抗紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原哈維弧菌單克隆抗體的制備及特性分析

秦藝丹 李男 李洋

摘要 以紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原——哈維弧菌2SYX002為抗原，通過雜交瘤技術(shù)制備了抗哈維弧菌的單抗1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 和 2C1。特性分析結(jié)果表明：有8株單克隆抗體（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6、6G6）特異性較差，與試驗(yàn)中所有菌株均發(fā)生反應(yīng)；有6株（4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9）只與免疫菌株哈維弧菌2SYX002反應(yīng)，與其他菌株均不發(fā)生反應(yīng)。5株單抗（2E7、5B2、1G2、2C1 、1G3 ）與部分參考菌株有不同程度交叉反應(yīng)；通過進(jìn)一步特性分析，從中篩選出單克隆抗體2C1，其抗原包被濃度為5×107 cells/mL時(shí)，與試驗(yàn)中所有哈維弧菌分離株反應(yīng)均為陽(yáng)性，除溶藻弧菌外不與其他參考菌株發(fā)生交叉反應(yīng)，效價(jià)為1：256。本研究擴(kuò)充了哈維弧菌單克隆抗體庫(kù)，為哈維弧菌單克隆抗體的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 哈維弧菌；紅鰭東方鲀；單克隆抗體；特性分析

中圖分類號(hào) S941.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）08-0239-01

Abstract In this paper， 6-week-old BALB/c mice were immunized with Vibrio harveyi 2SYX002 （isolated from dermal ulcer of Fugu rubripes） for monoclonal antibody preparation. After cell fusion，，screening， sub-cell clone， and so on， 19 hybridoma cell lines were obtained and named（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 and 2C1）.ELISA results showed that the MAb 1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 and 6G6 had positive reaction with all of the standard and isolated strains.The mAb of 4A7、4E12、7D7、8E10、4D12 and 2B9 had no crossreaction with other 11 standard bacterial strains， only specific reaction with the immuned bactria. MAb 2E7、5B2，、1G2，、2C1 and 1G3 had cross-reacted with tested strains， such as Vibrio.parahaemolyticus， Vibrio.damsela and so on. Among them， MAb 2C1 only had positive reaction with all strains of Vibrio.harveyi and Vibrio.alginolyticus（the titer was 1：256）， without other 11 standard bacterial strains. The present results provided the basis for the preparation of immunochromatographic test strip to rapid detection Vibrio. harveyi.

Key words Vibrio harveyi；Fugu rubripes；monoclonal antibodies；characteristic analysis.

哈維弧菌（Vibrio harveyi）又稱哈氏弧菌，廣泛存在于海洋環(huán)境中，是海水養(yǎng)殖業(yè)中一種常見的致病菌。其宿主十分廣泛，是對(duì)蝦發(fā)光病的主要致病菌[1-2]，還可引起多種海水養(yǎng)殖魚類潰瘍病[3-5]，其中紅鰭東方鲀皮膚潰爛病，具有傳染性較強(qiáng)，死亡率較高的特點(diǎn)。哈維弧菌是該病主要病原菌之一，患病魚體出現(xiàn)表皮潰爛，伴隨全身性出血，病灶處肌肉組織嚴(yán)重液化，肝臟等器官嚴(yán)重?fù)p傷，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于哈維弧菌遺傳特征和生理生化特征復(fù)雜多樣，并且與其近緣種在表型上有很高的相似性，依靠傳統(tǒng)的檢測(cè)方法檢出率低，而且需依賴專業(yè)的技術(shù)和設(shè)備，耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的及時(shí)診斷與防治。因此，發(fā)展哈維弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)在致病性弧菌診斷中有重要意義?；诿庖邔W(xué)原理的熒光抗體技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速、特異的檢測(cè)哈維弧菌。目前，Robertertson等制備了哈維弧菌的多克隆抗體[9]，但多抗血清具有明顯的異質(zhì)性，特異性較差。與之相比，單克隆抗體特異性高，其檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。本試驗(yàn)利用滅活的紅鰭東方鲀“皮膚潰爛病”病原——哈維弧菌2SYX002作為抗原免疫小鼠，制備了抗哈維弧菌的單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行了特性分析，為哈維弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

哈維弧菌Vibrio.harveyi（ATCC35084）、燦爛弧菌Vibrio.splendidus（ATCC33125）、副溶血弧菌Vibrio.parahaemolyticus（KCTC2471）、溶藻弧菌Vibrio.alginolyticus（KCCM40513）、創(chuàng)傷弧菌Vibrio.vulnificus（ATCC2126）、美人魚弧菌Vibrio.dams-ela（ATCC33539）、鰻弧菌Vibrio.anguillarum（KCTC2711）、希瓦氏菌Shewanella oneidensis（KCCM41821）、河豚鏈球菌Streptococcus iniae（KCTC3657）、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salm-onicida（MT004）、遲緩愛德華菌Edwardsiella tarda（ATCC15-947）均由韓國(guó)釜慶大學(xué)疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

免疫用哈維弧菌2SYX002由大連海洋大學(xué)王斌老師惠贈(zèng)。其他5株哈維弧菌分離株2SYX001、2SYX003、2HWM001、2HWM002和2SYX005均由實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)用Balb/C小白鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。聚乙二醇（PEG1500）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗小鼠Ig、對(duì)硝基苯磷酸鹽（pNPP）均購(gòu)自Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自HYCLONE公司。

1.2 單克隆抗體的制備

以哈維弧菌2SYX002為抗原，免疫6周齡Balb/C小鼠后取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在PEG作用下融合。采用間接ELISA篩選出陽(yáng)性雜交瘤后，再用有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株。具體操作方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.3 單克隆抗體的特性分析

1.3.1 特異性分析。采用間接ELISA法，分別用哈維弧菌2SYX002和 11株參考菌株作為包被抗原，濃度為5×107 cells/mL，單克隆抗體作為一抗，SP2/0上清為陰性對(duì)照，具體操作步驟參見文獻(xiàn)[11]。

1.3.2 適用性分析。采用間接ELISA法，分別用哈維弧菌

2SYX002和5株哈維弧菌分離株作為包被抗原，濃度為5×107（下轉(zhuǎn)第260頁(yè)）

（上接第239頁(yè)）

cells/mL，單克隆抗體作為一抗，SP2/0上清為陰性對(duì)照，具體操作步驟參見文獻(xiàn)[11]。

1.3.3 效價(jià)測(cè)定。采用棋盤滴定法對(duì)單克隆抗體的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。哈維弧菌2SYX002包被濃度為5×107 cells/mL，10倍梯度稀釋至5×105 cells/mL。將所得的抗哈維弧菌單克隆抗體原液以2倍比進(jìn)行稀釋至210，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)。具體操作步驟參見文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交瘤細(xì)胞株

經(jīng)篩選和克隆后共獲得19株穩(wěn)定分泌抗哈維弧菌2SYX002單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6和2C1。

2.2 單克隆抗體的特異性、適用性及效價(jià)

對(duì)19株陽(yáng)性單克隆抗體進(jìn)行特異性試驗(yàn)，其中1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 和 6G6 與所有試驗(yàn)菌株反應(yīng)均為陽(yáng)性；單抗4A7、4E12、7D7、8E10、4D12和 2B9 只與免疫菌株哈維弧菌 2SYX002 反應(yīng)；其余5株5B2、 2C1 、1G2、1G3和 2E7與副溶血弧菌、溶藻弧菌、美人魚弧菌、鰻弧菌、希瓦氏菌及遲緩愛德華菌有不同程度的交叉反應(yīng)；2C1可以識(shí)別所有哈維弧菌的參考菌株及分離株（表1），且只與溶藻弧菌有交叉反應(yīng)。單克隆抗體5B2、 2C1 、1G2、1G3 、2E7的效價(jià)分別為1∶4、1∶256、1∶64、1∶64、1∶128。

3 討論

本試驗(yàn)用甲醛滅活的哈維弧菌為抗原，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)，成功制備并克隆了19株能夠穩(wěn)定分泌抗哈維弧菌 2SYX002單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，所得的單抗與弧菌屬細(xì)菌存在較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，其原因可能是由于弧菌屬的細(xì)菌具有較高的相似度，親緣關(guān)系較近。使用全菌作為抗原于免疫小鼠，與其他弧菌屬細(xì)菌存在相同抗原。陳昌福等[12]用哈維氏弧菌LPS免疫同腹異育銀鯽，發(fā)現(xiàn)哈維弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌三者脂多糖有部分相同抗原。在郝貴杰等[13]的研究中，用制得的哈維弧菌單抗的腹水做交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，哈維弧菌與溶藻弧菌、麥?zhǔn)匣【透比苎【谋砻婵乖蛽碛邢嗨频目乖瓫Q定簇。

此外，張?jiān)d等在抗遲緩愛德華菌單克隆抗體制備中，分別使用全菌和鞭毛蛋白作為抗原，比較其免疫小鼠效果，發(fā)現(xiàn)前者免疫后小鼠抗血清效價(jià)較后者低，不適于雜交瘤試驗(yàn)[14]。因此，今后試驗(yàn)中可通過以特異性蛋白為抗原免疫小鼠來提高抗體的特異性。

試驗(yàn)所得的單克隆體的效價(jià)與同類文獻(xiàn)相比較低，可能是由于檢測(cè)中使用的抗體為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清。郝貴杰等[15]制備的抗哈維氏弧菌脂多糖單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其細(xì)胞培養(yǎng)液上清ELISA效價(jià)為1∶1 600，腹水效價(jià)為6.4×104，得到大幅度提高。后續(xù)試驗(yàn)中可通過誘生小鼠腹水進(jìn)一步提高抗體效價(jià)。本研究擴(kuò)充了哈維弧菌單克隆抗體庫(kù)，為哈維弧菌單克隆抗體的進(jìn)一步應(yīng)用提供更多參考數(shù)據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 陳月忠，鐘碩良，周宸.成蝦發(fā)光病病原體的分離鑒定及防治技術(shù)研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，39（增刊1）：218-223.

[2] 劉問，錢冬，楊國(guó)梁，等.南美白對(duì)蝦蝦苗淡化期間發(fā)光病病原研究 [J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，9（4）：300-304.

[3] 毛芝娟，劉國(guó)勇，陳昌福.大黃魚潰瘍病致病菌的初步分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，29（2）：178-181.

[4] 陳政強(qiáng)，姚志賢，林茂，等.半滑舌鰨皮膚潰瘍病病原研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，32（5）：764-771.

[5] ZORRILLA I，ARIJO S，CHABRILLON M，et al.Vibrio species isolated from diseased farmed sole，Solea senegalensis（Kaup），and evaluation of the potential virulence role of their extracellular products[J].Fish Dis，2003，26：103-108.

[6] 王斌，于蘭萍，胡亮，等.紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原菌的分離與鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（2）：352-358.

[7] AUSTIN B，AUSTIN D A.Bacterial Fish Pathogens[M]//Diseases of Farmed and Wild Fish，3rdedn（revised）.Springer-Praxis，Godalming，1999.

[8] ANA C G，DAVID G B，MACHAEL R H.Molecular identifiction typing and tracking of Vibro harveyi in aquaculture system：Current methed and future prospects[J].Aquaculture，2009，287：1-10.

[9] ROBERTSON P A W，XU H S，AUSTIN B.An enzyme linked immunoso-rbent assay（ELISA）for the detection of Vibrio haryevi in penaeid shrimp and water[J].Journal of Microbiological Mehtods，1998，34：31-39.

[10] 李強(qiáng)，黃華，張顯昱，等.鮰愛德華菌單克隆抗體的制備及其在黃顙魚“紅頭病”研究中的應(yīng)用[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（4）：323-328.

[11] LI QIANG，JING HONG-LI，LI HUA，et al.Characterization and applic-ation of monoclonal antibodies against Shewanella marisflavi，a novel pathogen of Apostichopus japonicus[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，29（5）：973-980.

[12] 陳昌福，陳超然.魚類三種致病菌的粗脂多糖對(duì)異育銀鯽的免疫原性[J].水生生物學(xué)報(bào)，2002，2（5）：483-488.

[13] 郝貴杰，沈錦玉，徐洋.大黃魚病原哈維氏弧菌單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[J].細(xì)水生生物學(xué)報(bào)，2009，33（3）：413-417.

[14] LIU Hesong，WANG Yue，XIAO Jingfan.An immunochromatographic test strip for rapid detection of fish pathogen Edwardsiella tarda[J].Bioresour-ces and Bioprocessing，2015（2）：20.

[15] 郝貴杰，沈錦玉，潘曉義.抗哈維氏弧菌脂多糖單克隆抗體的制備及其鑒定[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：274-279.