金蓮花種子無(wú)菌播種及離體培養(yǎng)技術(shù)

胡海英　李瑜

摘要：通過(guò)金蓮花種子無(wú)菌播種、離體培養(yǎng)技術(shù)的研究，初步建立金蓮花離體培養(yǎng)的技術(shù)體系和方法，為其種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供前期的技術(shù)基礎(chǔ)。以金蓮花種子為外植體，篩選出適宜金蓮花無(wú)菌播種發(fā)芽、離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明：金蓮花種子用100 mg/L GA3冷浸4 d效果最佳，其發(fā)芽率為92.67%；用無(wú)毒級(jí)殺菌消毒劑愛(ài)力克配制成 2 500 mg/L，與75%乙醇配合消毒20 min效果最佳；適宜金蓮花種子無(wú)菌播種培養(yǎng)基配方為MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA；適宜金蓮花試管苗叢生芽增殖的培養(yǎng)基配方為1/2MS+ 0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L KT+05 mg/L IBA+100 mg/L PVP+40 mg/L維生素C；適宜金蓮花試管苗壯苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA +40 mg/L 維生素C+100 mg/L PVP+0.5%活性炭。

關(guān)鍵詞：金蓮花；種子；無(wú)菌播種；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0230-03

金蓮花（Trollius chinensis Bunge.）別稱旱荷、旱蓮花、寒荷、陸地蓮等，為毛茛科金蓮花屬，屬于一年生或多年生草本植物，喜冷涼濕潤(rùn)環(huán)境，多生長(zhǎng)在海拔1 800 m以上的高山草甸或疏林地帶。金蓮花在我國(guó)分布較為廣泛，其主產(chǎn)地在河北塞罕壩上周邊地區(qū)的沿壩地帶，在寧夏主要零星分布于六盤山等地區(qū)。金蓮花植株秀麗、花色金黃，是優(yōu)良的花壇、花鏡和盆花材料[1-3]；同時(shí)，金銀花花朵有極高的藥用價(jià)值，可入藥或制茶[2-6]。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)金蓮花的研究多集中于金蓮花藥理成分提取、分離、鑒定和醫(yī)藥制劑與質(zhì)量控制方面[7]，如劉麗娟等對(duì)長(zhǎng)瓣金蓮花[8]、黃文哲等對(duì)短瓣金蓮花[9]的莖葉化學(xué)成分進(jìn)行了研究，葉紹明等通過(guò)研究建立了關(guān)于金蓮花有效成分的提取工藝體系[10]。在金蓮花的人工栽培、養(yǎng)護(hù)管理方面，陳智卿等進(jìn)行了一系列較為詳盡的研究，認(rèn)為通過(guò)實(shí)生播種進(jìn)行金蓮花種苗培育，其幼苗死亡率高達(dá)70%～80%，且幼苗期栽培管理較難，難以達(dá)到迅速培育優(yōu)質(zhì)種苗的目的[1-2，11]；由于金蓮花的休眠特性，使其自然繁殖系數(shù)低，幼苗死亡率高。在金蓮花組織培養(yǎng)的研究方面，國(guó)內(nèi)有零星相關(guān)報(bào)道，楊玉芳等以山西金蓮花種子為材料建立了金蓮花離體培養(yǎng)體系，但是金蓮花除菌環(huán)節(jié)較困難，污染嚴(yán)重，繁殖系數(shù)低[12]。因此，解決金蓮花發(fā)育遲緩、無(wú)菌苗生長(zhǎng)緩慢、繼代不穩(wěn)定等問(wèn)題仍是當(dāng)前重要的研究工作。本研究在藥用植物組織培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)不同種類、不同濃度細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素的搭配使用，選擇適宜的種子無(wú)菌播種、增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，初步建立金蓮花離體培養(yǎng)技術(shù)和方法，以期為金蓮花種質(zhì)資源保護(hù)與利用提供前期的試驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

金蓮花種子，由寧夏隆德縣金蓮花示范種植基地提供，引種于河北壩上地區(qū)，別稱壩上金蓮花。經(jīng)干燥、挑揀雜物等處理后，置于牛皮紙袋中，于4 ℃冰箱冷藏保存。

在無(wú)菌播種前解除種子休眠，先將種子清洗后浸沒(méi)于100 mg/L GA3溶液中，于4 ℃低溫冷藏4 d（該條件發(fā)芽率可達(dá)92.67%）后進(jìn)行無(wú)菌消毒。培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基[13-15]，其中含6 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖，pH值5.8。添加的植物激素有細(xì)胞分裂素6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、噻苯隆（TDZ）；生長(zhǎng)素α-萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IBA）?？寡趸瘎榫垡蚁┻量┩橥≒VP）、維生素C。吸附劑為活性炭。

消毒液選用上海宇涵生物科技公司生產(chǎn)的新一代無(wú)毒級(jí)殺菌消毒劑愛(ài)立克，配制成2 500 mg/L濃度備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)金蓮花種子無(wú)菌萌發(fā)的影響 將清洗并解除休眠的種子置于超凈工作臺(tái)上，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用無(wú)菌水清洗3次，再用2 500 mg/L消毒液分別浸泡15、20、25 min，最后用無(wú)菌水清洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干水分后接種到培養(yǎng)基中，觀察種子的發(fā)芽情況、污染情況，統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率、污染率。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間8 h/d，光照度為 1 000 lx，培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃。

1.2.2 金蓮花種子無(wú)菌接種培養(yǎng)基的篩選 用以上篩選出的打破休眠并用最佳無(wú)菌消毒方法處理的種子后，將種子接種在不同配方的培養(yǎng)基上。以污染率、發(fā)芽率為指標(biāo)，篩選種子無(wú)菌播種最適培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間8 h/d，光照度1 000 lx，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃。

1.2.3 金蓮花試管苗叢生芽增殖培養(yǎng)基的篩選 將金蓮花試管苗分成帶部分根、莖、葉的材料，分別接種到含不同濃度6-BA、TDZ、IBA的增殖培養(yǎng)基中（配方詳見(jiàn)表2），觀察其從生芽的分化情況。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間8 h/d，光照度 2 000 lx，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃。

1.2.4 金蓮花試管苗壯苗生根培養(yǎng)基的篩選 以金蓮花試管苗為材料，分別接種到含不同濃度的TDZ、NAA、IBA的壯苗生根培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基配方見(jiàn)表3），觀察其生長(zhǎng)及生根情況。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間8 h/d，光照度2 000 lx，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究中用到的相關(guān)公式如下：發(fā)芽率=（發(fā)芽的種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)）×100%；污染率=（污染的種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)）×100%；成苗率=（發(fā)芽種子形成幼苗數(shù)/發(fā)芽的種子數(shù)）×100%；增殖系數(shù)= （再生叢生芽數(shù)/接種數(shù)）×100%。

統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)種子無(wú)菌萌發(fā)的影響

經(jīng)種子休眠解除處理后，對(duì)金蓮花種子進(jìn)行無(wú)菌消毒處理，由表4可以看出，滅菌時(shí)間不同，消毒效果不同，即污染率不同。

消毒時(shí)間為15 min，接種3～7 d后，種子表面長(zhǎng)出霉菌，顏色為白色、黑色居多且菌毛較長(zhǎng)，形成較大的菌圈，培養(yǎng)基表面形成1層墨綠色的菌層，種子材料全部被污染，無(wú)發(fā)芽。延長(zhǎng)滅菌時(shí)間至20 min，污染率為21.47%，發(fā)芽率可達(dá)50%。滅菌時(shí)間延長(zhǎng)至25 min時(shí)，接種3～7 d后，部分培養(yǎng)基會(huì)輕微泛黃，發(fā)芽率低。結(jié)果說(shuō)明，滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)抵制種子活性，影響種子發(fā)芽，因此選用2 500 mg/L消毒劑愛(ài)立克結(jié)合75%乙醇對(duì)金蓮花種子滅菌處理20 min，可以達(dá)到較好的消毒效果。

2.2 不同激素配比對(duì)金蓮花種子無(wú)菌發(fā)芽效果的影響

不同種類、濃度配比的細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素可以直接影響金蓮花種子的無(wú)菌發(fā)芽效果。從表5可以看出，選用含 0.05～0.10 mg/L TDZ培養(yǎng)基進(jìn)行金蓮花無(wú)菌播種，與含有NAA、6-BA植物激素的培養(yǎng)基相比，種子的發(fā)芽率、成苗率相對(duì)較高，而且發(fā)芽時(shí)間也較其他培養(yǎng)基快4～8 d。從發(fā)芽率、成苗率、發(fā)芽時(shí)間的比較可知，選用培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L TDZ +0.5 mg/L IBA進(jìn)行無(wú)菌播種，其種子發(fā)芽率為51%，成苗率達(dá)50%，較其他培養(yǎng)基效果明顯。由此可知，MS+0.1 mg/L TDZ +0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基適合用于金蓮花種子的無(wú)菌發(fā)芽培養(yǎng)（圖1）。

2.3 不同激素配比對(duì)金蓮花試管苗叢生芽增殖的影響

從表6可以看出，增殖培養(yǎng)20 d后，各培養(yǎng)基金蓮花從生芽的增殖系數(shù)有明顯差異。經(jīng)方差分析可知，金蓮花在B6增殖培養(yǎng)基中增殖系數(shù)顯著高于其他培養(yǎng)基，接種后長(zhǎng)出新生芽的時(shí)間較短，約為21 d，且增殖叢生芽數(shù)多、生長(zhǎng)健壯。在本研究中，光照培養(yǎng)一段時(shí)間后，材料容易褐化。有研究報(bào)道，褐變?cè)谥参锝M織培養(yǎng)中普遍存在，不同植物可采用不同的方法進(jìn)行預(yù)防和控制[14]。筆者發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入PVP、活性炭可有效防止褐變的發(fā)生。

2.4 不同激素配比對(duì)金蓮花試管苗壯苗生根培養(yǎng)的影響

不同激素配比對(duì)金蓮花試管苗生長(zhǎng)影響不一，在添加不同生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)獲得的不定根粗而短，且葉片邊緣伸展程度大。由于試驗(yàn)中添加了活性炭，葉片、莖部沒(méi)有褐化現(xiàn)象，且明顯促進(jìn)了生根。未添加生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)獲得的不定根數(shù)量少、植株矮小、生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明生長(zhǎng)素，尤其是NAA有利于金蓮花不定根的形成，從而促進(jìn)試管苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。因此，選用C2（1/2MS+0.5 mg/L NAA+40 mg/L維生素C+100 mg/L PVP+0.5%活性炭）培養(yǎng)基作為金蓮花試管苗壯苗生根培養(yǎng)基（表7）。金蓮花試管苗增殖培養(yǎng)效果見(jiàn)圖2。

3 結(jié)論

由本研究結(jié)果可知，（1）4 ℃低溫層積結(jié)合100 mg/L GA3可以有效打破金蓮花種子的休眠，低溫層積處理4 d效果最佳，種子發(fā)芽率可達(dá)92.67%。（2）用新一代無(wú)毒級(jí)殺菌消毒劑愛(ài)力克，配制成2 500 mg/L溶液，與75%乙醇配合消毒20min效果最好。（3）細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素不同濃度配比影響金蓮花的無(wú)菌發(fā)芽、增殖生長(zhǎng)，適宜金蓮花無(wú)菌發(fā)芽的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA；適宜金蓮花試管苗叢生芽增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L IBA+100 mg/L PVP+40 mg/L 維生素C；適宜金蓮花試管苗壯苗、生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+40 mg/L維生素C +100 mg/L PVP+0.5%活性炭。（4）在培養(yǎng)基中加入維生素C、PVP等抗氧化成分，配合活性炭，并在金蓮花無(wú)菌試管苗再生出2～3張葉、培養(yǎng)時(shí)間約為18 d時(shí)及時(shí)對(duì)其幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)接，可有效避免褐化。

4 討論

4.1 金蓮花種子休眠的解除方法

顧增輝等研究認(rèn)為，純丙酮配制GA3溶液浸泡種子 4 h 處理金蓮花種子發(fā)芽效果最好[4]，與本研究結(jié)果一致。但處理后，將種子進(jìn)行無(wú)菌消毒后進(jìn)行播種時(shí)，種子在培養(yǎng)基中的發(fā)芽效果與紙床發(fā)芽效果差異顯著?？赡苁且?yàn)橛眉儽獙?duì)種子處理過(guò)后，雖然對(duì)種子經(jīng)過(guò)幾次無(wú)菌水的清洗，但不排除還留有一定量純丙酮溶液對(duì)種子萌發(fā)造成的影響，使長(zhǎng)出的幼苗不能順利生長(zhǎng)成苗。因此，是否用此方法對(duì)金蓮花種子進(jìn)行休眠解除并應(yīng)用于組織培養(yǎng)還有待于進(jìn)一步研究。

4.2 不同的無(wú)菌消毒方法

在野生花卉引種馴化中，以種子為外植體建立離體培養(yǎng)體系是一條多快好省的途徑，但在建立離體培養(yǎng)技術(shù)前的基礎(chǔ)是對(duì)外植體進(jìn)行無(wú)菌消毒。在對(duì)金蓮花無(wú)菌消毒方法中，楊玉芳等采用HgCl2消毒，對(duì)種子有一定的毒害作用，造成材料大量污染、發(fā)芽率低等問(wèn)題[12]。在本試驗(yàn)中，用新型的消毒劑對(duì)種子組織毒害小，除能殺死所有細(xì)菌繁殖體外，對(duì)所有細(xì)菌芽孢、病毒、藻類和真菌等均有很強(qiáng)的殺滅作用，但是長(zhǎng)時(shí)間作用也會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生毒害，從而影響種子萌發(fā)。并且外植體污染問(wèn)題不能根除，也可能與金蓮花本身的野生生存環(huán)境有關(guān)，金蓮花快速生長(zhǎng)期、種子成熟期為多雨季節(jié)，多濕、半陰環(huán)境有利于微生物的繁衍，其果實(shí)為蒴果，采收時(shí)蒴果均已開(kāi)裂，其間繁衍了大量真菌或細(xì)菌等微生物，增加了組織培養(yǎng)材料除菌的難度[15-16]。

4.3 金蓮花試管苗發(fā)芽、生長(zhǎng)緩慢

本研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花種子的發(fā)芽率在有菌環(huán)境（培養(yǎng)皿濾紙發(fā)芽）、無(wú)菌培養(yǎng)基條件下存在一定的差異。前者種子發(fā)芽率略高于后者，且發(fā)芽時(shí)間短（3 d開(kāi)始發(fā)芽），嚴(yán)力群等也有過(guò)類似報(bào)道[5]。但在無(wú)菌培養(yǎng)基中，最快6 d開(kāi)始發(fā)芽，可能是無(wú)菌培養(yǎng)基含水量高、各種激素配合作用，以及pH值等均是影響金蓮花種子發(fā)芽慢的因素，但主導(dǎo)制約因素還待研究。另外，本研究中使用具有細(xì)胞分裂素作用的TDZ，能誘導(dǎo)離體培養(yǎng)材料的多種途徑形態(tài)發(fā)生，比6-BA、KT等細(xì)胞分裂素效果明顯。在培養(yǎng)基中加入維生素C、PVP，配合活性炭，并在金蓮花無(wú)菌試管苗再生出2～3張葉時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間約為18 d左右），及時(shí)對(duì)其幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)接，可有效避免褐化。盡管綜合應(yīng)用了以上措施，但金蓮花無(wú)菌發(fā)芽最快在第6天，且增殖系數(shù)最多為1.75，還不能完全達(dá)到離體快繁的目標(biāo)。因此，解決金蓮花試管苗生長(zhǎng)緩慢、提高增殖快繁倍數(shù)仍是今后的研究重點(diǎn)。

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