蘋果、柑橘和梨中滅幼脲殘留量測(cè)定及其在貯藏期間變化研究

代艷娜

摘要 研究蘋果、柑橘和梨中滅幼脲殘留吸收與貯藏溫度、儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系。蘋果、柑橘和梨經(jīng)滅幼脲溶液浸泡處理后在室溫或冷藏條件下儲(chǔ)存，然后定期進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）測(cè)定。結(jié)果表明：方法回收率為87.86%～103.4%，檢出限為0.06 ng/mL，定量限為0.2 ng/mL，線性范圍為1～500 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)0.996，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.2%～7.5%。蘋果、柑橘和梨在室溫條件下貯藏對(duì)滅幼脲的吸收高于低溫，果皮滅幼脲殘留水平隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，果肉殘留水平隨著貯藏時(shí)間先上升后下降且果皮的殘留水平高于果肉。

關(guān)鍵詞 水果；滅幼脲；電噴霧電離；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號(hào) S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）08-0114-03

Abstract To study the relationship between the residual absorption of chlorbenzuron and storage temperature and storage time，the apples，oranges and pears with a dipping treatment were stored at room temperature or at 0～4 ℃，then chlorbenzuron residue levels with LC-MS/MS were determined.The average recoveries ranged from 87.86% to 103.4% with a RSD between 2.2 % to 7.5%.The results showed that the limit of detection and the quantitation limit was estimated to be 0.06 ng/mL and 0.2 ng/mL respectively under the optimal conditions，the linear ranges were 1～500 ng/mL while the relative coefficient was 0.996.The residue levels showed that less absorption at 0～4 ℃，and the residual level in peel decreased with the prolonging of storage time，while the residual level in pulp increased first and then decreased with the prolonging of storage time.The residual level in peel was higher than that in pulp.

Key words fruits；chlorbenzuron；electrospray ionization；LC-MS/MS

近些年，果農(nóng)在防治蘋果、柑橘、梨等果樹的金紋細(xì)蛾、梨星毛蟲、梨小食心蟲、蘋果舟蛾、卷葉蛾、柑橘木虱等害蟲時(shí)使用劇毒農(nóng)藥，并加大藥量和藥次，不僅殺傷大量天敵，而且使得害蟲的抗藥性大大提高，形成惡性循環(huán)，無(wú)公害農(nóng)藥滅幼脲的成功研發(fā)在很大程度上解決了這個(gè)問題[1]。滅幼脲（chlorbenzuron），又名滅幼脲Ⅲ號(hào)、蘇脲Ⅰ號(hào)、一氯苯隆，是1976年由江蘇省激素研究所和蘇州大學(xué)首先合成的一種苯甲酰脲類的殺蟲劑，化學(xué)名稱1-鄰氯苯甲?；?3-（4-氯苯基）脲，分子式C14H10Cl2N2O2，CAS號(hào)：57160-47-1，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，它對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)蓄積毒性[2]，易光解[3]，易被微生物降解[4-5]，是一種廣譜、高效、高選擇性、低毒低殘留的綠色農(nóng)藥[6]，且對(duì)多種果樹害蟲的防治效果十分顯著[7-8]。

目前，滅幼脲在蘋果、柑橘中殘留檢測(cè)已有報(bào)道[9-10]，但并未見梨中滅幼脲殘留的相關(guān)研究。且滅幼脲殘留的檢測(cè)氣相色譜法（GC）和液相色譜法（HPLC）[10-12]較為常見，而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測(cè)滅幼脲殘留鮮見報(bào)道，與GC和HPLC相比，HPLC-MS/MS具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763-2014）規(guī)定了滅幼脲在谷物和蔬菜中的最高殘留限量（MRL）均為3 mg/kg，但并未有水果的最高殘留限量規(guī)定，本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)滅幼脲在蘋果、柑橘和梨中的殘留吸收和其在貯藏期間的變化規(guī)律進(jìn)行研究，以為蘋果、柑橘和梨3種水果中的安全殘留量和貯藏方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津公司的Shimadzu LC-20AD液相色譜系統(tǒng)（包括二元梯度泵、真空在線脫氣機(jī)、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器）；美國(guó)AB SCIEX公司的API 3200 Qtrap三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配置TurbolonS-prap離子源、HARVARD pumpⅡ針泵及安裝Analyst軟件的計(jì)算機(jī)）；日本資生堂的CAPCELL PAK C18色譜柱（規(guī)格：100 mm×2.0 mm×5 μm）；德國(guó)BRAUN公司的CombiMax K600型蔬菜粉碎機(jī)；德國(guó)IKA公司的T18型勻漿機(jī)；滅幼脲標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97.7%），購(gòu)置于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷均為進(jìn)口色譜純；氯化鈉為分析純；0.22 μm有機(jī)系濾膜；超純水由美國(guó)Millipore公司的Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g滅幼脲標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃儲(chǔ)藏備用。②標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取出100 μL 滅幼脲的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋至10 mL的容量瓶中，配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。③標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇稀釋成濃度為0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，以定量離子色譜圖中的峰面積進(jìn)行定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品預(yù)處理方法。①樣品制備。市場(chǎng)上購(gòu)買新鮮蘋果、柑橘和梨樣品，分別用50 μg/mL的滅幼脲溶液浸泡2 min后自然風(fēng)干，紙箱包裝后分別在常溫（15～25 ℃）和低溫（0～4 ℃）下貯藏。每5 d制備1次待測(cè)樣品，共制備5次，同時(shí)以同一批購(gòu)買的未經(jīng)浸泡的蘋果、柑橘和梨樣品作對(duì)照。制備樣品時(shí)，取3個(gè)果實(shí)，蘋果和梨削皮（約1 mm厚度），柑橘直接剝皮。果皮用蔬菜粉碎機(jī)粉碎，混勻；果肉可食部分切塊，充分混勻后用四分法分樣，然后粉碎機(jī)粉碎，每次每種水果的果皮和果肉均制備3個(gè)平行樣。②樣品提取與凈化。稱取樣品10.0 g（精確到0.01 g）于100 mL離心管中，加入25 mL二氯甲烷-石油醚（1∶1），勻漿機(jī)高速勻漿2 min，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至250 mL雞心瓶中，殘?jiān)偌尤?5 mL二氯甲烷-石油醚（1∶1），重復(fù)提取，合并2次上清液，40 ℃水浴蒸發(fā)約至1 mL，氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇∶水（V∶V=1∶1）渦旋10 s，再加入1 mL正己烷，渦旋30 s，靜置分層，取下層溶液過0.22 μm有機(jī)系濾膜后，待上機(jī)。

1.3 LC-MS/MS條件

1.3.1 色譜條件。色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱（規(guī)格：100 mm×2.0 mm×5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；平衡時(shí)間0.5 min；流動(dòng)相為甲醇∶水=25∶75（V∶V）。

1.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；離子源電壓5.0 kV；離子源溫度為 500 ℃；氣簾氣、霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?，其中氣簾氣壓?.14 mPa；霧化氣壓力0.48 mPa，輔助氣壓力0.34 mPa；駐留時(shí)間為50 ms；定量測(cè)定采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），其MRM條件如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于滅幼脲在弱酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，試驗(yàn)考察了甲醇-水、甲醇-水-0.1%甲酸、甲醇-水-5 mmol/L乙酸胺的流動(dòng)相體系，結(jié)果表明：甲醇-水體系色譜峰響應(yīng)較低，甲醇-水-乙酸胺體系出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，甲醇-水-甲酸體系峰形較好，響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，故本試驗(yàn)選擇甲醇-水-0.1%甲酸體系作為流動(dòng)相。

2.2 提取溶劑選擇

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，不同樣品中滅幼脲采用不同溶劑進(jìn)行提取，提取溶劑有乙腈-水、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-石油醚、乙酸乙酯-環(huán)己烷等，不同溶劑的提取對(duì)回收率的影響不同，本試驗(yàn)對(duì)提取溶劑做了優(yōu)化選擇，具體如表2所示?？梢钥闯鰩追N溶劑體系回收率都比較好，但發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水體系時(shí)部分樣品發(fā)生乳化，二氯甲烷-丙酮體系雜質(zhì)峰較多，考慮到溶劑毒性大小，選擇二氯甲烷-石油醚體系提取樣品中的滅幼脲。

2.3 凈化條件優(yōu)化

試驗(yàn)分別考察了氨基柱、中性氧化鋁柱、酸性氧化鋁柱、不過柱4種凈化條件對(duì)滅幼脲回收率的影響，結(jié)果如表3 所示?？梢钥闯?，在0.1 mg/kg的添加水平下，使用小柱凈化樣品過程中可能造成組分流失，滅幼脲回收率偏低，因此最終選擇二氯甲烷-石油醚提取，40 ℃氮?dú)獯蹈珊笾苯蛹尤爰状肌盟?∶1）稀釋，再用正己烷脫色后直接過膜上機(jī)。

2.4 樣品色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

在優(yōu)化條件下對(duì)蘋果、柑橘和梨樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，樣品色譜圖如圖2所示。

分別配制成濃度為0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述優(yōu)化條件用LC-MS/MS測(cè)定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)做圖，每個(gè)濃度測(cè)3次，得到滅幼脲直線回歸方程為y=3.98x-9.42×103，r=0.996；結(jié)果表明：滅幼脲在1～500 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，滿足定量分析的需要。在樣品中做加標(biāo)回收，按照上述前處理方法，在同樣的儀器條件下進(jìn)樣檢測(cè)，按照3倍信噪比計(jì)算本方法的檢出限為0.06 ng/mL，按照10倍信噪比計(jì)算本方法的定量限為0.2 ng/mL。

2.5 方法的精密度和回收率

取空白的蘋果、柑橘和梨樣品各10.0 g，分別添加滅幼脲0.01、0.05、0.10 μg/mL 3個(gè)水平，3次重復(fù)，按照上述前處理方法和儀器條件測(cè)定方法回收率，結(jié)果如表4所示。

2.6 樣品貯藏期間果皮和果肉中滅幼脲殘留量的變化

試驗(yàn)考察了常溫和低溫貯藏條件下3種水果樣品中滅幼脲的殘留變化（圖3、4），結(jié)果表明，同一批經(jīng)浸泡處理的水果的果皮中滅幼脲的殘留量高于果肉；常溫貯藏的水果樣品果皮殘留量隨著貯藏時(shí)間增長(zhǎng)逐漸降低，果肉中滅幼脲殘留量先增加后降低；低溫貯藏水果的果皮殘留量高于同批制備的常溫貯藏水果樣品的果皮，但果肉中滅幼脲殘留量均低于同批制備的常溫貯藏水果樣品的果肉。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了各試驗(yàn)條件，建立了二氯甲烷-石油醚提取，甲醇-水稀釋，正己烷脫色的LC-MS/MS方法測(cè)定蘋果、柑橘和梨中滅幼脲殘留，方法前處理簡(jiǎn)單，回收率和檢出限均能滿足分析要求。同時(shí)，研究了3種水果的果皮和果肉中滅幼脲隨貯藏時(shí)間的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)蘋果、柑橘和梨在室溫條件下貯藏對(duì)滅幼脲的吸收高于低溫且果皮的殘留水平高于果肉，為水果的貯藏和安全食用提供了參考。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 李普超.新一代無(wú)公害特異殺蟲劑：滅幼脲[J].山西林業(yè)，1996（2）：32.

[2] 苗建才.滅幼脲類殺蟲劑防治森林害蟲的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技，1989， 25（6）：536-541.

[3] 劉國(guó)光，金祖亮，徐曉白.滅幼脲（Ⅲ）在模擬大氣條件下光解行為的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1992，12（2）：200-208.

[4] SEUFERER S L.Metabolism of Diflubenzuron by Soil Microorganisms and Mutagenicity of the Metabolites[J].Pesticide Biochemistry And Phys-iology，1979（10）：174-180.

[5] 施國(guó)涵.土壤微生物對(duì)滅幼脲 3 號(hào)殺蟲劑代謝作用的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1990，10（3）：296-302.

[6] 胡笙，耿賀利，趙日瑾.殺蟲劑應(yīng)用概況[J].昆蟲知識(shí)，1989，26（4）：242 -247.

[7] 張小英.無(wú)公害農(nóng)藥滅幼脲3號(hào)在蘋果害蟲防治中的效果試驗(yàn)[J].甘肅林業(yè)，2015（5）：38-39

[8] 梁若霞.滅幼脲在果樹上的使用技術(shù)[J].河北果樹，2013（1）：55-56.

[9] 毛江勝，趙善倉(cāng)，孟靜靜，等.蘋果及其土壤中滅幼脲的殘留檢測(cè)與消解動(dòng)態(tài)研究[J].食品科學(xué)，2009，30（8）：194-196.

[10] 張?jiān)?，林靖凌，呂岱竹，?超高效液相色譜測(cè)定柑橘中的虱螨脲、滅幼脲和氟啶脲[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2014，13（6）：14-43.

[11] 薛健.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)配制劑中的滅幼脲、抗蚜威、三唑酮[J].農(nóng)藥，2000，39（2）：19-20.

[12] 黃永春，王繼軍，傅學(xué)起，等.SPE-HPLC測(cè)定黃瓜中除蟲脲滅幼脲和殺鈴脲的殘留檢測(cè)方法[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（3）：615-618.