多菌復(fù)合固態(tài)發(fā)酵富硒豆粕的工藝優(yōu)化

邱豐艷 陳柳花 林標(biāo)聲 楊小燕

摘要：研究了移動(dòng)袋裝多菌復(fù)合固態(tài)發(fā)酵富硒豆粕的最佳生產(chǎn)工藝條件。選用地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌4種菌株，通過(guò)移動(dòng)袋裝固態(tài)發(fā)酵技術(shù)復(fù)合發(fā)酵富硒豆粕，利用響應(yīng)面分析法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行品質(zhì)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，豆粕富硒發(fā)酵的最優(yōu)菌株配比為地衣芽孢桿菌∶釀酒酵母∶產(chǎn)朊假絲酵母∶嗜酸乳桿菌=2∶1∶2∶2；亞硒酸鈉、豆粕、菌液接種量為影響發(fā)酵過(guò)程中重要的3個(gè)因素，其最佳配比為亞硒酸鈉19.43 mg/kg、豆粕91.38%、菌液接種量11.62%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在該條件下有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率能達(dá)到55.48%；富硒豆粕發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)檢驗(yàn)，其直觀評(píng)價(jià)、有機(jī)硒含量、營(yíng)養(yǎng)成分、有害物質(zhì)等指標(biāo)均得到明顯改善，符合國(guó)家《飼料添加劑安全使用規(guī)范》。豆粕經(jīng)多菌株聯(lián)合富硒發(fā)酵，其產(chǎn)品性能得到明顯改善，是一種優(yōu)質(zhì)的富硒菌制劑和功能性蛋白飼料。

關(guān)鍵詞：固態(tài)發(fā)酵；復(fù)合菌；富硒；豆粕；響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào)：S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）05-1247-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.040

Optimization of the Solid-state Fermentation of Soybean Pulp Enriching

Selenium by Compound Bacteria

QIU Feng-yan1，CHEN Liu-hua1，LIN Biao-sheng1，2，YANG Xiao-yan1，2

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，F(xiàn)ujian，China；

2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology， Longyan 364012， Fujian，China）

Abstract： The optimum process conditions of soybean pulp enriching selenium solid-state fermentation by compound bacteria in the mobile bag were studied， the four strains Bacillus licheniformi， Saccharomyces cerevisiae， Candida utilis， Lactobacillus acidophilus were used in soybean meals enriching selenium fermentation by moving solid-state fermentation technology， and the response surface method was used to optimize the fermentation conditions， then the product quality was inspected. The results revealed that the optimal conditions of soybean pulp enriching selenium fermentation were as flows： the ratio of Bacillus licheniformi， Saccharomyces cerevisiae， Candida utilis to Lactobacillus acidophilus was 2∶1∶2∶2. Sodium selenite， soybean pulp and inoculum size were the three main factors in fermentation， its proportioning were 19.43 mg/kg，91.38%，11.62%， respectively. On the optimized conditions， the convert ratio of organic selenium transformation can achieve to 55.48%. The product quality of soybean meals enriching selenium fermentation was inspected， its visual evaluation， the content of organic selenium， nutrition， and other harmful substances indicators had improved significantly， comply with the national standard “Specification for the safe use of feed additives”. Overall， through compound bacteria enriching selenium fermentation， the product performance of soybean pulp had improved significantly， it was good bacteria preparation and functional protein feed.

Key words： solid-state fermentation； compound bacteria； selenium-enriched； soybean pulp； response surface method

硒是動(dòng)物體必需的微量元素之一[1]，在動(dòng)物體內(nèi)有多種功能，其基本作用是作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的組成成分，參與消除已生成的過(guò)氧化物而起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用[2]。硒攝入不足會(huì)引起仔豬的白肌病和桑葚心、豬的營(yíng)養(yǎng)性肝病、產(chǎn)生PSE肉等動(dòng)物缺硒疾病[3]。但如果直接在動(dòng)物飼料中添加無(wú)機(jī)硒，安全性較差[4]。近年來(lái)，人們通過(guò)動(dòng)物、植物、微生物作為轉(zhuǎn)化載體來(lái)獲取有機(jī)硒，取得了較大的進(jìn)展[5]，如啤酒酵母液體富硒發(fā)酵等[6]，但液體發(fā)酵有機(jī)硒，成本高，廢液排放量大，對(duì)環(huán)境污染大[7]。豆粕是動(dòng)物飼料蛋白資源的首選，畜牧業(yè)需求旺盛，微生物發(fā)酵豆粕能夠較好地利用豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕利用率，成為豆粕飼料應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)[8]，但傳統(tǒng)的堆積發(fā)酵豆粕，存在著發(fā)酵溫度、水分不易控制，雜菌污染嚴(yán)重的問(wèn)題。為此，本研究將有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和豆粕發(fā)酵結(jié)合起來(lái)，采用呼吸膜裝置進(jìn)行移動(dòng)袋裝固態(tài)發(fā)酵，將有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和發(fā)酵豆粕生產(chǎn)結(jié)合，已經(jīng)轉(zhuǎn)化的有機(jī)硒直接保留于豆粕原料中，豆粕大分子蛋白降解為可以被動(dòng)物直接消化吸收的小分子蛋白，使得產(chǎn)品成為一種優(yōu)質(zhì)的、含微量元素硒的功能性蛋白飼料[9]。移動(dòng)固體發(fā)酵富硒豆粕有效地解決了液體發(fā)酵有機(jī)硒的難題，且發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵占地少，溫度、水分控制精確，雜菌污染少，生產(chǎn)效率大大提高，具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景[10]。本試驗(yàn)選用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）4種菌株，通過(guò)移動(dòng)袋裝固態(tài)發(fā)酵技術(shù)復(fù)合發(fā)酵富硒豆粕，利用響應(yīng)面分析法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行品質(zhì)檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌，均為凍干菌粉，龍巖學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，各有效菌經(jīng)液體活化后活菌數(shù)均為1 010 個(gè)/mL。

豆粕：市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，蛋白含量40.26%（采用凱氏定氮法測(cè)定）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 多菌復(fù)合固態(tài)發(fā)酵富硒豆粕工藝流程如下：

發(fā)酵菌種→37 ℃紅糖水活化

↓

發(fā)酵原料→混合→呼吸膜包裝、密封→發(fā)酵（溫度、時(shí)間）→檢測(cè)產(chǎn)品（營(yíng)養(yǎng)成分、有機(jī)硒含量）。

1.2.2 微生物菌株配比對(duì)豆粕富硒發(fā)酵的影響 采用地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌4種菌株，每種菌株活菌數(shù)取值1.0×1010 個(gè)/mL或2.0×1010個(gè)/mL，按L8（27）正交試驗(yàn)表安排8組代表各菌株用量的比例組合，將設(shè)定的各菌比例、總菌量按10%接種量加入37 ℃溫水?dāng)嚢?，活?0 min，溫水中含總發(fā)酵物料10%紅糖。菌株活化后，與89%豆粕、1%硫酸銨混合均勻，按15 mg/kg比例添加亞硒酸鈉，并補(bǔ)充水分至總發(fā)酵物料的30%，用裝量20 kg呼吸膜包裝、密封，30 ℃發(fā)酵7 d，發(fā)酵后檢測(cè)分析、對(duì)比產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)，選定最適的菌株組合比例用于下一步響應(yīng)面分析試驗(yàn)。各指標(biāo)的檢測(cè)方法參照國(guó)家飼料檢測(cè)分析標(biāo)準(zhǔn)[11]，檢測(cè)指標(biāo)包括總菌數(shù)、粗蛋白、多肽、乳酸含量和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率。菌體總數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法、粗蛋白采用凱氏定氮法、多肽含量測(cè)定采用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法、乳酸含量測(cè)定采用試劑盒乳酸脫氫酶法，硒含量的測(cè)定采用3，3-二氨基聯(lián)苯胺比色法[12]，有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率=（總硒含量-無(wú)機(jī)硒含量）/總硒含量×100%[7]。

1.2.3 豆粕富硒發(fā)酵效果關(guān)鍵因素篩選的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在含呼吸膜的20 kg裝量發(fā)酵袋中按設(shè)定的比例接入發(fā)酵原料（亞硒酸鈉、豆粕、硫酸銨）、紅糖水活化后的發(fā)酵混合菌株，并按比例補(bǔ)足水分，包裝、密封，在設(shè)定的溫度下進(jìn)行發(fā)酵5～10 d，定時(shí)取樣測(cè)定，檢驗(yàn)發(fā)酵效果。采用響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以白玉菇菌糠發(fā)酵后亞硒酸鈉有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值篩選影響發(fā)酵效果的顯著因素，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表1。

1.2.4 豆粕富硒發(fā)酵效果的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)響應(yīng)值影響顯著的關(guān)鍵因素進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定影響豆粕富硒發(fā)酵效果的最佳工藝條件，并進(jìn)行最佳工藝條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.5 富硒發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn) 將未發(fā)酵前培養(yǎng)基的組成和最佳工藝條件下生產(chǎn)的富硒發(fā)酵豆粕產(chǎn)品進(jìn)行品質(zhì)檢驗(yàn)，包括直觀評(píng)價(jià)、pH、有機(jī)硒、粗蛋白、粗灰分、乳酸、總有益菌、胰蛋白酶抑制劑含量等，對(duì)比發(fā)酵前后各項(xiàng)指標(biāo)的變化，分析豆粕富硒發(fā)酵后產(chǎn)品性能的變化情況。pH采用梅特勒FE.20 pH計(jì)測(cè)定；粗灰分采用坩堝灼燒法測(cè)定；總氨基酸含量采用S433D全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定；粗纖維采用酸堿消煮法測(cè)定；粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定；脲酶采用酚紅試劑法測(cè)定；生物素采用高效液相色譜法測(cè)定，以上各檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)方法同樣參照國(guó)家飼料檢測(cè)分析標(biāo)準(zhǔn)[11]，其他檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定方法同上。胰蛋白酶抑制因子的測(cè)定參照GB/T 21498-2008[13]、植物血球凝集素測(cè)定采用凝集效價(jià)法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕富硒發(fā)酵各微生物菌株配比的確定

各菌株質(zhì)量濃度比按L8（27）的正交試驗(yàn)表設(shè)定，加入原料按工藝流程進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)束后檢測(cè)分析產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，各菌株試驗(yàn)組合中，當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌菌體量比例高時(shí)，總菌數(shù)、多肽含量較高，培養(yǎng)基中剩余的粗蛋白含量較低，原因可能是地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)速度較快且其產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)[15]，所以能在發(fā)酵培養(yǎng)基中大量生長(zhǎng)，分泌胞外蛋白酶降解豆粕粗蛋白獲得大量的多肽，培養(yǎng)基中豆粕剩余的粗蛋白含量就較少；但當(dāng)釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌含量較高時(shí)，對(duì)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)造成一定影響，因而總菌數(shù)降低、多肽含量降低、粗蛋白含量較高；嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)有受到地衣芽孢桿菌的影響，當(dāng)嗜酸乳桿菌含量較高時(shí)，培養(yǎng)基中的乳酸含量較高，而乳酸含量較高則有利于提高產(chǎn)品風(fēng)味、刺激采食，但乳酸太高、酸味太重也會(huì)影響采食；各菌株對(duì)有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率也有所不同，釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母菌體含量較高時(shí)，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率較高。此外，由于具有富集硒和胞內(nèi)大量積累谷胱甘肽（GSH）的功能，產(chǎn)朊假絲酵母近年來(lái)廣泛應(yīng)用于富硒酵母的制備，其不僅可以補(bǔ)充硒還可以提高機(jī)體的免疫力[16]。因此，綜上所述，選定地衣芽孢桿菌∶釀酒酵母∶產(chǎn)朊假絲酵母∶嗜酸乳桿菌=2∶1∶2∶2的比例組合，此條件下各菌株能較好地協(xié)同生長(zhǎng)、代謝，發(fā)酵產(chǎn)物的各項(xiàng)指標(biāo)能達(dá)到較好的平衡。

2.2 豆粕富硒發(fā)酵效果關(guān)鍵因素的篩選結(jié)果

利用Minitab 15軟件對(duì)表1的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行擬合和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。結(jié)果表明，影響豆粕富硒發(fā)酵效果的因素重要性排序是亞硒酸鈉（X1）>豆粕（X3）>菌液接種量（X5）>發(fā)酵物料含水量（X6）>發(fā)酵溫度（X7）>發(fā)酵時(shí)間（X8）>硫酸銨（X4）>紅糖（X2）。其中，亞硒酸鈉（X1）、豆粕（X3）、菌液接種量（X5）對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到了顯著水平，因此，選定這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

以有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Benhnken設(shè)計(jì)，三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。利用Design-Expert 7.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率和各因素變量之間的二元回歸方程為Y=+55.74+1.75×A+1.09×B+0.21×C+0.62×A×B-0.28×A×C+0.61×B×C-1.68×A2-1.56×B2-1.54×C2，對(duì)回歸模型進(jìn)行方程分析，結(jié)果見(jiàn)表6所示。結(jié)果表明，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.070 8>0.05），表明回歸方程擬合情況好，誤差小，能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以利用該方程確定影響豆粕富硒發(fā)酵效果的最佳工藝條件。從各因素方差分析結(jié)果可以看出，對(duì)響應(yīng)值有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率影響的大小順序?yàn)閬單徕c（A）、豆粕（B）、菌液接種量（C），其中亞硒酸鈉（A）和豆粕（B）對(duì)響應(yīng)值結(jié)果影響顯著。

各因素響應(yīng)面曲面分析結(jié)果如圖1所示，根據(jù)所得的模型可預(yù)測(cè)得到最佳豆粕富硒發(fā)酵工藝條件為亞硒酸鈉19.43 mg/kg、豆粕91.38%、菌液接種量11.62%，在該條件下有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率能達(dá)到56.30%。分別按上述的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率平均為55.48%，比Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)的響應(yīng)值50.58% 提高4.9個(gè)百分比，與理論預(yù)測(cè)值56.30%接近，重復(fù)性較好，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化所得的參數(shù)準(zhǔn)確、可靠、可行，且能進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，取得更優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 富硒發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn)

富硒發(fā)酵豆粕發(fā)酵前后產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明豆粕富硒發(fā)酵后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均得到了明顯改善，其培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成了有機(jī)硒，發(fā)酵后產(chǎn)生了大量的乳酸，pH下降，有較為明顯的乳酸味、酒香味；發(fā)酵后富硒豆粕的粗蛋白、多肽、粗脂肪、總氨基酸、生物素等營(yíng)養(yǎng)成分均明顯高于發(fā)酵前，而畜禽不易利用的粗纖維成分含量降低，但干物質(zhì)由于發(fā)酵過(guò)程中的損失而下降，粗灰分含量有所升高；發(fā)酵后豆粕中的脲酶、胰蛋白酶抑制劑、植物血球凝集素3種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量明顯降低，符合國(guó)家《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1224號(hào)，2009年）。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)多菌聯(lián)合發(fā)酵制備富硒發(fā)酵豆粕，發(fā)酵后其粗蛋白、多肽的含量有所增加，有利于滿足動(dòng)物體內(nèi)蛋白需求，表明菌體發(fā)酵過(guò)程中能利用非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，且菌體產(chǎn)生的各種胞外酶能有效地分解大分子蛋白為多肽，大大提高了豆粕蛋白的利用效率[17]。酵母菌近年來(lái)被廣泛運(yùn)用于豆粕的富硒發(fā)酵，其對(duì)有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率較高，易生長(zhǎng)、富集作用強(qiáng)[18]，特別是產(chǎn)朊假絲酵母還具有胞內(nèi)大量積累谷胱甘肽的功能，不僅可以補(bǔ)充硒還可以提高機(jī)體的免疫力，是無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的理想載體，本試驗(yàn)中無(wú)機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了50%以上，效果顯著，能有效地滿足動(dòng)物機(jī)體對(duì)硒的需求?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)酶量較高，其與酵母菌、乳酸菌混合發(fā)酵，有利于發(fā)酵豆粕中的多肽含量的增加，且枯草芽孢桿菌還能大量分泌纖維素酶，其添加有利于底物纖維素含量的降低[19]。此外，微生物發(fā)酵過(guò)程中，消耗了部分有機(jī)物，發(fā)酵后產(chǎn)品的干物質(zhì)量有所減少，且由于發(fā)酵過(guò)程添加了多菌株等成分，發(fā)酵后產(chǎn)品灰分含量有所增加[20]。研究表明，經(jīng)多菌株聯(lián)合發(fā)酵，豆粕中脲酶、胰蛋白酶抑制劑、植物血球凝集素抗?fàn)I養(yǎng)因子能夠得到明顯的消除，大大提高了豆粕的利用效率[21，22]，與本研究結(jié)果一致。添加的嗜酸乳桿菌使得發(fā)酵富硒豆粕產(chǎn)品的直觀評(píng)價(jià)有了較為明顯的改善，產(chǎn)品比發(fā)酵前出現(xiàn)了明顯的乳酸味、酒香味，有利于刺激動(dòng)物采食，提高飼料的利用率，降低料肉比，促進(jìn)生長(zhǎng)[23]。

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