亮甲酚藍優(yōu)選哺乳動物卵母細胞技術研究進展

王俊敏　唐易　張錦

摘要 隨著動物胚胎工程技術的不斷發(fā)展，卵母細胞的需求量不斷增大。卵母細胞的質量決定植入前早期胚胎發(fā)育的效率，為此篩選出優(yōu)質卵母細胞對于提高后續(xù)胚胎的發(fā)育起著決定性的作用。本文就亮甲酚藍染色篩選成熟培養(yǎng)前的卵母細胞，對于卵母細胞質量、后續(xù)胚胎發(fā)育效率和早期胚胎發(fā)育相關基因表達的影響方面的研究予以綜述，期望對于同行有一定的借鑒意義。

關鍵詞 亮甲酚藍；卵母細胞；胚胎發(fā)育；胞質成熟

中圖分類號 S813.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）08-0238-01

Abstract With the continuous development of animal embryo engineering and technology，the demand of oocytes is increasing a lot.Oocyte quality can affect the efficiency of early embryonic development，so it plays a decisive role for subsequent embryonic development through selecting high-quality oocytes.In this paper，the effects of Brilliant Cresol Blue staining（BCB）on further embryo development were reviewed，which included the quality and efficiency of subsequent embryonic development and the influence of gene expression of early embryo.It was expected that it would be helpful for their peers in the early embryo development research fields.

Key words brilliant cresyl blue（BCB）；oocyte；embryo development；cytoplast maturation

生長期的卵母細胞代謝旺盛，含有大量的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH），但是隨著卵母細胞的生長期結束其活性也逐漸降低直至消失，因此卵母細胞成熟時G6PDH的含量很少。卵母細胞經(jīng)過采用亮甲酚藍（BCB）染色，由于G6PDH可以使BCB由原來的藍色變成無色，因此可以分辨出生長期的卵母細胞和成熟的卵母細胞，前者表現(xiàn)為胞質未著色（BCB-），而后者則胞質呈藍色（BCB+）。因此，BCB染色技術已經(jīng)被廣泛用于多種動物卵母細胞的篩選，并取得了很好的效果[1-4]。此外，已有的研究認為，處于生長階段的卵母細胞的發(fā)育能力遠低于成熟期的卵母細胞，因此通過BCB染色技術還能夠間接的評估卵母細胞的質量。通過采用BCB對成熟培養(yǎng)前的豬[1- 2]、山羊[3]、綿羊[5]和牛[6-7]卵母細胞染色用于檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶間接評價優(yōu)選卵母細胞，為后續(xù)研究提供優(yōu)質卵母細胞。有研究發(fā)現(xiàn)未著色的卵母細胞培養(yǎng)成熟后，用于核移植具有更高的體外囊胚發(fā)育率[8- 9]。在動物胚胎生產(chǎn)中，主要從屠宰場采集卵巢，由于挑選的卵母細胞來自不同生長階段的卵泡，導致了卵母細胞質量存在差異。

本文就BCB在篩選成熟培養(yǎng)前的卵母細胞后，對于卵母細胞質量、后續(xù)胚胎發(fā)育效率和早期胚胎發(fā)育相關基因表達的影響方面的研究予以綜述，期望對于動物胚胎工程研究領域的同行有一定的借鑒意義。

1 BCB篩選卵母細胞質量的研究

在BCB篩選小鼠卵母細胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)[10]，BCB+ 組的卵母細胞染色體周圍核仁的數(shù)量較多，并且其胞質成熟較充分（通過GSH水平和線粒體的分布方式），成熟后期具有較好的發(fā)育潛力。這個結論已經(jīng)在很多動物中卵母細胞篩選中得到證實，概述如下。

（1）在BCB篩選牛卵母細胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)：用26、39、52 μmol/L的亮甲酚藍染色后所得到的BCB+組（27.7%、27.6%、31.9%），較13 μmol/L的亮甲酚藍染色后所得到的BCB+ 組（2.1%）差異顯著，而且其BCB染色后，BCB+組的體外成熟率（77.4%）顯著高于BCB- 組（51.3%）和對照組（60.2%）[11]。

（2）在BCB篩選豬卵母細胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)：BCB+ 組卵母細胞的核成熟率（80.8%）顯著高于BCB- 組（44.2%）和空白對照組（72.4%）[12]。此外，在通過BCB染色提高豬體外胚胎培養(yǎng)體系的效率的研究中發(fā)現(xiàn)[13]：BCB+ 組的豬卵母細胞的91.16%已經(jīng)達到減數(shù)分裂Ⅱ期，顯著高于BCB-組（64.10%）和對照組（77.15%）。

（3）在BCB篩選山羊卵母細胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)：BCB+ 和BCB- 組的卵母細胞的平均直徑分別為136.6、125.5 μm，可見BCB+ 組的卵母細胞顯著長于BCB- 組（P<0.001）；BCB+ 和BCB- 組的卵母細胞的體外成熟率分別為81.4%和52.5%，并且BCB+ 組也顯著高于對照組（72.4%）；此外，BCB+組卵母細胞的正常受精率（23.5%）也顯著高于BCB- 組（8.2%） 和對照組（11.9%）[14]。

由此可見，以亮甲酚藍染色為基礎的哺乳動物卵丘—卵母細胞復合體的區(qū)分可以用來有效地選擇更具發(fā)育活力的卵母細胞，為后續(xù)轉基因動物的研究奠定基礎。

2 BCB篩選后早期胚胎發(fā)育效率的研究

在研究BCB對于牛卵母細胞選擇后胚胎進一步的發(fā)育發(fā)現(xiàn)，胞質染藍色的牛體外受精胚胎的囊胚率達到32.99%，而對照組和無色組分別為17.64%和3.57%；同時進一步進行核移植研究發(fā)現(xiàn)，在用BCBG篩選的卵母細胞進行核移植研究發(fā)現(xiàn)[15]：BCB+ 組不僅可以獲得較高的核移植囊胚率，而且其囊胚細胞總數(shù)也顯著高于對照組、控制對照組和BCB- 組[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過BCB篩選能夠顯著降低牛卵母細胞后續(xù)的胚胎發(fā)育細胞凋亡率，BCB+ 組、對照組和BCB- 組的凋亡率分別為6.50%、28.21%、39.06%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，BCB+ 組的孤雌囊胚形成率達到32.9%，而BCB- 組的孤雌囊胚形成率僅為10.1%；BCB+ 組顯微操作核移植胚胎的囊胚發(fā)育率（14.1%）顯著高于BCB- 組（3.4%），但與對照組之間無顯著差異；各組手工克隆胚胎發(fā)育率之間無顯著差異[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，BCB+ 組、對照和BCB- 組孤雌豬胚胎的囊胚率分別為34.19%、23.11%和9.15%，BCB+ 組比BCB- 組顯著高25.04%；BCB+核移植豬胚胎的囊胚率可以達到23.10%，而BCB- 組的囊胚率僅有5.10%。通過對BCB染色的豬卵母細胞的孤雌胚胎和核移植胚胎發(fā)育情況的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，BCB+組孤雌囊胚率和核移植囊胚率分別為34.28%和23.74%，顯著高于BCB- 組（12.25%和6.28%）和對照組（26.52%和17.05%），并且BCB+ 組具有較多的囊胚細胞[17]。

綜上可見，以亮甲酚藍染色為基礎的卵丘—卵母細胞復合體的區(qū)分可以用來有效地選擇更具發(fā)育活力的卵母細胞，其后續(xù)構建的胚胎具有更大的發(fā)育潛力。因此，亮甲酚藍可用于卵母細胞染色的選擇，并作為判斷卵母細胞質量的一個重要標記。

3 BCB篩選后早期胚胎相關基因表達的研究

最近的研究發(fā)現(xiàn)，BCB+ 組卵母細胞的胞質成熟對于受精后正常的胚胎發(fā)育是至關重要的，亮甲酚藍染色液（BCB）能有效篩選出胞質成熟卵母細胞[18]。為進一步了解經(jīng)過 BCB 篩選的卵母細胞中母源基因mRNA表達量的差異性，進而更為準確地評價BCB對卵母細胞篩選的可行性和可靠性，判斷母源基因與卵母細胞的胞質成熟的相關性，為深入了解哺乳動物卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育提供技術手段。經(jīng)過 BCB篩選后對于不同類卵母細胞的母源性物質表達差異研究表明，4種母源基因（Gdf9、Mater、Zar1和Dnmt1）在BCB+卵母細胞中的表達量顯著低于BCB- （P<0.05），說明上述基因的 mRNA表達量可能與卵母細胞的質量呈現(xiàn)負相關關系。此外，研究結果還表明，越接近成熟24 h的綿羊卵母細胞其玻璃化冷凍保存的效果越好，而上述4種基因的mRNA表達量與玻璃化冷凍呈現(xiàn)一定的相關性，可能與卵母細胞質量、體外培養(yǎng)效率呈負相關關系[19]。

綜上所述，亮甲酚藍染色篩選成熟培養(yǎng)前的卵母細胞，可以作為獲取優(yōu)質卵母細胞的一個有效方法，為后續(xù)重構胚胎提供優(yōu)質的卵母細胞，從而提高其胚胎的發(fā)育效率。但是有關BCB篩選卵母細胞后，胚胎后續(xù)發(fā)育過程中有關對于表觀遺傳以及涉及的子代安全性的問題還未見研究性報道，所以需要進一步對亮甲酚藍篩選優(yōu)質卵母細胞的方法進行驗證，確保該篩選優(yōu)質卵母細胞方法的可行性。

4 參考文獻

[1] ERICSSON S A，BOICE M L，F(xiàn)UNAHASHI H，et al.Assessment of por-cine oocytes using brilliant cresyl blue[J].Theriogenology，1993，39（1）：214.

[2] 胡軍和.小分子化合物對豬胚胎體外發(fā)育的影響及iPS嵌合胚胎的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2011.

[3] RODR？魱GUEZ？魣GONZ？譫LEZ E，L-PEZ-B？魪JAR M，VELILLA E，et al.Selection of prepubertal goat oocytes using the brilliant cresyl blue test[J].Theriogenology，2002，57（5）：1397-1409.

[4] RODR？魱GUEZ？魣GONZ？譫LEZ E，L-PEZ-BEJAR M，IZQUIERDO D，et al.Developmental competence of prepubertal goat oocytes selected with brilliant cresyl blue and matured with cysteamine supplementation[J].Reproduction Nutrition Development，2003，43（2）： 179-187.

[5] URDANETA A，JIM？魪NEZ-MACEDO A R，IZQUIERDO D，et al.Sup-plementation with cysteamine during maturation and embryo culture on embryo development of prepubertal goat oocytes selected by the brilliant cresyl blue test[J].Zygote，2004，11（4）：347-354.

[6] 曹澤磊.BCB染色法篩選牛卵母細胞的初探[D].楊凌： 西北農(nóng)林科技大學，2009.

[7] ALM H， TORNER H，L？魻HRKE B，et al.Bovine blastocyst development rate in vitro is influenced by selection of oocytes by brillantcresyl blue staining before IVM as indicator for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity[J].Theriogenology，2005，63（8）：2194-2205.

[8] BHOJWANI S，ALM H，TORNER H，ET AL.Slection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer[J].Theriogenology，2007，67（2）：341-345.

[9] MANJUNATHA B M，GUPTA P S，DEVARAJ M，et al.Selection of dev-elopmentally competent buffalo oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM[J].Theriogenology，2007，68（9）：1299-1304.

[10] WU Y G， DA ROSA BRAGA B L，SANDI-MONROY N L，et al.Selec-tion of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining：a study using the mouse model[J].Cell Research，2007，17（8）：722-731.

[11] 王士勇， 楊月春，鄭軍軍，等.亮甲酚藍染色對牛卵母細胞體外成熟的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（2）：82-85.

[12] 蘇克同，盧克煥，盧晟盛.亮甲酚藍篩選對廣西巴馬小型豬孤雌激活及克隆重構胚早期發(fā)育的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43：1218-1222.

[13] 田江天，王振坤，鄭重，等.利用亮甲酚藍染色篩選優(yōu)質豬卵母細胞[J].解剖學報，2009（2）：340-343.

[14] 王彥博.山羊卵母細胞成熟期間葡萄糖代謝作用對卵母細胞胞質成熟的影響[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2011.

[15] 曹澤磊， 蘇建民，胡廣衛(wèi)，等.亮甲酚藍染色法篩選卵母細胞對牛體細胞克隆胚體外發(fā)育的影響[J].動物醫(yī)學進展，2009，30（9）：24-28.

[16] 喬利敏， 李向臣，馬月輝.亮甲酚藍染色對牛未成熟卵母細胞體外成熟與體外受精的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2009，21：20-24.

[17] 郭云云.亮甲酚藍染色分選后的豬卵母細胞體外發(fā)育能力的鑒定[D].沈陽：東北農(nóng)業(yè)大學，2012.

[18] SU Jianmin，WANG Yongsheng，LI Ruizhe，et al.Oocytes Selected Using BCB Staining Enhance Nuclear Reprogramming and the In Vivo Devel-opment of SCNT Embryos in Cattle[J].PLoS ONE，2012，7（4）：36181.

[19] 王靜，石慶華，林嘉鵬，等.BCB篩選后的綿羊卵母細胞中母源基因 mRNA表達量的差異性分析[J].中國草食動物，2010，30：5-9.