Nfic基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與miR-20a靶向關(guān)系的驗(yàn)證

王珊，李曉霞，周杰，王寶利△

Nfic基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與miR-20a靶向關(guān)系的驗(yàn)證

王珊1，2，李曉霞2，周杰1，王寶利1△

目的構(gòu)建核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）基因3′非編碼區(qū)（3′UTR）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證microRNA-20a（miR-20a）與其潛在靶基因Nfic的靶向關(guān)系。方法通過microRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan獲取miR-20a與Nfic基因3′UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；PCR擴(kuò)增出Nfic基因3′UTR序列，將此序列克隆至熒光素酶報(bào)告載體pMIR-Report Luciferase；將重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-20a mimics（實(shí)驗(yàn)組）或NC mimics（對照組）共同轉(zhuǎn)染293-AD細(xì)胞，收集細(xì)胞后通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測2組細(xì)胞的熒光素酶活性，從而對Nfic與miR-20a的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系進(jìn)行鑒定。將miR-20a mimics和NC mimics分別轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2，裂解細(xì)胞提取蛋白后采用Western blotting檢測NFIC蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果構(gòu)建的重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示，與對照組相比，miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性（P＜0.05）；Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，ST2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后NFIC蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)論成功構(gòu)建了Nfic基因3′UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR，抑制其熒光素酶活性。

微RNAs；3′非翻譯區(qū)；miR-20a；Nfic；骨髓基質(zhì)細(xì)胞系；熒光素酶報(bào)告基因

microRNAs是一類約22個(gè)核苷酸組成的種類豐富且進(jìn)化保守的單鏈非編碼小分子RNA，可以通過與靶基因mRNA完全互補(bǔ)配對而降解mRNA，或者與mRNA的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）部分互補(bǔ)配對而阻斷蛋白質(zhì)翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［1-2］。本課題組前期研究證明microRNA-20a（miR-20a）可以通過靶向Kdm6b促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成脂分化［3］。也有研究證實(shí)核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）在骨髓MSCs向成骨細(xì)胞分化和骨形成中起著重要作用［4］。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Nfic也是miR-20a的潛在靶基因，本研究擬采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測、Western blotting等分子生物學(xué)技術(shù)驗(yàn)證miR-20a和Nfic之間的靶向關(guān)系，為進(jìn)一步闡明miR-20a調(diào)節(jié)成骨分化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料細(xì)胞株293-AD及骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF級4周齡雄性C57小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；胎牛血清及細(xì)胞培養(yǎng)基均購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；miR-20a mimics及其陰性對照片段（NC mimics）由上海吉瑪生物科技公司合成；鼠源NFIC單克隆抗體購自Immunoway公司；鼠源β-actin單克隆抗體購自proteintech公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋公司；雙熒光素酶檢測試劑盒、pMIR-Report Luciferase購自Promega公司；pEasy-T1購自北京Transgene公司。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體通過microRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan獲取miR-20a與Nfic基因3′UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)成對PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建含有miR-20a應(yīng)答序列的Nfic 3′UTR片段。Nfic引物上游5′-CTCGCACATGGAAGGTATCAG-3′，下游5′-CCACGTCATC AGGAGGGTCA-3′。

取C57小鼠1只，以小鼠肝臟DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將得到的PCR產(chǎn)物與pEasy-T1載體進(jìn)行連接，25℃連接10 min后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均勻涂于預(yù)先涂有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的LB/氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。37℃過夜培養(yǎng)后，挑取白色單菌落搖菌過夜，提取質(zhì)粒命名為Nfic-3′UTR-T1。pMIR-Report Luciferase載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ/PmeⅠ雙酶切電泳回收大片段，Nfic-3′UTR-T1經(jīng)HindⅢ/EcoRⅤ雙酶切回收小片段，其中PmeⅠ和EcoRⅤ互為同尾酶。用T4 ligase將pMIR-Report Luciferase酶切回收的大片段與Nfic-3′UTR-T1酶切回收的小片段于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均勻涂于LB/氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，于固體培養(yǎng)板上挑取單菌落37℃搖菌過液，提取質(zhì)粒命名為Nfic-Luc。用HindⅢ/SacⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，37℃反應(yīng)15 min后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定正確后送測序，并將結(jié)果正確的克隆于-80℃保存。

1.2.2miR-20a與Nfic-Luc共轉(zhuǎn)染293-AD細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-20a mimics（實(shí)驗(yàn)組）及NC mimics（對照組）的終濃度為50 nmol/L，每孔分別加入0.5μg Nfic-Luc質(zhì)粒及10 ng pRL-SV40報(bào)告基因載體。轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine 3000。

1.2.3雙熒光素酶活性檢測轉(zhuǎn)染40 h后，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行檢測。吸凈各轉(zhuǎn)染孔內(nèi)的培養(yǎng)基，并用PBS清洗細(xì)胞1次。于各孔中加入100μL細(xì)胞裂解液，經(jīng)過1次凍融反應(yīng)后，收集各孔中的細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心1 min沉淀雜質(zhì)。取20μL上述細(xì)胞裂解液于不透明96孔板各孔中，按照說明書依次加入螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶底物，通過多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.2.4Western blotting實(shí)驗(yàn)當(dāng)ST2細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染NC mimics與miR-20a mimics，48 h后獲取細(xì)胞，并加入適量的細(xì)胞裂解液，提取蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。10%SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉2 h，加入一抗后4℃孵育過夜，以β-actin為內(nèi)參；1×TBST洗滌4次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1成功構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體Nfic基因3′-UTR基因片段克隆到pMIR-Report Luciferase載體中，命名為Nfic-Luc。其酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示載體構(gòu)建成功，見圖1。

2.2雙熒光素酶報(bào)告基因檢測將miR-20a mimics與Nfic-Luc熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染293-AD細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降，其活性實(shí)驗(yàn)組（0.56±0.03）較對照組（1.00±0.03）下降了44%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=17.272，P＜0.01）。

2.3Western blotting檢測miR-20a對NFIC蛋白表達(dá)水平的影響對照組和實(shí)驗(yàn)組中NFIC/β-actin分別為0.76±0.04、0.36±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=17.155，P＜0.05），見圖2。

Fig.1Nfic-Luc construction was identified by enzyme digestion圖1Nfic-Luc重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.2NFIC protein level was down-regulated after the transfection of miR-20a mimics versus control mimics transfection圖2　轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后NFIC蛋白表達(dá)水平較對照組降低

3　討論

隨著生活水平的提高，人均壽命的延長，骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病率越來越高。MSCs是一類能自我更新、具有多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等方向分化［5-6］，且在體外擴(kuò)增多代后仍可保持其多向分化潛能，對于骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等骨科疾病具有重要的臨床治療意義［7］。同時(shí)越來越多的研究表明，microRNA在MSCs向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化過程中起重要調(diào)節(jié)作用［8-10］。miR-17-92家族在組織和器官發(fā)育過程中不可或缺，歷來被廣泛研究，miR-20a就是其中一員。有研究顯示miR-20a在結(jié)腸直腸癌中較旁黏膜表達(dá)升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)［11］；miR-20a表達(dá)增高可以使細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）磷酸化延長，同時(shí)使異位基質(zhì)細(xì)胞中幾種血管生成基因表達(dá)上調(diào)［12］。本課題組前期研究證明miR-20a可以通過靶向Kdm6b促進(jìn)MSCs的成脂分化［3］。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果提示，Nfic也是miR-20a的潛在靶基因。

NFI家族轉(zhuǎn)錄因子是位點(diǎn)特異性的DNA結(jié)合蛋白，又被稱為CTF或CAAT盒轉(zhuǎn)錄因子，主要包括NFIA、NFIB、NFIC和NFIX。Nfic缺失（Nfic-/-）鼠牙源性干細(xì)胞增殖減少，成牙本質(zhì)細(xì)胞分化減弱而致磨牙根發(fā)育短小，說明Nfic對牙根形成具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用；Nfic-/-鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨量減少，在Nfic-/-鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ的表達(dá)增加，促進(jìn)其向脂肪細(xì)胞分化，減少成骨細(xì)胞分化［13］。有研究證明Nfic能直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達(dá)并通過下游BMP2-Runx2信號通路起作用，影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨或成脂分化［4］。

為探究miR-20a對Nfic的調(diào)控作用，本研究首先將Nfic 3′UTR克隆到雙熒光素酶報(bào)告載體上，然后與pRL-SV40報(bào)告基因載體、miR-20a mimics或NC mimics共同轉(zhuǎn)染293-AD細(xì)胞，與對照組相比，miR-20a能與Nfic mRNA的3′UTR結(jié)合，明顯抑制報(bào)告載體的熒光素酶活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在ST2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-20a mimics和NC mimics，miR-20a過表達(dá)能顯著下調(diào)NFIC蛋白水平，表明miR-20a可以負(fù)性調(diào)節(jié)NFIC蛋白表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)證明Nfic是miR-20a的直接靶基因，提示miR-20a可能通過靶向調(diào)節(jié)Nfic的表達(dá)而控制MSCs的成骨或成脂過程，進(jìn)而對骨或脂肪組織的發(fā)育產(chǎn)生影響。

有研究證明microRNA可以與某些成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)基因的3′UTR結(jié)合從而抑制其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨或脂肪細(xì)胞的分化。如miR-214通過直接靶向結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor，ATF4）3′UTR，抑制成骨細(xì)胞活性，影響骨形成［14］；miR-144通過靶向調(diào)節(jié)鈣黏蛋白11（Cad-11），抑制MSCs向成骨分化［15］；miR-3077-5p和miR-705分別通過靶向同源框基因A10（HOXA10）和轉(zhuǎn)錄因子Runx2，使MSCs向脂肪細(xì)胞分化［16］；miR-142-5p可通過靶向含有WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶1（WW-domain-containing E3 ubiquitin proteinligase 1，Wwp1）提高成骨細(xì)胞活性和基質(zhì)礦化［17］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-20a過表達(dá)組中的熒光素酶活性較對照組下降了約44%，但仍有少量NFIC蛋白表達(dá)，表明miR-20a并未完全抑制Nfic的表達(dá)，提示還存在其他基因能夠調(diào)控Nfic。因此，后續(xù)有必要深入研究是否有其他microRNAs與miR-20a協(xié)同調(diào)控Nfic的表達(dá)。

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（2016-04-17收稿2016-05-12修回）

（本文編輯李國琪）

Construction of Nfic gene 3′UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between Nfic and miR-20a

WANG Shan1，2，LI Xiaoxia2，ZHOU Jie1，WANG Baoli1△
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Basic Medical College of Tianjin Medical University△

E-mail：bliwang72@163.com

ObjectiveTo construct a luciferase reporter vector containing the 3′untranslated region（3′UTR）of nuclear factor I-C（nuclear factor I-C，Nfic），and apply dual luciferase reporter gene system to determine the association between microRNA-20a（miR-20a）and its potential target gene Nfic.MethodsThe potential complementary binding sites of miR-20a and Nfic were predicted by Targetscan.The 3′UTR of Nfic fragment amplified by PCR was cloned into luciferase reporter vector MIR-Report Luciferase.The luciferase reporters containing 3′UTR of Nfic and miR-20 mimics（experimental group）or NC mimics（control group）were co-transfected into 293-AD cells.Cells were collected，and then dual-luciferase reporter assay was performed to detect the luciferase activity of the two groups of cells，consequently the relationship between miR-20a and Nfic was identified.The miR-20a mimics and NC mimics were transfected into marrow stromal cell line ST2 respectively.The total cell lysates were collected，and the expression level of NFIC was detected by Western blotting assay.ResultsResults of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that sequence of luciferase reporter vector was correct.miR-20a specificity bounded to Nfic 3′UTR and inhibited the luciferase activity of the reporter construct（P＜0.05）.Western blotting assay showed that the NFIC protein level was obviously down-regulated in ST2 cells after the transfection of miR-20a mimics compared with that of control.ConclusionThe luciferase reporter vector containing the 3′UTR of Nfic is constructed successfully，which confirms that miR-20a can direct effect on Nfic3′UTR and repress its luciferase activity.

microRNAs；3′untranslated regions；miR-20a；nuclear factor I-C；marrow stromal cell line；luciferase reporter gene

R349.6

A

10.11958/20160318

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81271977，81472040）

1天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所、衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

王珊（1991），女，碩士在讀，主要從事分子生物學(xué)與病原生物學(xué)研究

E-mail:bliwang72@163.com