菌株Z133生長溫度范圍較寬,在30 ℃生長發(fā)酵最快。在15~25°Bx的糖度范圍內(nèi)生長良好,最低可耐受pH3.0的酸性環(huán)境。此外,該菌株對SO2和乙醇的耐受性良好,最高可耐受200mg/L的SO2濃度及體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇。

    2.4產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵低醇西瓜果酒揮發(fā)性香氣成分

    本實驗篩選獲得5株產(chǎn)香酵母中,菌株Z133總酯產(chǎn)量雖然不高,但其培養(yǎng)液具有濃郁的果香氣味。因此以菌株Z133為發(fā)酵菌株,按1.7.1方法發(fā)酵低醇西瓜果酒,獲得的西瓜果酒酒體金黃色,清亮透明,光澤較好,有濃郁的酒香氣和西瓜果香,酸甜適口,酒體較完整,饒有余味。由表5可見,Z133可消耗利用

    西瓜汁中的糖分發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乙醇,6d后獲得的低醇西瓜果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為5.6%,酸度為4.7g/L。

    圖2 基于26S rRNA D1/D2區(qū)域序列構(gòu)建的5株產(chǎn)香酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of five aroma-producing yeast strains based on 26S rRNA D1/D2 domain sequence analyses

    表4 產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵耐受性實驗結(jié)果

    注:“-”表示未生長發(fā)酵;同列數(shù)值后不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著,下表同。

    表5 產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵西瓜果酒過程中還原糖、殘?zhí)?、酸度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化

    注:-表示未測定。

    采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法檢測分析了西瓜汁與發(fā)酵西瓜果酒的揮發(fā)性香氣成分。由表6可知,西瓜汁中揮發(fā)性香氣成分較少,主要包括醛類、烯類、酸類成分,其中壬醛和檸檬醛為主要醛類物質(zhì),相對含量分別為5.10%和4.59%,烯類包括β-甜沒藥烯、α-姜黃烯和β-柏木烯,相對含量分別為3.14%、1.25%和2.17%,此外葵醚相對含量2.86%。

    本實驗檢測到的揮發(fā)性化合物種類相對于其他研究結(jié)果[19-20]較少,這除了與所用西瓜材料品種及成熟度有關(guān)外,還與所用揮發(fā)性物質(zhì)萃取分離分析的技術(shù)條件有關(guān)。相對于未發(fā)酵西瓜汁,Z133發(fā)酵6d獲得的低醇西瓜果酒增加了4種醇類和4種酯類揮發(fā)性香氣成分。其中乙醇、苯乙醇是主要醇類物質(zhì),相對含量分別為4.81%和25.65%,而酯類主要為乙酸異戊酯和乙酸香葉酯,相對含量分別達(dá)3.93%和6.41%。結(jié)果表明菌株Z133賦予西瓜果酒獨特的感官風(fēng)味與其發(fā)酵代謝西瓜汁過程中產(chǎn)生的醇類和酯類物質(zhì)有關(guān)。

    表6 產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵低醇西瓜果酒和西瓜汁揮發(fā)性成分比較

    注:-表示未檢測到。

    3 討論

    本實驗從白酒中溫曲中分離到5株產(chǎn)香酵母,包括1株異常威克漢姆酵母Wickerhamomyces anomalus和4株扣囊復(fù)膜酵母Saccharomycopsis fibuligera,均是醬香型[21]和濃香型[12]酒曲中常見的優(yōu)勢非釀酒酵母。本實驗發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母Z133豆芽汁培養(yǎng)液總酯含量雖然不高,但其發(fā)酵的西瓜果酒具有怡人的濃郁果香味,同時在生長耐受能力方面具有發(fā)酵低醇西瓜果酒的應(yīng)用潛力。

    低醇果酒是乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%~7%的發(fā)酵果酒[18],可減少高酒精度對身體健康的危害,且口感柔和,受到越來越多的消費群體,特別是酒精耐受力較弱人群的青睞。同時乙醇濃度對果酒芳香風(fēng)味有著重要影響,較高的乙醇含量降低一些香氣成分的貢獻(xiàn)率,導(dǎo)致果酒芳香度降低,風(fēng)味更淡[22-23]。低醇果酒能以較低的乙醇含量改善目前果酒風(fēng)味淡薄的問題,近年來逐漸成為果酒研究的重要趨勢。而非釀酒酵母乙醇產(chǎn)量低的代謝特點正適合于發(fā)酵低醇果酒,是發(fā)酵低醇果酒的重要方式[24]。

    本實驗篩選獲得的異常威克漢姆酵母Z133發(fā)酵6d即可獲得乙醇體積分?jǐn)?shù)5.6%的低醇西瓜果酒,同時代謝產(chǎn)生多種醇類、酯類香氣化合物,賦予其獨特的發(fā)酵醇香和酯香氣。其中苯乙醇相對含量最高,為25.65%,在其他來源的異常威克漢姆酵母產(chǎn)香代謝物研究中均有報道[8, 25-27]。

    本研究從白酒酒曲中分離篩選獲得5株產(chǎn)香酵母菌株,經(jīng)鑒定分屬于異常威克漢姆酵母和扣囊復(fù)膜酵母。其中異常威克漢姆酵母Z133產(chǎn)果香能力強(qiáng),能夠耐受200mg/LSO2及體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇,以其發(fā)酵獲得的低醇西瓜果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)5.6%,含有苯乙醇、乙酸異戊酯、乙酸香葉酯等香氣成分。Z133具有發(fā)酵低醇西瓜果酒的潛力。

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    Screeningandidentificationofaroma-producingyeaststrainsforlow-alcoholwatermelonwineandcharacterizationofaromaticcompounds

    SHENGuang-hui*,LIMei,WANGYue,YANGHong-xia,TANGQian,LIUXiao-ying,ZHANGZhi-qing

    (CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China)

    Toobtainyeaststrainforlow-alcoholwatermelonwineproduction,fivearoma-producingyeaststrainswereisolatedfromtraditionalChinesewinestarterbyolfactometryandesterproductiondetermination.Basedonmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsand26SrRNAD1/D2domainsequenceanalysis,strainZ133wasidentifiedasWickerhamomyces anomalusandZ2,Z31,Z32andZ43wereidentifiedasSaccharomycopsis fibuligera.StrainZ133couldproduceenjoyablefruitaromaflavorandshowedwelltolerancetosugar,SO2andethanol.Thearomacompoundsinlow-alcoholwatermelonwine(ethanolconcentrationwas5.6%)fermentedwithstrainZ133wereanalyzedbyheadspacesolidphasemicroextractioncombinedwithgaschromatography-massspectrometry,andthemainvolatilearomacompoundsinlow-alcoholwatermelonwinewerebenzeneethanol,geranylacetateandisoamylacetate,whichrepresented25.65%, 6.41%and3.93%ofthetotalvolatilecompounds,respectively.TheresultsshowedthatstrainZ133hadgreatpotentialforproducinglow-alcoholwatermelonwine.

    ester-producingyeast;low-alcoholwatermelonwine;aromaticcompounds;headspacesolidphasemicroextraction

    10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608019

    博士,講師(本文通訊作者,E-mail:shenghuishen@163.com)。

    國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303073);四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研興趣培養(yǎng)計劃項目(2014155)

    2016-02-24,改回日期:2016-04-07

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