云南龍竹種子外植體適宜滅菌時間篩選試驗

李云海 陳麗華 劉艷

摘要 以云南龍竹的成熟種子為試驗材料，采用75%酒精配合0.01%升汞作消毒滅菌劑，并設置0.01%升汞的不同消毒滅菌時間處理的對比。結果表明：在用75%酒精處理15 s后，再用0.01%升汞消毒滅菌處理，其適宜的消毒滅菌處理時間為3 h。在此消毒滅菌時間處理情況下，龍竹種子外植體的污染率已較低，為16.7%；而發(fā)芽率仍較高，可達到72.0%。

關鍵詞 云南龍竹；組織培養(yǎng)；種子；外植體；滅菌

中圖分類號 S795 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）06-0159-01

竹子因開花周期較長，且開花花期無法預測，種子獲取十分困難。因此，采用組織培養(yǎng)技術，對竹子進行快速擴繁，是目前解決竹子種苗繁殖效率低問題的有效方法之一。在組織培養(yǎng)過程中，菌類污染是培養(yǎng)過程中常見且必須高度重視的問題，其污染來源一般可分為3類：第1類是材料帶菌，第2類是接種污染，第3類是培養(yǎng)過程污染[1]。因而植物組織培養(yǎng)技術的基礎是獲得無菌材料，即有效解決材料帶菌問題，理論上污染率應該控制在8%以內(nèi)，但實際操作過程中，一般污染率會達到20%左右，甚至更高。再者，竹類植物與其他植物相比，竹子外植體的消毒滅菌則更困難，很難達到理想的滅菌效果，這可能與它的外在形態(tài)結構有關[2]。外植體表面消毒滅菌的關鍵就是要選擇合適的消毒劑和消毒時間，同時還要兼顧消毒滅菌后外植體材料的存活率、生長狀況等[3]。

很多學者對于竹子外植體的滅菌普遍采用的方式是以酒精（75%）與升汞（0.05%～0.20%）或次氯酸鈉（0.5%～2.0%）配合使用，然后再根據(jù)不同的外植體材料情況進行不同時間的滅菌[4]。本試驗以云南師范大學竹類研究所提供的云南龍竹（Dendrocalamus yunnanicus Hsuch et D.Z.Li）種子為外植體材料，以MS培養(yǎng)基添加1mg/L 6-BA為起始培養(yǎng)基，進行了酒精（75%）配合升汞不同消毒滅菌時間的比較，以期從中篩選出較適宜龍竹種子外植體的消毒滅菌方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取成熟度和飽滿程度較高的云南龍竹健康種子（此種子已干燥儲藏超過1年），仔細篩選去除發(fā)黑、發(fā)霉和結構不完整的種子，剝?nèi)ネ鈿で也荒軅芭哐坎糠?，最后留下色澤較好、顆粒飽滿且結構完整的種粒備用。

1.2 試驗方法

把選好的種粒用75%酒精消毒15 s并用無菌水清洗后，再用0.01%升汞浸泡做不同時間的消毒滅菌處理。所設置的4個不同處理時間分別為2.0、2.5、3.0、3.5 h。處理結束后，分別用無菌水振蕩清洗4～5次，每次5～7 min，分別記為處理1、2、3、4。用無菌濾紙吸干種粒上的水分，分別接種到MS+1 mg/L 6-BA+5 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基中。每處理接種6組，每組5個試管，每試管接種1粒種子，共計30粒種子，置于23～25 ℃、光照2 000 lx、光照時間12 h/d條件下培養(yǎng)[5-6]。

觀察記載各處理的種子在接種5、10、15、20 d后的污染情況和發(fā)芽情況，并對其15 d時的污染情況和20 d時的發(fā)芽情況進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 升汞不同消毒滅菌時間處理種子的污染情況

由表1可知，接種15 d后，處理1、2、3、4的污染數(shù)分別為2.00、1.67、0.83、0.50粒。經(jīng)方差（新復極差法）分析，處理1、2、3、4之間的差異極顯著，而組間（重復間）差異不顯著。進一步的多重比較分析結果（表2）表明，處理1與處理3、4差異都極顯著，而與處理2無顯著差異；處理2與處理4差異極顯著，與處理3差異顯著；處理3和處理4差異不顯著。結合各處理的污染率可得出，隨著消毒時間的增加，其污染程度越來越低，至處理3、4時，污染程度已較低且二者已無顯著差異。

2.2 升汞消毒時間對竹子種子外植體發(fā)芽情況的影響

由表3可知，接種20 d后，處理1、2、3、4的發(fā)芽率分別為94.4%、95.0%、72.0%、44.4%，即隨著升汞消毒滅菌時間的增加，各處理的發(fā)芽率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，最高達（下轉第165頁）

95.0%，最低為44.4%。方差分析結果顯示，處理2與處理4差異極顯著；處理1、3與處理4差異顯著；而處理1、2、3之間差異不顯著。

3 結論與討論

本試驗以云南龍竹的成熟種子為試驗材料，采用75%酒精配合0.01%升汞作消毒滅菌劑，并設置0.01%升汞的不同消毒滅菌時間處理的對比。試驗結果表明：在用75%酒精處理15 s后，再用0.01%升汞消毒滅菌處理，隨著0.01%升汞消毒滅菌處理時間的增加，各處理的污染率顯著降低，而剩余（未污染）種子的發(fā)芽率則呈現(xiàn)先升高后又降低的趨勢。分析表明，用0.01%升汞對云南龍竹種子進行消毒滅菌處理，其適宜的處理時間為3 h。在此消毒滅菌時間處理情況下，龍竹種子外植體的污染率已較低，為16.7%；而發(fā)芽率仍較高，可達到72.0%。而處理時間再增加（如處理3.5 h），則顯著影響種子的發(fā)芽率（僅為44.4%），污染率卻降低不顯著。

本試驗因為考慮到消毒滅菌劑升汞的較強毒性，因此沒有使用其較高濃度（如0.05%～0.20%）來處理外植體材料，以減少用無菌水反復沖洗及升汞本身的毒性對外植體材料的傷害。試驗結果也表明，只要達到足夠長的滅菌處理時間，較低濃度的升汞也能夠顯著控制植物外植體材料的污染，且種子等材料的成活和發(fā)芽率也能得到保障。特別是那些比較難得到的外植體材料，首先得保障其外植體材料不被殺死，在此基礎上才能進一步考慮如何提高殺菌效率。

4 參考文獻

[1] 曹雄麗，文韻，陶現(xiàn)靈，等.32種經(jīng)濟竹種的組培及苗木培育技術研究[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2012，37（5）：128-134.

[2] 王光萍，丁雨龍，黃敏仁，等.觀賞竹的試管快繁研究[J].林業(yè)科學，2005，41（5）：51-56.

[3] 李春芳，程治英，楊俊波，等.云南龍竹的快速繁殖和離體保存研究[J].亞熱帶植物科學，2012，2（3）：60-62.

[4] 高志明，謝錦鐘.竹子組織培養(yǎng)技術研究進展[J].世界竹藤通訊，2013，11（2）：1-6.

[5] 耿樹香，普曉蘭，王曙光.巨龍竹種子、小穗外植體愈傷組織的誘導培養(yǎng)[J].西部林業(yè)科學，2006（4）：78-83.

[6] 李云海，陳麗華，楊娟，等.孝順竹外植體適宜消毒方法及叢芽誘導培養(yǎng)基的篩選[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2008（2）：18-19.