影響靜止中心（QC）細胞分裂的EMS突變體庫構(gòu)建與篩選分析

劉文桂 須健

摘要：采用正向遺傳學(xué)方法，以轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis）SCRGVG UAS∶∶axr3-1為材料來進行EMS誘變。通過外源施加激素DEX誘導(dǎo)GVG/UAS系統(tǒng)啟動axr3-1在靜止中心表達，導(dǎo)致靜止中心發(fā)生分裂。通過構(gòu)建EMS突變體庫，得到2 616份M2代候選突變體家系。對M2代種子進行初篩得到43個候選家系。經(jīng)過復(fù)篩，獲得22個具有穩(wěn)定表型的突變體家系。根據(jù)表型相似性將候選家系分為 5類，共6 組。將候選家系進行組內(nèi)雜交，根據(jù) F1代植株表型是否與親本相似，獲得2對等位突變體。這些突變體將為研究干細胞小生境的調(diào)控機制研究提供新材料。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis）；根的發(fā)育；靜止中心；EMS突變體庫

中圖分類號：Q291 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1307-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.056

Construction and Screening of Arabidopsis EMS Mutant Library for the Effection of Divding Quiescent Center Cells

LIU Wen-gui，XU Jian

（National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China）

Abstract： A forward genetics approach were utilized to transgenic Arabidopsis SCRGVG UAS∶∶axr3-1 for EMS mutagenesis. The transgenic Arabidopsis SCRGVG UAS∶∶axr3-1 was expressed of axr3-1 specifically in the SCR-expressing cells in the presence of DEX， leading to cell divisions in the QC. An EMS mutant library was generated and a total of 2 616 M2 lines was obtained. Through a preliminarily screening of M2 lines，43 candidate lines were identified. A second round of screening was then performed and led to the identification of 22 candidate mutant lines that displayed stable phenotypes over generations. According to the phenotypic similarity， these candidate lines were divided into 5 categories，6 groups.And the candidate lines were hybridized in each groups. Based on the phenotypic similarity between the parental lines and F1 progeny，two pairs of allelic mutants were identified. The mutant materials would provide new materials for the study of mechanisms underlying the quiescence of the QC.

Key words： Arabidopsis； root development； quiescent center； EMS mutant library

在植物根冠與分生組織區(qū)交界處有一個根的組織中心（Organizing center），該處的細胞基本不發(fā)生分裂和分化，因此又稱為靜止中心（Quiescent center QC）。1954年Clowes[1]在玉米根尖中發(fā)現(xiàn)，頂端分生組織中最中央?yún)^(qū)域細胞分裂頻率很低或不分裂。利用放射自顯影技術(shù)，在玉米、蠶豆、洋蔥根尖中分生組織區(qū)中，有一個區(qū)域細胞幾乎沒有發(fā)生DNA的合成，因而確定無細胞的分裂，被命名為靜止中心。

擬南芥（Arabidopsis）的靜止中心可以追溯到第一次合子分裂后所產(chǎn)生的基細胞。經(jīng)過數(shù)次分裂后產(chǎn)生一長列細胞胚柄的最上端的子細胞即為胚根原細胞（Hypophysis）。而胚根是16細胞時期下側(cè)的8細胞產(chǎn)生的。在靜止中心的周圍是根的各類干細胞（Stem cell），它們通過不對稱分裂進行更新并產(chǎn)生可以分化為不同類型根細胞的子細胞來維持根的生長。靜止中心能夠產(chǎn)生一個小范圍的信號來調(diào)控其周圍干細胞的分裂與分化[2，3]，其覆蓋的區(qū)域通常稱為干細胞小生境（Stem cell niche），而干細胞分裂產(chǎn)生的一些子細胞正是由于超出了信號控制范圍才開始分裂和分化[4，5]。

植物根系是由根分生組織連續(xù)的細胞分裂和持續(xù)發(fā)育來維持的，其調(diào)控中心為靜止中心（QC），由WOX5的表達保持周圍干細胞的特性[6]。SCR（SCARECROW）由在中柱的SHR mRNA翻譯的蛋白激活而與中柱啟動子SHR結(jié)合形成復(fù)合物，對皮層內(nèi)皮層起始區(qū)（Cortex/endodermis initials CEI）、相關(guān)組織及內(nèi)皮層分化進行核定位。同時，SHR：SCR復(fù)合物在QC位置進行表達，調(diào)控QC的維持和分化；另一方面，WOX5（WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5）是WUSCHEL（WUS）的同源基因。它是根尖特異表達的啟動子，維持根部分生組織區(qū)干細胞的功能。WOX5功能缺失突變體表現(xiàn)為干細胞終止分化，靜止中心細胞的形狀發(fā)生改變，并且比正常的QC細胞大一些。

生長素通過對AUX/IAA蛋白水平生物調(diào)節(jié)快速誘導(dǎo)一系列生長素響應(yīng)基因的表達，完成生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Aux/IAA是一類穩(wěn)定性低的轉(zhuǎn)錄蛋白，外源生長素處理促進Aux/IAA蛋白的降解。這一特征暗示著Aux/IAA基因的高度表達能補充Aux/IAA蛋白總量。擬南芥基因編碼的Aux/IAA蛋白有29個，其結(jié)構(gòu)保守，序列由4個高度保守域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ）構(gòu)成[7-10]。域Ⅲ內(nèi)部的兩個區(qū)域具有同源性，形成βα1α2二聚體[9]，是DNA的結(jié)合位點。兩者主要的區(qū)別就是在區(qū)域Ⅱ中的一個脯氨酸突變成了亮氨酸。發(fā)生在功能區(qū)域Ⅱ的突變會造成顯性或半顯性的aux/iaa突變，而這段序列是生長素介導(dǎo)AUX/IAA降解所必需的，因此，這段序列發(fā)生突變會導(dǎo)致aux/iaa的蛋白趨于穩(wěn)定，減少生長素響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，進而抑制生長素反應(yīng)。經(jīng)過遺傳篩選，目前已知的Aux/IAA突變體都是顯性突變，突變位點都在結(jié)構(gòu)區(qū)域Ⅱ中，iaa17/axr3-1是其中的一個突變體[11]。

本試驗通過構(gòu)建SCRGVG UAS∶∶axr3-1 EMS 突變體庫，篩選與根尖靜止中心（QC）細胞分裂有關(guān)的突變體。GVG/UAS（GAL4-VP16-GR/upstream active sequence）GAL4/UAS系統(tǒng)是果蠅遺傳學(xué)中一種常用的異位表達系統(tǒng)。axr3-1是AXR3的一個突變體，屬于Aux/IAA中的一種。通過EMS處理SCRGVG UAS∶∶axr3-1獲得特異影響生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進而影響擬南芥根系QC分裂的突變體，將為研究干細胞小生境的調(diào)控機制研究提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

誘變材料是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室須健課題組保存的Columbia-0（Col-0）背景下的SCRGVG UAS∶∶axr3-1擬南芥種子。突變體庫初篩材料是誘變材料經(jīng)過EMS誘變之后自交繁種獲得的M2代種子。突變體庫復(fù)篩材料是具有表型的M2代植株自交繁種獲得的M3代種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 EMS誘變方法 稱取 0.1 g約5 000粒M0 代種子作為誘變材料，將種子浸泡在磷酸緩沖液中 4 ℃過夜，再加入EMS至終濃度0.4%，室溫下微動孵育8 h。之后用水將 EMS 洗掉，接觸過 EMS的試劑或耗材都需經(jīng)過特殊處理之后分類處理。用0.1%瓊脂糖懸浮 M1代種子點種在營養(yǎng)土中，22 ℃ 16/8 h光/暗培養(yǎng)。最終收獲約 2 616個可用于篩選的M2代家系[12]。

1.2.2 種子滅菌及幼苗生長培養(yǎng)條件 0.5×MS培養(yǎng)基配制：2.15 g/L MS 粉末，添加 10 g/L 蔗糖、0.5 g/L MES、1%瓊脂，pH為5.8，高壓滅菌備用。擬南芥種子去除果莢之后晾干。取適量種子裝在1.5 mL 離心管中，加入1 mL 15%次氯酸鈉，振動篩上搖晃，消毒10 min后快速離心，用滅過菌的去離子水清洗3遍，然后用0.1%的瓊脂懸浮。將滅過菌的擬南芥種子點種在含有0.5×MS和腎上腺皮質(zhì)類激素地塞米松（DEX）的培養(yǎng)基方皿上，封口置于4 ℃冰箱春化2 d，再在培養(yǎng)架上培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)條件均為 22 ℃ 16/8 h光/暗培養(yǎng)。

1.2.3 DEX 處理方法及篩選 用DEX處理的種子在培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μmol/L的DEX，處理7 d 后觀察野生型與候選突變體的主根長的表型差異，用相機（Canon EOS 40D）拍照，用熒光體式顯微鏡（Leica MZ 16F）觀察其熒光表達模式及強度并拍照，并用激光共聚焦顯微鏡（LEICA SP2）觀察QC位置細胞分裂及GFP的情況。培養(yǎng)生長條件為22 ℃ 16/8 h光/暗培養(yǎng)。

為了確定誘導(dǎo)激素DEX的最佳濃度，分別用2.5、5.0、10.0 μmol/L DEX培養(yǎng)基處理突變體SCRGVG UAS∶∶axr3-1，以加入二甲基亞砜（DMSO）的1/2 MS培養(yǎng)基作為對照，以擬南芥突變體主根的生長情況、靜止中心位置GFP熒光分布及強度為指標(biāo)，連續(xù)觀察第5、6、7、8天幼苗的生長情況。用Image J軟件分別測出每天的主根長度，得到根長平均值。重復(fù)4次。

1.2.4 雜交和等位突變體判斷 將表型一致或相似的突變體分成小組，各小組樣本相互雜交獲得 F1代種子。雜交方法參照吳曉丹等[12]的方法。將F1代種子點種在終濃度為5 μmol/L的DEX 培養(yǎng)基上。分析F1代植株及親本表型，若F1代植株具有和親本相似的表型，則這兩個親本為等位突變體，反之則不是等位突變體。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEX濃度篩選結(jié)果

不同濃度DEX處理下擬南芥突變體主根根長在7 d之后均不再增長，第7天和第8天的幼苗根長長度較長。第7天和第8天，5 μmol/L DEX處理下主根根長略長于其他濃度下的根長（圖1）。初步確定選用7、8 d為處理天數(shù)。

通過觀察靜止中心及根尖干細胞位置的GFP分布及強弱情況，發(fā)現(xiàn)7 d時，5.0 μmol/L的DEX處理擬南芥突變體主根靜止中心位置GFP強度較強，GFP表達更為均勻，且可以初略看到靜止中心位置細胞發(fā)生了分裂（圖2）。所以最終確定以5 μmol/L的DEX處理7 d的幼苗為篩選的適合條件。

2.2 轉(zhuǎn)基因材料SCRGVG UAS∶∶axr3-1在DEX處理下的表型觀察

由于axr3-1是組織性表達的生長素抑制子，表現(xiàn)為抑制根的生長，在胚根發(fā)育生長時就開始表達，從而會影響根部的發(fā)育萌芽。采用誘導(dǎo)系統(tǒng)GVG/UAS，用外源皮質(zhì)類激素DEX誘導(dǎo)后才能進行表達，從而有利于根部的生長。將生長5 d的種子移入含5.0 μmol/L DEX的0.5×MS培養(yǎng)基處理，觀察8、24、36、48 h，3 d時分生區(qū)及QC位置細胞的變化，在激光共聚焦顯微鏡（LEICA SP2）和熒光體式顯微鏡（（Leica MZ 16F）下拍照，觀察到DEX促進了轉(zhuǎn)基因材料QC位置細胞的分裂，說明 DEX誘導(dǎo)了系統(tǒng)表達，使QC位置細胞分裂（圖3）。

2.3 候選家系分組及等位突變體獲得

將獲得的M3代進行復(fù)篩，得到表型穩(wěn)定的相關(guān)候選家系43個。在對候選家系復(fù)篩時，以候選家系在1/2 MS上培養(yǎng)為對照組，用以確定篩選到的候選家系中的DEX誘導(dǎo)體系沒有發(fā)生突變，DEX處理后可以誘導(dǎo)GFP表達及產(chǎn)生靜止中心區(qū)域表型。經(jīng)過2次復(fù)篩，最終獲得具有穩(wěn)定表型候選家系22個（表1）。依據(jù)其表型的類似度將其分為5類，共6組，具體分組依據(jù)及每一組突變體編號如表1所示，通過組內(nèi)的兩兩雜交試驗，最后得到2對等位突變體，分別為第二類中的19-15-3與4-112-1，第四類中的20-7-1與21-2-1。

3 討論

本試驗構(gòu)建了SCRGVG UAS∶∶axr3-1擬南芥轉(zhuǎn)基因體系，誘導(dǎo)系統(tǒng)GVG/UAS的存在而進行異位表達。

由于植物細胞的不可移動性，植物干細胞小生境又是植物生長發(fā)育的源泉和信號調(diào)控中心，所以根尖分生區(qū)細胞的活性對植物整個根系的發(fā)育具有重要意義。近年來，通過對擬南芥根尖干細胞小生境的研究，發(fā)現(xiàn)通過激素和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)作用，靈活地調(diào)控干細胞小生境的特化與維持。面對不同環(huán)境，植物干細胞小生境會做出復(fù)雜的應(yīng)答機制，但目前研究者對這個機制了解不多。

根尖靜止中心的生長素濃度是最高的[11]，由此可見，此處的生長素信號可能具有重要作用。目前，發(fā)現(xiàn)了靜止中心和柱干細胞之間WOX5/ACR4/CLE的反饋調(diào)節(jié)途徑。現(xiàn)在的研究結(jié)果主要集中于靜止中心上方細胞的分裂分化行為，與已有的途徑不能整合，根尖干細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需大量補充。通過對相關(guān)轉(zhuǎn)基因材料的突變體的分析，研究根尖表型并找出相關(guān)基因，可以進一步闡明靜止中心生長素信號網(wǎng)絡(luò)，明確QC及周圍干細胞調(diào)控的分子機制。

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