光照敏感型新梢白化茶新品種‘御金香’春梢化學(xué)成分研究

李　明　張龍杰　石　萌　林小明　王開榮　鄭新強(qiáng)　陸建良　梁月榮*

(1.余姚市林業(yè)特產(chǎn)技術(shù)推廣總站，余姚 315499； 2.寧波黃金韻茶業(yè)科技有限公司，余姚 315400；3.浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江 杭州 310058； 4.寧波市森林病蟲防治檢疫站，寧波 315000)

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光照敏感型新梢白化茶新品種‘御金香’春梢化學(xué)成分研究

李明1張龍杰2石萌3林小明3王開榮4鄭新強(qiáng)3陸建良3梁月榮3*

(1.余姚市林業(yè)特產(chǎn)技術(shù)推廣總站，余姚 315499； 2.寧波黃金韻茶業(yè)科技有限公司，余姚 315400；3.浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江 杭州 310058； 4.寧波市森林病蟲防治檢疫站，寧波 315000)

用HLPC法檢測了光照敏感型新梢白化茶品種‘御金香’春梢生物堿、兒茶素類、氨基酸類和光合色素類化合物含量，并以溫度敏感型新梢白化茶品種‘白葉1號(hào)’和常規(guī)茶樹品種‘福鼎大白茶’為對照。結(jié)果顯示，‘御金香’咖啡堿和可可堿含量顯著高于‘福鼎大白茶’和‘白葉1號(hào)’；兒茶素類總含量顯著低于‘福鼎大白茶’和‘白葉1號(hào)。光照敏感新梢白化茶‘御金香’和溫度敏感型新梢白化茶‘白葉1號(hào)’的氨基酸含量顯著高于‘福鼎大白茶’，但葉綠素a和葉綠素b、β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質(zhì)等光合色素含量顯著低于‘福鼎大白茶’。‘御金香’呈現(xiàn)黃色葉片的白化現(xiàn)象主要是因?yàn)槿~綠素含量低，而并非類胡蘿卜素含量高所致。

茶樹；光照敏感；品質(zhì)成分; 新梢白化；葉綠素；類胡蘿卜素

茶樹新梢白化品種有光照敏感型和溫度敏感型兩大類[1-2]。‘御金香’是光照敏感型新梢白化茶品種之一[3]，在強(qiáng)光照條件下新梢葉片因缺乏葉綠素而呈現(xiàn)黃白色；其特點(diǎn)與其它新梢白化茶品種一樣，具有多酚類含量適中，氨基酸含量高，加工綠茶滋味鮮爽醇和，是開發(fā)名優(yōu)綠茶的有優(yōu)良品種[4-5]。雖然‘御金香’品種對夏季高溫強(qiáng)光的抵御能力明顯高于同類品種的‘黃金芽’，但其幼苗期仍然存在光合作用能力較弱，新建茶園移栽初期對管理要求高等問題[6-7]。針對‘御金香’茶樹品種的生物學(xué)特性，本研究以‘低溫誘導(dǎo)新梢白化茶品種‘白葉1號(hào)’和常規(guī)茶樹品種‘福鼎大白茶’為參照，分析比較春季一芽二葉新梢的生物堿、兒茶素類、氨基酸類和光合色素類化合物含量，以期進(jìn)一步了解‘御金香’品種的化學(xué)特性，分析光照敏感型新梢白化茶品種產(chǎn)生白化現(xiàn)象的生物化學(xué)機(jī)理；同時(shí)為開發(fā)‘御金香’茶樹品種的配套栽培技術(shù)措施提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試茶樹品種為寧波黃金韻茶業(yè)科技有限公司茶園的3年生光照敏感型新梢白化茶品種‘御金香’、對照品種為同期移栽的溫度敏感型新梢白化茶品種‘白葉1號(hào)’和常規(guī)茶樹品種‘福鼎大白茶’。于2016年4月18日采摘一芽二葉新梢，然后將樣品分成兩部分，一部分用于茶葉品質(zhì)成分(生物堿、兒茶素類、氨基酸類化合物)測定，用700W微波爐高溫殺青30秒，在80℃烘12 h至干燥，用植物粉碎機(jī)粉碎并過24目篩，4℃冷藏備用；另一部分用于光合色素類檢測，冷凍于液氮中取回實(shí)驗(yàn)室保存于-70℃?zhèn)溆?。檢測時(shí)測定茶葉含水量，方法是110℃恒重法[8]。

1.2生物堿和兒茶素類測定

將上述磨碎樣(0.15 g)置于放有25 mL 50%酒精溶液的50 mL離心管并蓋緊，在70℃恒溫水浴提取30min，期間每隔每10 min振搖一次；提取完成后取出冷卻至室溫，在4℃和15984 ×g離心10 min，吸取上清液用于HPLC檢測。

生物堿和兒茶素類含量檢測使用本研究室開發(fā)的HPLC法，儀器為‘島津’LC-20AD型HPLC，色譜柱為‘安捷倫’TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)。HPLC條件：進(jìn)樣量10 μL，柱溫35℃；流動(dòng)相有A、B兩種，A為乙腈/乙酸/水 (6/1/193，v/v/v)， B為乙腈/乙酸/水(60/1/139，v/v/v)；由80%A/20%B在35min內(nèi)線性洗脫至35%A/65%B，流速1 mL/min；監(jiān)測波長為280 nm。根據(jù)3種茶葉生物堿和8種茶葉兒茶素類化合物標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA公司產(chǎn)品)的保留時(shí)間和峰面積分別定性和定量。圖1為‘御金香’生物堿和兒茶素類HPLC圖。

圖1　‘御金香’兒茶素類和咖啡堿HPLC

1.3氨基酸類化合物測定

柱前反應(yīng)劑制備：以2,4二硝基氟苯(DNFB)為柱前反應(yīng)劑，將DNFB (1.00 g)溶解于100 mL乙腈，保存于棕色瓶作為貯備液，用封口膜密封，4℃冷藏。

標(biāo)準(zhǔn)氨基酸試液制備：用0.1 M NaOH試劑溶解天冬氨酸、半胱氨酸和酪氨酸(5 mg/mL左右)；用0.1 M HCl試劑溶解谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、精氨酸、脯氨酸、茶氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、頡氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸(5 mg/mL左右)；根據(jù)本研究室以往對茶葉氨基酸檢測發(fā)現(xiàn)的主要氨基酸取適量19種氨基酸以及茶氨酸儲(chǔ)備液混合后制成氨基酸混標(biāo)，并依次稀釋成5個(gè)濃度梯度。

柱前反應(yīng)：取上述茶葉提取液或者氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物的混合標(biāo)準(zhǔn)液180 μL，加1%DNFB貯備液100 μL、0.5 M NaHCO3溶液100 μL(pH 9.0)、ddH2O 20 μL，封口膜密封，漩渦震蕩混勻，黑暗條件下60℃保溫1 h，冷卻至室溫；再加入0.01 M KH2PO4水溶液400 μL(pH 7.0)，搖勻后靜置15 min；經(jīng)0.22 μm Millipak過濾器過濾，用于HPLC檢測。

HPLC檢測：檢測設(shè)備為‘島津’LC-20AD型HPLC，色譜柱為‘安捷倫’TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)。HPLC條件：進(jìn)樣量20 μL，柱溫35℃；流動(dòng)相有A和B兩種，A為5 mM NaAc (pH 5.7)和四氫呋喃混合液(95/5，v/v)， B為甲醇和水混合液(80/20，v/v)，流速1 mL/min，按照表1所示梯度洗脫；監(jiān)測波長360 nm。

表1　氨基酸HPLC檢測梯度洗脫條件

1.4光合色素檢測

將冷凍鮮葉(0.20g)在研缽與0.10 g PVPP、10 mL預(yù)冷丙酮及其適量石英砂在冰浴上研磨，勻漿轉(zhuǎn)移至2 mL離心管在4℃和15984 ×g下離心10 min，上清液用于HPLC檢測。

檢測方法為HPLC法[9]，檢測設(shè)備是日本‘島津’LC-20AD型 HPLC，色譜柱為‘安捷倫’TC-C18(5 μm，4.6×150 mm)；HPLC條件：進(jìn)樣量20 μL，柱溫35℃；流動(dòng)相由A和B兩種組成，A為乙腈/乙酸/水混合液(6/1/193，v/v/v)，B為乙腈/甲醇/氯仿混合液(15/4/1，v/v/v)，線性梯度洗脫，最初20 min流動(dòng)相B從80%線性增加至100%，保持15 min，隨后將B從100%在5 min內(nèi)線性降低至80%；流動(dòng)相流速1 mL/min；檢測波長440 nm。定性和定量用的色素標(biāo)準(zhǔn)品為葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素、黃體素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)(SIGMA公司產(chǎn)品)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間和峰面積分別定性和定量。

1.5結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本研究測試的樣本數(shù)n=2，以“算數(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示測試結(jié)果；試驗(yàn)樣本平均數(shù)分別與‘福鼎大白茶’和‘百葉1號(hào)’的平均數(shù)比較，采用T測驗(yàn)法，P<0.05時(shí)，標(biāo)示為差異顯著。

2　結(jié)果和討論

2.1生物堿和兒茶素類含量比較

在‘御金香’春梢中檢出咖啡堿、可可堿和茶堿3種生物堿，在‘白葉1號(hào)’和‘福鼎大白茶’中檢出咖啡堿和可可堿2種生物堿(表2)。三種生物堿的含量水平高低依次為：咖啡堿>可可堿>茶堿。品種間生物堿含量差異顯著，表現(xiàn)為‘御金香’的咖啡堿和可可堿含量顯著高于‘白葉1號(hào)’和‘福鼎大白茶’。在檢出的8種兒茶素類化合物中，EGCG含量最高，其次為EGC 和ECG，C和CG的含量最低，3個(gè)品種的趨勢相同(表2)。品種間比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，‘御金香’的兒茶素類總含量顯著低于‘白葉1號(hào)’和 ‘福鼎大白茶’；從兒茶素類單體分析，‘御金香’的EGC顯著低于‘白葉1號(hào)’和 ‘福鼎大白茶’，EGCG與‘白葉1號(hào)’相當(dāng)(表2)。說明‘御金香’總兒茶素類含量低的原因是因?yàn)镋GC含量水平低所致。

表2　茶葉兒茶素類組成和咖啡堿含量比較 (mg/g)

*與‘福鼎大白茶’比較差異顯著(P<0.05)；Δ與‘白葉1號(hào)’比較差異顯著(P<0.05)；a：TC=Total catechins (兒茶素類總含量)；ND：未檢出。

2.2茶葉游離氨基酸類化合物含量比較

雖然用了19種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行鑒定，但在供試樣品中僅檢出9種游離氨基酸類化合物，其它未檢出氨基酸可能是因?yàn)楹刻偷木壒?。在檢出的氨基酸化合物中，茶氨酸含量水平最高，其次為谷氨酸和天門冬氨酸；γ-氨基丁酸含量最低，3個(gè)品種表現(xiàn)趨勢一致(表3)。氨基酸總含量是新梢白化茶品種‘御金香’和‘白葉1號(hào)’顯著高于常規(guī)品種‘福鼎大白茶’；從氨基酸組成方面分析，‘御金香’和‘白葉1號(hào)’的茶氨酸含量分別占氨基酸總含量的41.0%和42.1%，而‘福鼎大白茶’的該比例為46.7%。可能是因?yàn)樾律野谆杵贩N的總氨基酸含量高，而茶氨酸卻不是按比例上升，以致茶氨酸占總氨基酸的比例低于常規(guī)品種。

表3　茶葉氨基酸類化合物組成比較(mg/g)

*與‘福鼎大白茶’比較差異顯著(P<0.05)；Δ與‘白葉1號(hào)’比較差異顯著(P<0.05)。

2.3光合色素含量比較

植物光合色素除了葉綠素a和葉綠素b以外，還有類胡蘿卜素，因?yàn)樗麄冊诠饽懿东@和光淬滅中發(fā)揮作用。類胡蘿卜素又有含氧的葉黃素類(如黃體素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)等)和不含氧的胡蘿卜素類(如α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等)。不同光合色素對光輻射的吸收波長存在差異，葉綠素吸收紅光和藍(lán)紫光，類胡蘿卜素吸收藍(lán)紫光。不同植物由于生存環(huán)境不同，光合色素組成存在差異。一般蔭生植物葉片含有較高的類胡蘿卜素，有利于在弱光環(huán)境下吸收較多的藍(lán)紫光并轉(zhuǎn)遞給葉綠素進(jìn)行光合作用，使其在弱光條件下仍然具有較高的光合作用能力。

在被測的茶葉光合色素中，葉綠素a含量最高，葉綠素b次之；紫黃質(zhì)含量最低；β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質(zhì)居中(表4)。品種之間，‘御金香’和‘白葉 1號(hào)’的葉綠素a和葉綠素b、β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質(zhì)含量顯著低于‘福鼎大白茶’；‘御金香’的紫黃質(zhì)含量顯著高于‘白葉1號(hào)’和‘福鼎大白茶’。該結(jié)果顯示，葉綠素含量低是導(dǎo)致‘御金香’和‘白葉1號(hào)’新梢葉片白化的根本原因。‘御金香’的β-胡蘿卜素、黃體素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)等呈現(xiàn)黃色的色素含量高于‘白葉1號(hào)’，這就解釋了為什么兩類新梢白化茶樹品種中，溫度敏感型新梢白化茶‘白葉1號(hào)’葉色呈現(xiàn)白色，而光照敏感型新梢白化茶‘御金香’的葉色則是黃色的。葉色黃色的‘御金香’的β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質(zhì)含量或者類胡蘿卜素總含量仍然低于葉色綠色的常規(guī)品種‘福鼎大白茶’，說明‘御金香’的黃葉性狀主要是葉綠素含量低所致，并非因?yàn)轭惡}卜素含量高造成。

植物生長需要捕獲光能進(jìn)行光合作用合成碳水化合物，但光照強(qiáng)度如果高于植物光合作用的光飽和點(diǎn)時(shí)，植物有可能發(fā)生光抑制[10]，嚴(yán)重時(shí)使葉片升溫對植株造成傷害。此時(shí)植物體內(nèi)的光合器官必須具有自衛(wèi)的功能，啟動(dòng)其光保護(hù)機(jī)制，通過熱耗散途徑等散耗多余的光輻射，避免強(qiáng)光脅迫引起溫度上升造成的傷害[11]。類胡蘿卜素除了具有協(xié)助葉綠素捕光的功能以外，還在保護(hù)植物免受光脅迫傷害發(fā)揮特殊作用。如葉黃素類是結(jié)合于光系統(tǒng) 的捕光色素復(fù)合體(LHCⅡ)的一類色素[12]，其中黃體素可以直接行使熱耗散的功能[13]。表4顯示，‘御金香’的黃體素等含量明顯低于‘福鼎大白茶’，可能是其在夏季高溫強(qiáng)光條件下容易受到強(qiáng)光脅迫傷害的原因。為了提高光照敏感型新梢白化茶品種抵御夏季高溫強(qiáng)光的能力，在品種篩選中應(yīng)該把類胡蘿卜素，尤其是葉黃素類含量作為篩選指標(biāo)，培育黃體素等葉黃素含量高的品種，增強(qiáng)茶樹抗性，提高移栽成活率。

表4　茶葉色素類化合物含量比較 (μg/g，干重)

*與‘福鼎大白茶’比較差異顯著(P<0.05)；Δ與‘白葉1號(hào)’比較差異顯著(P<0.05)。

1王開榮,梁月榮,李明,張龍杰. 白化茶骨干親本及其家系種質(zhì)性狀分析. 茶葉, 2015, 41: 130-132.

2王開榮,李明,張龍杰,梁月榮. 白化茶種質(zhì)資源分類研究. 茶葉, 2015, 41: 126-129.

3王開榮,韓震,梁月榮,張龍杰,李明,王盛彬. 黃色白化茶樹新品種“御金香”選育研究. 中國茶葉, 2013(6)：24-25.

4李明,張龍杰,王開榮,梁月榮,沈立銘,王盛彬,陸建良.光照敏感型白化茶新品種“黃金芽”白化特性研究. 茶葉, 2008, 34: 98-101.

5韓震,王開榮,鄧隆,李明,張龍杰.白化茶樹新品系-黃金斑. 茶葉, 2013, 39: 125-126.

6王開榮,李娜娜,陸建良,鄭新強(qiáng),梁月榮,韓震,張龍杰. 遮光對茶樹品種“黃金芽”葉片基因表達(dá)譜的影響. 茶葉, 2012, 38: 229-232.

7邵淑宏,王開榮,林晨,葉倩,梁月榮. 茶氨酸制備和檢測研究進(jìn)展. 茶葉, 2009, 35:145-159..

8董尚勝,翁蔚,查森俊,童啟慶. 復(fù)火對杜仲茶品質(zhì)成分的影響. 浙江大學(xué)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2000, 26(5)：571-572.

9Li NN，Yang YP，Ye JH，Lu JL，Zheng XQ，Liang YR.Effects of sunlight on gene expression and chemical composition of light-sensi-tive albino tea plant.Plant Growth Regulation，2016，78: 253-262.

10Anderson JM，Park YI，Chow WS.Photoinactivation and photoprotection of phtosystem Ⅱ in nature.Physiologia Plantarum，1997，100: 214-223.

11Niyogi KK.Photoprotection revisited: Genetic and molecular approaches.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1999，50: 333-359.

12Ruban AV，Young AJ，Pascal AA，Horton P.The effects of illumination on the xanthophylls composition of thephotosystem-Ⅱ light-harvesting complexes of spinach thylakoid membranes.Plant Physiology，1994，104:227-234.

13Baroli I M，Do A D，Niyogi K K.Suppression of the light sensitivity of a zeaxanthin- and lutein-deficient mutant of Chlamydomonas reinhardtii: Zeaxanthin is sufficient for protection from high light stress.Photosynthesis Research，69(1-3): 24.

Chemical composition of spring shoots in light-sensitive albino tea cultivar ‘Yujinxiang’

LI Ming1，ZHANG Longjie2，SHI Meng3，LIN Xiaoming3，WANG Kairong4，ZHENG Xinqiang3，LU Jianliang3，LIANG YueRong3*

(1.General Station of Forestry Speciality Technology Extension of Yuyao City，Yuyao 315499;2.Ningbo Huangjinyun Tea Science and Technology Co.，Ltd，Yuyao 315400;3.Tea Research Institute，Zhejiang University，Hangzhou 310058;4.Prevention and Quarantine Station of Forest Diseases and Pests of Ningbo City，Ningbo 315010)

Contents of alkaloid，catechins，amino acids and photosynthetic pigments in spring shoots of light-sensitive albino tea cultivars ‘Yujinxiang’ were determined by HPLC，with a temperature-sensitive albino tea cultivar ‘Baiye-1’and a normal tea cultivar ‘Fudingdabai’ as controls.The results showed that the cultivar ‘Yujinxiang’ had significantly higher levels of caffeine and theobromine，but significantly lower level of catehicns than cultivars ‘Baiye-1’ and ‘Fudingdabai’.The light-sensitive albino cultivar ‘Yujinxiang’ and temperature-sensitive albino cultivar ‘Baiye-1’ had significantly higher level of amino acids，but significantly lower levels of chlorophylls (chlorophyll a and chlorophyll b) and carotenoid (β-carotene，lutein and neoxanthin) than the normal tea cultivar ‘Fudingdabai’.The phynotype with yellow leaves in light-sensitive albino tea cultivar ‘Yujinxiang’ was induced by significant decrease in chlorophylls，instead by increase in carotenoid.

Camelliasinensis; light sensitivity; quality related components; albino shoots; chlorophylls; carotenoid

2016-06-27

寧波市重大科技項(xiàng)目(2014C10008)和浙江省茶樹農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2012C12905)。

李明(1970年-)，高級(jí)工程師，從事茶葉技術(shù)推廣工作。*

yrliang@zju.edu.cn.

Q948.112+1；Q5

A

0577-8921(2016)03-146-04