高效液相色譜法測定黑莓汁和黑莓果酒中常見有機酸

梁紅云　王英　董明盛

摘要：采用高效液相色譜法測定黑莓汁和黑莓果酒中有機酸含量。采用美國Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）為分析柱；流動相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（磷酸調pH值為2.0）；溫度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；進樣量：20 μL。建立了檢測黑莓果酒中主要的6種有機酸（酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸）的高效液相色譜方法。該方法的回收率為98.56%；RSD（相對標準偏差）為0.21%。

關鍵詞：高效液相色譜法；黑莓汁；黑莓果酒；有機酸

中圖分類號： O657.7+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0327-03

黑莓（blackberry）屬于薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬小灌木Rubus laciniata的果實，是一種具有較強抗氧化能力的小漿果，美國農業(yè)部評價結果顯示黑莓的抗氧化能力居第二位[1]。黑莓除含有糖、多種有機酸、膳食纖維、維生素和礦物質外，還含有大量的多酚、花青素、鞣花酸等具有抗氧化功能的成分[2-4]。我國黑莓的主栽品種有Hull、Chester、Boysen等，江蘇、東北、貴州等地是我國主要的黑莓種植地區(qū)，總種植面積約1萬hm2，全國黑莓年總產量約20萬t。黑莓果實柔嫩多汁，營養(yǎng)豐富，富含鋅、硒等多種礦物質，氨基酸種類齊全，且花色苷和總酚含量較高，被譽為第三代“黃金水果”，所含有的多酚類化合物在體內發(fā)揮抗氧化作用，可以降低心臟病、癌癥和其他慢性病的發(fā)生率[3-4]。

糖和有機酸是食品中重要的風味成分。Türemi

瘙 塂 等研究了9種黑莓的糖酸比，結果發(fā)現黑莓最高的糖酸比（可溶性固形物含量/總酸）為9.6[5]。Wrolstad等采用氣相色譜檢測美國和英國多種黑莓中的有機酸，包括蘋果酸、檸檬酸、莽草酸、異檸檬酸、奎寧酸和磷酸等，其中異檸檬酸是所有黑莓中含量最高的有機酸[6]。Kafkas等檢測了土耳其黑莓中的有機酸含量，在所研究的5種黑莓中，蘋果酸是含量最高的酸，而檸檬酸的含量均為零[7]。糖和酸的比例（糖酸比）常被用來判斷果實是否成熟和消費者的接受程度。如果是鮮食的品種，一定要保持適當的糖酸比。隨著成熟度的增加，黑莓中可溶性固形物的含量增加，有機酸的含量減少。

植物體內有機酸含量分析是近幾年來研究的熱點，尤其是在逆境生理方面。果實中有機酸種類與含量也是衡量果實品質的重要指標。目前測定有機酸的方法通常包括氣相色譜法、高效液相色譜法和離子色譜法，其中氣相色譜法（GC）測定有機酸時，常常因為酸的沸點較高、不易氣化而需要先對其衍生再進行測定，方法比較繁瑣；離子色譜法（HPIC）是近來應用較多的測定植物體內有機酸的方法[8-9]，可以同時測定溶液中的有機酸根離子和無機陰離子，如NO-3、Cl-、PO43-等，并且樣品前處理簡單[10-12]，但大量無機陰離子的存在通常增加了低含量有機酸的檢測難度；與之相比較，高效液相色譜法（HPLC）測定有機酸的方法比GC法簡單[13-14]，但也存在pH值、流動相的選擇等方面的問題，尤其是在測定幾種以上的有機酸時更為明顯。

對于黑莓果酒而言，同時檢測多種有機酸是必須的，因為有機酸的組成和比例更直接地影響著黑莓果酒風味的優(yōu)雅和諧，但由于黑莓果酒組分復雜，乙醇、色素、多酚以及糖等組分都可能對有機酸的檢測造成干擾，因此，有必要建立一種穩(wěn)定的、適于黑莓果酒多種有機酸分析的快速方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黑莓果酒：江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所釀造的黑莓果酒，黑莓品種為寶森，采自南京溧水地區(qū)。

1.2 儀器與試劑

儀器：PHS-3C型pH值計（上海精密科學儀器有限公司）；Waters 2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司），配有DAD檢測器、色譜柱恒溫箱和自動進樣器；有機相針式過濾器。

試劑：酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；超純水（電阻率為18.2 MΩ/cm2）；活性干酵母（湖北安琪酵母股份有限公司）。

1.3 有機酸標準液的配制

分別稱取酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸標準品50.0 mg，用去離子水定容至10 mL，配制成5 g/L標準液，為有機酸的混合標準樣母液；臨用時稀釋為7個濃度梯度溶液。根據樣品中有機酸含量分別稀釋，經0.22 μm濾頭過濾進樣。以進樣量（g/L）為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4 樣品的制備方法

1.4.1 黑莓汁的制備 黑莓→打漿→果膠酶酶解（45 ℃，4.5 h）→離心。

1.4.2 黑莓果酒的發(fā)酵 黑莓→打漿→果膠酶酶解（45 ℃，4.5 h）→調糖→接酵母菌（4%的蔗糖活化）→25 ℃發(fā)酵→黑莓果酒。

1.4.3 樣液的制備 吸取5 mL黑莓汁和黑莓果酒，分別經11 000 r/min離心10 min，0.22 μm濾頭過濾，待HPLC定量分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：美國Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（磷酸調pH值為2.0），使用前用0.45 μm濾膜過濾；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線的建立

分別吸取一定質量濃度的有機酸標準品，經0.22 μm濾膜過濾后進樣。以進樣量（g/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線見表1。從圖1可以看出色譜工作穩(wěn)定，重現性良好。

2.2 流動相的選擇

采用高效液相色譜法測定有機酸的研究很多，但是試驗中所用的流動相種類及pH值有很大差別。常用的流動相有0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（pH值2.5）[13-18]、甲醇 ∶ 15 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH值2.1）=15 ∶ 85（體積比）[14]、0.6% KH2PO4（pH值2.65）[19]、4 mmol/L硫酸水溶液[20]等。通過對上述各流動相檢測有機酸效果的比較，最終采用0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（pH值 2.0）為流動相。

2.3 HPLC定量分析

試驗選取不同濃度酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸6種有機酸制作混合標準溶液，檢測黑莓汁及黑莓果酒樣品中的有機酸，結果（圖1）表明，圖中有8個主要的峰，其中峰1是溶劑峰，峰8是單寧，峰2、3、4、5、6、7分別是酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸。

2.4 精密度試驗

取6種有機酸標準品的混合溶液10 mL，經0.22 μm濾膜過濾后連續(xù)進樣6次，分別計算有機酸峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD為0.18%（n=6）。表明該儀器靈敏度高，可用于黑莓汁和黑莓果酒中有機酸的檢測。

2.5 重復性試驗

精確吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒樣品各6份，經離心、0.22 μm濾膜過濾后進樣分析，分別計算有機酸峰面積的相對標準偏差，得到平均RSD為0.12%（n=6），表明該檢測方法重現性良好。

2.6 加標回收率試驗

采用加樣回收法，精確吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒樣品各5份，分別加入一定濃度的有機酸標準品，經離心、0.22 μm 濾膜過濾后進樣檢測，記錄色譜圖，根據峰面積計算回收率，結果見表2，其中有機酸平均回收率為98.56%，平均RSD為0.21%（n=5）?？梢姶朔椒ǖ臏蚀_度和精密度均良好，可應用于黑莓汁和黑莓果酒中有機酸含量的檢測。

3 討論

HPLC法測定黑莓汁和黑莓果酒中的有機酸含量時，由于各種有機酸的洗脫速度相似，導致出峰時間相近，間隔較小，試驗過程中通過調整流動相組成及配比達到了相對較好的分離效果。通過調整，（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液的濃度為0.5%、pH值為2.0的流動相，可達到較為理想的分離效果。

4 結論

采用色譜柱：美國Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（磷酸調pH值為2.0），使用前用0.45 μm濾膜過濾；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：214 nm；進樣量：20 μL。通過該方法，黑莓汁和黑莓果酒中含有的6種主要有機酸得到分離并定量，其平均回收率為 98.56%，平均RSD為0.21%。結果顯示，該方法操作簡單，準確度高，無雜質干擾，黑莓汁和黑莓果酒樣品無需經過復雜的前處理，即可達到較好的分離效果。

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