耐抽薹大白菜—結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系后代的獲得

趙玉靖　滑帆　趙建軍

摘要：利用60Co-γ輻射結(jié)合自交及游離小孢子培養(yǎng)，培育耐抽薹大白菜-結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系的后代群體。結(jié)果表明，隨著輻射劑量的增加，自交結(jié)角率變化無顯著規(guī)律，而結(jié)籽率則呈下降趨勢(shì)；隨著輻射劑量的增加，游離小孢子培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生率顯著下降，輻射劑量高于60 Gy時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率為0。

關(guān)鍵詞：大白菜；結(jié)球甘藍(lán)；單體異附加系；耐抽薹；輻射誘變；游離小孢子；培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： S634.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0196-02

大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。先期抽薹給大白菜的春季栽培帶來很大困擾，影響了大白菜的周年均衡供應(yīng)，而最好的解決方式是培育耐抽薹的品種[2]。結(jié)球甘藍(lán)與大白菜同科同屬，較大白菜具有耐寒、耐熱性強(qiáng)、耐抽薹、富含硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷，glucosinolate）等優(yōu)良特性。筆者所在課題組已獲得了耐抽薹大白菜-結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系，但單體異附加系遺傳不穩(wěn)定，且攜有的非目的基因較多。

近年來，輻射誘變以其能提高植物基因水平上的突變頻率，有利于打破性狀連鎖和促進(jìn)基因重組[3]，而被廣泛應(yīng)用于新品種選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新工作中，成為常規(guī)育種的重要補(bǔ)充手段之一。輻射誘變最常用的是60Co-γ射線[4]。60Co-γ射線能顯著影響組織或細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及生理生化過程，一定劑量的射線能造成染色體的斷裂，傷害程度與輻射劑量呈顯著正相關(guān)[5]。輻射劑量的選擇是影響誘變效果的關(guān)鍵因素，過大或過小均可造成輻射無效或致死率太高[6]。輻射誘變?cè)邴滎怺5]、棉花[7]等作物上研究較多，但在大白菜遺傳育種上鮮有報(bào)道。本研究以耐抽薹大白菜-結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系為材料，利用60Co-γ輻射結(jié)合自交及游離小孢子培養(yǎng)途徑，創(chuàng)制該單體異附加系的后代群體，為獲得遺傳穩(wěn)定的易位系提供必要的材料與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為耐抽薹大白菜-結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系A(chǔ)C4。由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜分子染色體工程與新品種選育團(tuán)隊(duì)提供。AC4為組培苗，誘導(dǎo)生根后于2012年1月移栽到溫室營(yíng)養(yǎng)缽中，冬季自然低溫春化，3月22日定植到大棚，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輻射誘變后自交 雌配子未經(jīng)輻射處理而雄配子經(jīng)輻射處理后自交：取AC4的健壯花枝，水培于三角瓶中，進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理。輻射劑量率1 Gy/min，設(shè)0（對(duì)照）、30、45、60、75 Gy 5個(gè)劑量梯度。輻射后去除該花枝上已開花朵，套袋隔離，用以提供花粉。選取未輻射處理的AC4植株上適宜授粉的花蕾，去除雄蕊，分別授以經(jīng)0、30、45、60、75 Gy輻射的新鮮花粉，套袋隔離，成熟后收獲種子M1。

雌雄配子輻射處理后自交：取AC4初花期整棵植株進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理，輻射劑量率1 Gy/min，輻射劑量分別為30、45 Gy。對(duì)輻射劑量為30 Gy的植株上適宜授粉的花蕾去雄，授以經(jīng)30 Gy輻射的花粉，套袋隔離；對(duì)輻射劑量為45 Gy的植株上適宜授粉的花蕾去雄，分別授以經(jīng)30、45、60、75 Gy輻射的新鮮花粉，套袋隔離，成熟后收獲種子M1。

1.2.2 輻射誘變后游離小孢子培養(yǎng) 晴朗的上午，溫度 18～20 ℃，取AC4主枝、一級(jí)側(cè)枝上適宜花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。以未經(jīng)輻射誘變花蕾小孢子培養(yǎng)為對(duì)照，待輻射處理24 h后，分別取輻射劑量為30、45、60、75 Gy花枝上適宜的花蕾，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。培養(yǎng)方法及胚狀體植株再生方法參照申書興等的方法[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC4輻射誘變后的結(jié)角率和結(jié)籽率

隨著輻射劑量的增加，結(jié)角率沒有明顯的變化規(guī)律，而結(jié)籽率明顯變化（表1）。對(duì)于父本接受輻射、母本未輻射的雜交組合，除授粉組合Ⅱ（父本輻射劑量為30 Gy，母本未輻射）的結(jié)籽率為46%，稍高于授粉組合Ⅰ（父母本均未接受輻射）的結(jié)籽率外，其他組合的結(jié)籽率均呈現(xiàn)隨輻射劑量的增加而下降的趨勢(shì)；父本母本均接受輻射的組合，除組合Ⅷ（父、母本輻射劑量均為45 Gy）外，母本輻射劑量相同時(shí)，結(jié)籽率隨父本接受劑量的增加而下降。父本輻射劑量相同時(shí)，母本接受的輻射劑量越大，結(jié)籽率也越低。即父、母本接受的輻射劑量均影響結(jié)籽率。以上輻照處理，共計(jì)獲得耐抽薹大白菜-結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系A(chǔ)C4自交種子2 962粒。

2.2 AC4花蕾輻射誘變后游離小孢子培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率及植株再生率

AC4不經(jīng)輻射的適宜新鮮花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)（圖1-A），其胚狀體誘導(dǎo)率為7.2個(gè)/蕾、植株再生率為48.8%（表2），共208個(gè)胚狀體發(fā)育成植株。輻射誘變后的游離小孢子培養(yǎng)，隨著輻射劑量的增加，胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生率顯著下降。輻射劑量為30 Gy時(shí)（圖1-B），胚狀體誘導(dǎo)率、植株再生率分別為2.71個(gè)/蕾和36.4%，16個(gè)胚狀體發(fā)育成植株；輻射劑量達(dá)到45 Gy時(shí)（圖1-C），胚狀體誘導(dǎo)率、植株再生率分別降低至0.11個(gè)/蕾和27.7%，2個(gè)胚狀體發(fā)育成植株；輻射劑量增至60 Gy時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率降低至0。結(jié)果表明，花蕾輻射劑量顯著影響游離小孢子培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生率。

輻射劑量為30、45 Gy 的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，33 ℃ 高溫預(yù)處理24 h后，25 ℃暗培養(yǎng)7～11 d形成肉眼可見的球形胚，18～21 d形成成熟的子葉形胚（圖1），轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基（圖2-A），2～3 d后胚狀體轉(zhuǎn)綠（圖2-B）。在胚狀體植株再生（圖2-C）過程中，存在胚狀體褐化死亡的現(xiàn)象（圖2-D）。

3 討論

任正隆等采用常規(guī)雜交選育方法，以單體異附加系為試材，獲得了小麥-黑麥小片段染色體易位系[8]。李瑞芬等以單體異附加系花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)染色體易位[9]。本研究以耐抽薹大白菜-結(jié)球甘藍(lán)單體異附加系為材料，利用60Co-γ輻射結(jié)合自交及游離小孢子培養(yǎng)途徑，獲得了3 188個(gè)該單體異附加系的后代，為進(jìn)一步篩選易位系提供了必要材料。輻射可使染色體斷裂，從而實(shí)現(xiàn)外源染色體片段向受體親本基因組的轉(zhuǎn)移[10]，以提高易位系的合成頻率。同時(shí)以游離小孢子培養(yǎng)替代花藥培養(yǎng)，排除了培養(yǎng)過程中花藥壁等體細(xì)胞的干擾[11]和易出現(xiàn)嵌合體的現(xiàn)象。

本研究中隨著輻射劑量的增加，結(jié)籽率呈下降趨勢(shì)，游離小孢子培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生率呈顯著下降趨勢(shì)，表明60Co-γ射線輻射降低了花粉、游離小孢子的活力，且降低程度與輻射劑量呈正相關(guān)。在棉花上也報(bào)道了60Co-γ射線破壞花粉活力，降低結(jié)籽率[12]。成熟的雌雄配子體對(duì) 60Co-γ具有較強(qiáng)的耐受性；而游離小孢子的活力下降與輻射劑量呈顯著正相關(guān)，推測(cè)是在雄配子形成早期的小孢子階段對(duì)輻射誘變的耐受性較差引起的。在本研究中自交結(jié)籽率下降幅度小，這可能是由于白菜中含有豐富的抗輻射物質(zhì)硫代葡萄糖苷[13]。

李桂英等在研究輻射花粉對(duì)小麥×黑麥雜種結(jié)實(shí)率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低劑量射線輻射黑麥花粉時(shí)，結(jié)實(shí)率比對(duì)照略有提高[14]，表現(xiàn)出低劑量輻射的刺激效應(yīng)。本試驗(yàn)中輻射劑量為30 Gy的花粉做父本時(shí)，授粉的結(jié)籽率稍高于對(duì)照，也表現(xiàn)出了低劑量的刺激效應(yīng)。

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