非洲紫羅蘭轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的抑菌分析

國(guó)會(huì)艷 郝愛平 賈園園 李繼光 張曉軍

摘要：以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將白樺花發(fā)育相關(guān)基因Bp1AGL對(duì)非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl）進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)設(shè)置單一變量研究轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的抑菌方法。結(jié)果表明，在暗培養(yǎng)60 h，侵染時(shí)間為6 min，農(nóng)桿菌活化菌液OD600 nm為0.5，暗培養(yǎng)覆蓋無(wú)菌紙膜的條件下，抑菌效果良好，轉(zhuǎn)基因效率更高。

關(guān)鍵詞：非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl）；轉(zhuǎn)基因；BplAGL；抑菌

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）05-1301-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.054

Analysis on the Bacteriostatic Test of the Transgenic Process of African Violet

GUO Hui-yan1， HAO Ai-ping1， JIA Yuan-yuan2， LI Ji-guang1， ZHANG Xiao-jun1

（1. Department of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157012， Heilongjiang， China；

2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：Bp1AGL gene related to floral development from Betula platyphylla was introduced into African violet （Saintpaulia ionantha Wendl） by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. On this basis， the bacteriostatic methods by setting single variable in the transgenic process were studied. The results showed that the dark cultivate time was 60 hours， the infection time was 6 minutes，the OD600 nm value of agrobacterium was 0.5，and covered sterile paper film in the dark cultivation stage， bacteriostatic effect and transgenic efficiency were higher than other methods.

Key words： African violet（Saintpaulia ionantha Wendl）；transgene； BplAGL；bacteriostatic

自1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草問世以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛。目前，全球試種的轉(zhuǎn)基因植物超過(guò)4 500種，種植面積達(dá)到5 870 hm2以上，其中大豆、棉花、油菜、番茄、馬鈴薯、煙草、南瓜、甜瓜等8種轉(zhuǎn)基因作物34個(gè)品種實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)[1，2]。楊郁文等[3]首次將花分生組織決定基因APETALA1轉(zhuǎn)入油菜，并且通過(guò)分子檢測(cè)和性狀觀察證明了APETALA1基因成功轉(zhuǎn)入并得到了有效表達(dá)，轉(zhuǎn)基因油菜植株生長(zhǎng)正常，花形、花色與野生型無(wú)明顯差異，且開花期比未轉(zhuǎn)基因油菜提前近15 d。譚琳等[4]利用DNA直接導(dǎo)入法將含有SARS S1基因的植物表達(dá)載體pCS1導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法得到12株再生番茄小苗，PCR、Southern雜交檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，有6株為轉(zhuǎn)基因植株。李司等[5]以胡蘿卜種子的下胚軸為外植體，分別將2種不同外源目的基因?qū)朕r(nóng)桿菌LBA4404進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR、Southern-blot和RT-PCR檢測(cè)，選取轉(zhuǎn)基因成功并正常轉(zhuǎn)錄的T1代植株分別進(jìn)行有性雜交，獲取T1代雜交種子。同年秋季播種長(zhǎng)出T2代植株，經(jīng)檢測(cè)得到含有2種目的基因且蛋白表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜。楊光等[6]利用相同試驗(yàn)體系對(duì)VvAG、VvAP3、VvFLC、VvFUL、VvFT、VvAP2、VvSOC1等7個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，這些基因在葡萄的花、果實(shí)以及營(yíng)養(yǎng)器官中都有不同程度的表達(dá)。丁燕等[7]用RT-PCR法在柿花中擴(kuò)增得到1個(gè)343 bp的片段，再利用RACE法分別獲得3′端1 096 bp和5′端411 bp的目的片段，拼接后獲得1 193 bp全長(zhǎng)基因，命名為DkMADS1，DkMADS1基因在柿萼片、花瓣、子房中均表達(dá)，而在葉片中不表達(dá)，該基因在花器官中表達(dá)，推測(cè)其與花發(fā)育有關(guān)。

非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl），株高一般為15～30 cm，植株表面布滿絨毛。葉片基生，長(zhǎng)圓狀心形或卵圓形，長(zhǎng)6～7 cm，肉質(zhì)，全緣，先端鈍。花單生或聚生，花徑2～3.5 cm，二唇狀，唇2裂，下唇3裂，裂片橢圓形，蒴果有毛[8]。東北林業(yè)大學(xué)林木育種實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了白樺花期時(shí)序消減文庫(kù)，確定了一些有價(jià)值的EST序列，克隆了若干有價(jià)值的基因，BplAGL即是其中之一[9]。BplAGL屬于AG亞家族的一員，BplAGL長(zhǎng)度為1 179 bp，其中編碼區(qū)為723 bp，編碼240個(gè)氨基酸。由24～74位共51個(gè)氨基酸構(gòu)成MADS-box，由89～188位共100個(gè)氨基酸構(gòu)成K-box[10]。本試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將BplAGL基因進(jìn)行轉(zhuǎn)入非洲紫羅蘭中，設(shè)置單一變量研究試驗(yàn)過(guò)程中的抑菌方法，為轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)做基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲紫羅蘭組培苗，組培室培養(yǎng)。LBA4404工程菌，-80 ℃保存。MS液體和固體培養(yǎng)基，1/2MS液體和固體培養(yǎng)基。LB液體和固體培養(yǎng)基?？敲顾?、頭孢霉素、6-BA、NAA。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA。生根培養(yǎng)基1/2MS+1.0 mg/L NAA。

1.2 方法

1.2.1 暗培養(yǎng)時(shí)間篩選 選擇生長(zhǎng)旺盛，14～15片真葉期的非洲紫羅蘭上部葉片作為轉(zhuǎn)化材料。剪掉葉片邊緣，將葉片剪成小塊（0.5 cm×0.5 cm）。將葉片轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌菌液中浸染6 min，輕輕攪動(dòng)菌液，使葉盤和菌液充分接觸。取出葉片用無(wú)菌水洗3次，每次30 s，用滅菌的濾紙吸干。將葉面展開，正面朝上，接種在MS固體培養(yǎng)基上，使傷口處貼在培養(yǎng)基表面，加無(wú)菌紙膜覆蓋在葉片上。重復(fù)以上步驟共做4組，將4組培養(yǎng)皿包好，分別放于恒溫箱中23 ℃暗培養(yǎng)48、60、72、84 h。在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入頭孢（終濃度為600 mg/L），卡那霉素（終濃度為50 mg/L），把暗培養(yǎng)平板上的葉片轉(zhuǎn)接到光培養(yǎng)基上，將傷口處貼在培養(yǎng)基表面，正面朝上。將培養(yǎng)皿用雙層封口膜封好，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，光照培養(yǎng)周期16 h/8 h），觀察所培養(yǎng)植物組織是否有農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。

1.2.2 浸染時(shí)間篩選 將切好的葉盤外植體放入到農(nóng)桿菌菌液中分別浸染5、6、7、8 min，輕輕晃動(dòng)菌液，使葉盤和菌液充分接觸，暗培養(yǎng)時(shí)間均為60 h，其他步驟同上。

1.2.3 菌液OD值選擇 將葉片轉(zhuǎn)入到OD600 nm分別為0.4、0.5、0.6、0.7的4組農(nóng)桿菌菌液中分別浸染6 min，輕輕攪動(dòng)菌液，使葉盤和菌液充分接觸。暗培養(yǎng)時(shí)間均為60 h，其他步驟同上。

1.2.4 無(wú)菌紙膜的覆蓋與否 農(nóng)桿菌浸染完畢后，一組將無(wú)菌紙膜覆蓋在葉片上，另一組不覆蓋無(wú)菌紙膜。暗培養(yǎng)時(shí)間均為60 h，其他步驟同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗培養(yǎng)時(shí)間的確定

暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)使植物組織受到毒害而死亡；暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，外源基因不能充分地進(jìn)入受體植株，轉(zhuǎn)化率會(huì)大大降低。因此，農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)時(shí)間是整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。從圖1可以看出，在48 h和60 h的暗培養(yǎng)條件下，非洲紫羅蘭葉片周圍無(wú)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，說(shuō)明抑菌效果較理想；在72 h和84 h的暗培養(yǎng)條件下，葉片周圍布滿了農(nóng)桿菌，說(shuō)明抑菌效果很差。因此，暗培養(yǎng)時(shí)間選擇為60 h，因?yàn)樵跊]有農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的情況下，暗培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，農(nóng)桿菌與被侵染植株共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，外源基因進(jìn)入受體植株的幾率越大，轉(zhuǎn)化率也就越高。

2.2 浸染時(shí)間的確定

農(nóng)桿菌浸染時(shí)間是影響遺傳轉(zhuǎn)化率的重要因子。從圖2可以看出，浸染時(shí)間為5、6 min時(shí)非洲紫羅蘭葉片周圍無(wú)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；浸染時(shí)間為7、8 min時(shí)葉片周圍布滿農(nóng)桿菌，說(shuō)明浸染時(shí)間5～6 min抑菌效果較好，確定最佳浸染時(shí)間為6 min，因?yàn)樵诓婚L(zhǎng)農(nóng)桿菌的情況下浸染時(shí)間越長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因效率越高。

2.3 菌液OD600 nm的確定

合適的菌液濃度有助于提高轉(zhuǎn)化效率。菌液濃度太低，接種的葉片傷口面的農(nóng)桿菌數(shù)量太少，轉(zhuǎn)化率低；菌液濃度過(guò)高，常導(dǎo)致農(nóng)桿菌繁殖過(guò)度，對(duì)植物組織產(chǎn)生毒害，同樣降低轉(zhuǎn)化效率。從圖3可以看出，菌液OD600 nm在0.4和0.5時(shí)，非洲紫羅蘭葉片周圍無(wú)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；菌液OD600 nm在0.6和0.7時(shí)，葉片周圍布滿農(nóng)桿菌，所以確定浸染時(shí)菌液最佳OD600 nm為0.5，因?yàn)樵谌~片周圍沒有農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的情況下，OD600 nm越高轉(zhuǎn)化率越高。

2.4 無(wú)菌紙膜的覆蓋

農(nóng)桿菌是好氧型細(xì)菌，控制其與氧氣的接觸可以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。圖4（A）中覆蓋無(wú)菌紙膜的非洲紫羅蘭葉片周圍無(wú)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；而未覆蓋無(wú)菌紙膜（B）的葉片周圍布滿農(nóng)桿菌，結(jié)果表明覆蓋無(wú)菌紙膜對(duì)農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)起到一定的抑制作用。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置單一變量的方法，研究非洲紫羅蘭轉(zhuǎn)基因過(guò)程中農(nóng)桿菌的抑制情況。通過(guò)試驗(yàn)，初步建立了轉(zhuǎn)基因過(guò)程中較好的抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的條件：暗培養(yǎng)時(shí)間為60 h，浸染時(shí)間6 min，農(nóng)桿菌菌液最佳OD600 nm為0.5，轉(zhuǎn)入暗培養(yǎng)時(shí)覆蓋無(wú)菌紙膜。

謝秀禎等[11]通過(guò)對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玫瑰茄細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化研究得到，農(nóng)桿菌菌液OD600 nm超過(guò)0.55后，不僅BplAGL基因的瞬時(shí)表達(dá)率有所降低，而且暗培養(yǎng)后再進(jìn)行光培養(yǎng)外植體周圍被農(nóng)桿菌包圍，最后褐化死亡。暗培養(yǎng)時(shí)間必須超過(guò)16 h，但如果暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)因?yàn)檗r(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致植物細(xì)胞受到毒害而死亡。由此看來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的抑制農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)試驗(yàn)直接關(guān)系到轉(zhuǎn)基因工作的成敗，所以本試驗(yàn)的研究能夠?yàn)橄乱徊紹plAGL基因?qū)Ψ侵拮狭_蘭的遺傳轉(zhuǎn)化提供一定的參考。

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