磷脂酶D及其產(chǎn)物磷脂酸的調(diào)控和功能研究進(jìn)展

張軍林　郭曉紅　謝立蘭

摘要：磷脂酶D是廣泛存在于動(dòng)植物各種組織和細(xì)胞中的一類(lèi)磷酸二酯酶，自身及其代謝產(chǎn)物磷脂酸可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多生理生化活動(dòng)，例如細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞表面受體的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架蛋白重組等。本文主要討論哺乳動(dòng)物磷脂酶D家族的分子生物學(xué)特點(diǎn)，及其代謝產(chǎn)物磷脂酸在磷脂酶D調(diào)控細(xì)胞生理和代謝性疾病上所發(fā)揮的重要作用。

關(guān)鍵詞：磷脂酶D；磷脂酸；細(xì)胞調(diào)控；囊泡融合

中圖分類(lèi)號(hào)： Q556 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0015-04

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）最先是在胡蘿卜提取物中發(fā)現(xiàn)的，具有磷酸二酯酶的活性，可以專一地水解卵磷脂產(chǎn)生脂質(zhì)第二信使磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和膽堿。PLD超家族成員廣泛存在于病毒、細(xì)菌、酵母菌、植物及動(dòng)物體中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，除白細(xì)胞和少數(shù)淋巴細(xì)胞外，均有PLD活性存在。20世紀(jì)90年代，研究人員克隆了PLD基因，發(fā)現(xiàn)PLD的活性及其代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物的生理過(guò)程和某些疾病發(fā)生產(chǎn)生影響，如炎癥、糖尿病、細(xì)胞骨架重建、囊泡運(yùn)輸和胞外分泌、腫瘤形成，以及嗜中性粒細(xì)胞氧化呼吸鏈的阻斷等。這些發(fā)現(xiàn)均來(lái)自于PLD的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移作用，即在有水或一級(jí)醇（如乙醇、丁-1-醇）存在時(shí)，PLD能催化水解卵磷脂產(chǎn)生PA和磷脂酰乙醇或磷脂酰丁-1-醇。PA作為PLD在細(xì)胞中的主要代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控。PA還可以被轉(zhuǎn)化成為另外2個(gè)具有生物活性的脂質(zhì)分子，甘油二酯（diacylglycerol，DAG）和溶血磷脂酸（phosphatidicacid，LPA）。PA與這2個(gè)活性分子參與細(xì)胞中骨架蛋白重建、囊泡運(yùn)輸和受體信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理過(guò)程。本文主要討論哺乳動(dòng)物PLD代謝的前體和產(chǎn)物，尤其是磷脂酸在PLD功能發(fā)揮中的作用。

1 磷脂酶D家族分子生物學(xué)特點(diǎn)

從植物、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物中克隆的磷脂酶D組成一個(gè)基因家族，具有一系列高度保守序列和特征，這個(gè)基因家族包括細(xì)菌PLD、磷酸轉(zhuǎn)移酶/磷脂合成酶、核酸內(nèi)切酶和一些病毒外殼結(jié)構(gòu)蛋白。目前對(duì)動(dòng)物體中對(duì)PLD1、PLD2的研究較多，主要關(guān)注點(diǎn)是磷脂酰膽堿專一性磷脂酶D在糖尿病中性粒細(xì)胞和心臟、血管、腎臟、神經(jīng)組織細(xì)胞中的酶活性改變，及其引起糖尿病各種并發(fā)癥改變的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。PLD3、PLD4、PLD5基因是最近克隆出來(lái)的，它們具有與PLD1、PLD2相似的功能域（圖1），但其功能和表達(dá)調(diào)控的研究才剛剛開(kāi)始?？傊琍LD作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中重要的酶分子，參與了細(xì)胞功能的諸多方面，其具體的作用機(jī)制研究成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)。

1.1 磷脂酶D家族的分子結(jié)構(gòu)

所有克隆得到的真核生物PLD都具有一個(gè)相對(duì)保守的核心催化功能域（PLDc）、N-末端、C-末端區(qū)域。PLD催化核心域一般有Ⅰ～Ⅳ個(gè)域組成。在這4個(gè)短序列區(qū)域中，域Ⅰ和域Ⅱ、域Ⅲ、域Ⅳ具有特別相似的結(jié)構(gòu)。保守域Ⅱ和Ⅲ之間插入的不同非保守片段也說(shuō)明了這一點(diǎn)，并且這些插入片段或者Loop區(qū)對(duì)于人PLD1活性并非必需。除了域Ⅰ～Ⅳ域，在酵母、人和線蟲(chóng)的序列中仍有其他的結(jié)構(gòu)域，如核心催化功能域HKD基序，N末端的PX域（phox domain）和PH域（pleckstrin donmain）。PLD家族成員都具有一個(gè)保守序列（HXKX4DX6GG/S），它具有的催化活性使得PLD家族成員有相似的作用機(jī)理。HKD基序在PLD 家族中具有高度保守性。對(duì)PLD1、PLD2的研究表明，HKD基序中的組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸殘基是催化作用所必需的。HKD 基序是PLD 的標(biāo)志序列，具有催化水解的活性。這意味著真核生物PLD基因可能由同一基因經(jīng)過(guò)復(fù)制和融合等基因重組過(guò)程進(jìn)化而來(lái)。

有研究表明，PH域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的定位至關(guān)重要，序列缺失和定點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致該蛋白不能在細(xì)胞內(nèi)正確定位。PH域介導(dǎo)PLD1結(jié)合到脂質(zhì)筏上，促進(jìn)該酶的早期復(fù)性從而使其轉(zhuǎn)位到內(nèi)涵體的質(zhì)膜上[1]。刪除PH域并不影響PLD的酶活性，也不改變PLD催化反應(yīng)對(duì)PI-4，5-P2依賴性，這導(dǎo)致了PI-4，5-P2結(jié)合基序的發(fā)現(xiàn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，PLD的PX域能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或者結(jié)合磷酸肌醇[3]。與其他磷酸肌醇單磷酸（如PI5P）明顯不同，PX域能夠優(yōu)先與磷酸肌醇三磷酸結(jié)合[4]。相反，在脂質(zhì)體結(jié)合分析中PX域卻與PI5P優(yōu)先結(jié)合，由于PI5P是細(xì)胞內(nèi)吞所需要的脂質(zhì)體，這將有利于PLD1從質(zhì)膜進(jìn)入吞噬泡。與PLD2不同，PLD1具有保守的LOOP域，這一功能域具有負(fù)調(diào)控元件的作用，將該功能域缺失會(huì)導(dǎo)致PLD1的活性下降3倍。對(duì)PLD3、PLD4、PLD5進(jìn)行蛋白質(zhì)功能域預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)它們都沒(méi)有PH和PX功能域，但卻均在2個(gè)催化活性域之間多出1個(gè)envelope功能域。envelope功能域一般存在于病毒包膜蛋白中，而結(jié)合在質(zhì)膜上的PLD通常通過(guò)把磷脂轉(zhuǎn)化成磷脂酸來(lái)改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)運(yùn)動(dòng)，這預(yù)示著這3個(gè)磷脂酶D很有可能具有不同于PLD1、PLD2的功能。

1.2 磷脂酶D的細(xì)胞定位

PLD1和PLD2在細(xì)胞中的定位是不同的。通過(guò)研究不同細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，PLD1主要分布于核周際，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或后期囊泡[5]。也有觀點(diǎn)相反的報(bào)道認(rèn)為，PLD1只分布于后期囊泡和溶酶體中，高爾基體中就沒(méi)有PLD1的分布[6]，而在未被刺激的細(xì)胞中，PLD1只分布于質(zhì)膜[7]。但是現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，受到外界刺激后PLD1會(huì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜[8]。實(shí)際上，由于細(xì)胞系囊泡循環(huán)的頻率和數(shù)量不同以及PLD1調(diào)控的定位，只能以細(xì)胞內(nèi)PLD1動(dòng)態(tài)循環(huán)的概念來(lái)解釋。

PLD2主要分布于質(zhì)膜[9]，同時(shí)在胞質(zhì)、囊泡體[10]和β肌動(dòng)蛋白[11]中也有分布。在血清和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）刺激下PLD2會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜褶皺上。

2 PLD代謝產(chǎn)物PA的功能

PLD水解產(chǎn)生的PA參與多方面的細(xì)胞代謝功能。PA既可以在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，如參與磷酸肌醇激酶的激活或作為蛋白質(zhì)的脂類(lèi)結(jié)合伴侶募集蛋白質(zhì)等過(guò)程。PA也可以通過(guò)前面所述途徑被轉(zhuǎn)化成具有生物活性的脂質(zhì)分子DAG和LAP，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。同時(shí)，PA在囊泡運(yùn)輸，內(nèi)吞作用和分泌過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用?？傊?，PA在以上這些過(guò)程中的功能通常是作為第二信使、脂類(lèi)船塢和增融性脂質(zhì)功能的聯(lián)合，以下將分別討論。

2.1 PA作為第二信使的作用

PA參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，包括激活PI4P 5-激酶，激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及與Raf激酶結(jié)合等許多通路。PA的1個(gè)重要下游靶標(biāo)是Ⅰ型PI4P 5-激酶，它可以催化PI4P產(chǎn)生PI-4，5-P2。與其他脂類(lèi)分子相比，只有PA可以在體外激活牛腦中提取的PI4P 5-激酶。后來(lái)研究表明，PA只能激活Ⅰ型而非Ⅱ型PI4P 5-激酶。Ⅰ型PI4P 5-激酶第3個(gè)變體的克隆和研究也證實(shí)了這一說(shuō)法，并且這一過(guò)程與體內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚合調(diào)控相關(guān)[12]。EGF介導(dǎo)PLD2的活化和轉(zhuǎn)位導(dǎo)致質(zhì)膜褶皺中PA的大量積累，從而激活質(zhì)膜上PI4P 5-激酶來(lái)促進(jìn)褶皺的產(chǎn)生。不但PLD產(chǎn)生的PA可以激活Ⅰ型PI4P 5-激酶α，而且PA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)PA處理豬動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞也能激活Ⅰ型PI4P 5-激酶α[13]。另外，PA雙?；湹慕M成也是也是PA研究的一個(gè)方面。雙?；淧A（8 ∶ 0）對(duì)PI4P 5-激酶具有相似的激活效率[14]。有研究表明，蛋黃提取物具有混合?；湹腜A，也能激活PI4P 5-激酶。因此，PA作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞分子，與其來(lái)源和?；湹慕M成無(wú)關(guān)。

PLD與細(xì)胞抗凋亡的多種生存信號(hào)通路有關(guān)。作為細(xì)胞周期和增殖效應(yīng)器的mTOR就是PLD抗凋亡的下游激活因子。在血清刺激下HEK293細(xì)胞內(nèi)PA瞬時(shí)增加，從而導(dǎo)致mTOR及其下游蛋白S6激酶Ⅰ（S6K Ⅰ）的激活。體外研究發(fā)現(xiàn)，PA可以與mTOR在12-雷帕霉素結(jié)合域FK506直接作用[15]，與脂類(lèi)分子（PC、PS、PE、PI和PIPs）相比，PA具有專一性。用mTOR抑制劑雷帕霉素處理細(xì)胞能夠阻滯PA與mTOR作用，說(shuō)明PA與雷帕霉素是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的。超表達(dá)PLD2能夠阻滯雷帕霉素，從而抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)一步說(shuō)明PLD與mTOR調(diào)控有關(guān)[16]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可以刺激胞內(nèi)PA增加，這一過(guò)程對(duì)mTOR激活介導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放具有重要作用。佛波脂能加強(qiáng)細(xì)胞因子的釋放，而丁-1-醇卻阻滯這一過(guò)程，也說(shuō)明PLD2參與其中。然而，有研究表明PLD1是mTOR信號(hào)的效應(yīng)酶，并且也是Cdc42的下游分子。在血清刺激下，超表達(dá)衍生型PLD1能加強(qiáng)S6KⅠ的活性，而無(wú)活性PLD1的表達(dá)相對(duì)與對(duì)照組會(huì)減低S6KⅠ的活性。另外，干擾RNA（siRNA）干擾2種細(xì)胞系中PLD1能夠基本完全抑制血清刺激下S6K Ⅰ的激活[17]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，PLD1確實(shí)是mTOR激活的必需酶[18]。綜上，mTOR是PLD1產(chǎn)生PA的確定靶標(biāo)，并且這一途徑與磷酸肌醇3激酶生存通路同時(shí)存在。

2.2 PA是脂類(lèi)合成前體

PA能經(jīng)磷脂酸磷酸水解酶（phosphatidic acid phosphohydrolase，PAP）轉(zhuǎn)化生成脂質(zhì)第二信使DAG。PAP的變體PAP2b經(jīng)常出現(xiàn)在PLD2富集的膜區(qū)域，很有可能促進(jìn)PLD生成的PA快速轉(zhuǎn)化成DAG。DAG能夠激活經(jīng)典型和大多數(shù)PKC家族成員。PAP轉(zhuǎn)化PA生成DAG的種類(lèi)由PA二酰鏈的飽和度決定。值得注意的是，隨著DAG的飽和度增高，便不能在體內(nèi)激活PKC。因此，雖然這些高飽和度的DAG的作用還不清楚，但是它至少是消弱PLD生成PA信號(hào)的一種有效途徑。PA也可以通過(guò)磷脂酶A轉(zhuǎn)化成單酰基的LPA。LPA是一種有效的有絲分裂原，在細(xì)胞增殖、遷移和生存等過(guò)程中具有重要作用。但是有關(guān)PLD產(chǎn)生的PA轉(zhuǎn)化的LPA和DAG的具體作用還有待研究。

2.3 PA在囊泡運(yùn)輸、吞噬作用和胞外分泌中的功能

PLD及其產(chǎn)物PA與細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、吞噬作用和胞外分泌等功能密切相關(guān)。PLD可以通過(guò)激活A(yù)RF促進(jìn)高爾基體分泌泡形成。用一級(jí)醇（如乙醇）可以阻滯蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸，但外加含有PA的脂質(zhì)體能減弱這一過(guò)程。PA對(duì)蛋白質(zhì)的募集依賴于高爾基體反式面分泌泡的形成。但是PLD在囊泡形成中的作用仍不清楚，PLD在高爾基體上的定位也有待于進(jìn)一步研究。

相反，PLD在分泌泡形成和胞外分泌中的作用卻比較清楚，這一過(guò)程主要依賴于ARF的激活。這些過(guò)程都曾在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞和肥大細(xì)胞做過(guò)研究[8，19]。在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，ARF6專一性的通過(guò)PLD1依賴的PI-4，5-P2途徑啟動(dòng)胞外分泌。最新研究表明，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的過(guò)程是通過(guò)PLD1的PH域調(diào)控，并且PLD也與人支氣管內(nèi)皮細(xì)胞中鞘氨醇1-磷酸誘導(dǎo)的白介素-8分泌有關(guān)[9]。

PLD2是細(xì)胞內(nèi)吞作用中受體信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要媒介。表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)的傳導(dǎo)能被丁-1-醇阻滯，并且EGF與受體結(jié)合后會(huì)促使胞內(nèi)PA含量的增高，這都說(shuō)明PLD參與其中。PLD1和PLD2的超表達(dá)均能引起受體信號(hào)的加強(qiáng)，而它們失活型的超表達(dá)均引起受體胞內(nèi)信號(hào)的減弱[20]。μ-opioid受體MOR1與PLD2也有一定的功能性聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，能加強(qiáng)胞吞作用的受體會(huì)激活PLD2，而其他受體均不能激活PLD2。另外，受體信號(hào)的向內(nèi)傳導(dǎo)是ARF依賴性的[21]。由于MOR1信號(hào)的向胞內(nèi)傳導(dǎo)會(huì)被丁-1-醇或失活型PLD2的超表達(dá)阻滯，因此PLD2在受體信號(hào)向胞傳導(dǎo)中具有一定作用[21]。丁-1-醇和siRNA干擾PLD2均能阻滯谷氨酸受體介導(dǎo)的胞吞作用[22]。失活型PLD2的超表達(dá)和用siRNA干擾PLD2也均能阻滯血管緊張素Ⅱ受體信號(hào)引起的胞吞作用[9]?？傊荏w的胞吞是PLD2在細(xì)胞內(nèi)功能的重要體現(xiàn)。

PLD催化水解PC生成的PA具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)群芏喙δ埽▓D2）。PA能夠作為脂質(zhì)船塢募集蛋白，激活PI4P5-激酶生成PI-4，5-P2，具有增進(jìn)質(zhì)膜上脂質(zhì)融合的作用。生成的PI-4，5-P2通過(guò)募集CAPS促進(jìn)密集的囊泡進(jìn)行胞外分泌[23]。由于PLD將非增溶性脂質(zhì)PC轉(zhuǎn)化成增溶性脂質(zhì)PA，PLD在脂質(zhì)融合中的功能倍受重視。PA的頭部基團(tuán)和脂質(zhì)?；溳^小，也可以最大限度地降低內(nèi)膜曲面形成負(fù)曲率的活化能[24]。PA同樣可以更進(jìn)一步形成另外2種增溶性脂類(lèi)DAG和LPA[25]。LPA能夠通過(guò)PI3K/PKCzeta通路激活PLD的活性[26]，也能促進(jìn)PA所在膜反面曲率的形成[27]。LPAAT酶、endophilin又可以將PLA轉(zhuǎn)化生成PA從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞[28]。也有研究發(fā)現(xiàn)，添加PA能提高囊泡的融合率[29]。抑制PLD1的活性會(huì)減少質(zhì)膜外圍小葉上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶的數(shù)量，卻不能阻滯囊泡向質(zhì)膜的運(yùn)輸，這說(shuō)明PA的生成缺乏會(huì)導(dǎo)致膜融合受阻[8]。綜上所述，PLD生成的PA及其進(jìn)一步的代謝產(chǎn)物（如PLA）在質(zhì)膜融合和膜上囊泡形成中具有重要作用。

3 結(jié)論與展望

隨著對(duì)PLD1、PLD2的深入研究，以及最近對(duì)PLD3、PLD4、PLD5的克隆，哺乳動(dòng)物PLD的研究取得了重要進(jìn)展。確定PLD1、PLD2許多功能性基序和蛋白域，對(duì)加深了解PLD調(diào)控規(guī)律和體內(nèi)功能具有重要意義。PLD涉及到的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)與許多生理和病理過(guò)程相關(guān)，如在糖尿病及其并發(fā)癥中許多組織也有PLD功能紊亂的跡象；PLD在神經(jīng)退行性疾病中減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化填補(bǔ)損傷區(qū)域及促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面都起到一定的作用；PLD通過(guò)血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素、氧化型低密度脂蛋白和多巴胺受體D5等分子參與高血壓的發(fā)生；PDL也參與Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維中由胰島素或肌肉收縮引起的肌細(xì)胞葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)；在許多腫瘤組織中，PLD 的活性異常升高，大量的研究表明PLD與腫瘤的關(guān)系密切。因此，PLD已被廣泛認(rèn)為是目前藥物分子設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)，加快對(duì)它相關(guān)功能和特征的研究就有重要意義。

PLD參與的信號(hào)通路主要是與PA相互作用的靶標(biāo)蛋白質(zhì)及其功能有關(guān)，因此與PA直接作用的蛋白質(zhì)的研究成為目前研究的熱點(diǎn)，它們之間相互作用至少有2個(gè)功能，即調(diào)控酶的活性、募集特定膜蛋白。理論模型研究表明，PA在PLD功能發(fā)揮如質(zhì)膜融合中具有一定的作用。PA敏感蛋白TAPAS1、酵母Opilp的發(fā)現(xiàn)有助于更好地確定細(xì)胞內(nèi)PA水平的變化及其與PLD和靶標(biāo)的協(xié)調(diào)作用[30]。用質(zhì)譜分析等先進(jìn)的脂質(zhì)檢測(cè)方法可以分辨出一定刺激下細(xì)胞內(nèi)PA分子種類(lèi)的變化，確定出PA是來(lái)源于二酰甘油激酶作用多不飽和PA還是PLD酶解單不飽和PC或飽和PC。隨著質(zhì)譜分析靈敏度的提高，就可以通過(guò)分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析PA的分子種類(lèi)和分布，對(duì)PA的深層次研究有助于對(duì)PLD更加全面地了解。

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