大豆14-3-3蛋白與轉(zhuǎn)錄因子蛋白GmMYB173的互作

董 萌高友菲韓天富東方陽蔣炳軍，*

1河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院， 河北秦皇島 066000；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081

大豆14-3-3蛋白與轉(zhuǎn)錄因子蛋白GmMYB173的互作

董 萌1，2高友菲2韓天富2東方陽1，*蔣炳軍2，*

1河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院， 河北秦皇島 066000；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081

14-3-3蛋白家族在真核生物中普遍存在， 可與其他蛋白相互作用， 調(diào)控多種生理生化過程。MYB基因家族作為植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子， 廣泛參與了植物的生長發(fā)育和代謝調(diào)控。本研究通過分析 1個從自貢冬豆中克隆的 MYB轉(zhuǎn)錄因子 GmMYB173的亞細(xì)胞定位情況， 發(fā)現(xiàn) GmMYB173在細(xì)胞核中特異表達(dá)； 序列分析發(fā)現(xiàn)GmMYB173與GmMYB176相似， 具有1個14-3-3蛋白的潛在結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 即pST結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過重疊延伸PCR （SOE-PCR）刪除了GmMYB173序列中pST結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列， 發(fā)現(xiàn)GmMYB173細(xì)胞核表達(dá)特異性消失。酵母雙雜交互作分析表明， 大豆基因組中所有具有表達(dá)的16個14-3-3蛋白GmSGF14a～GmSGF14p均能與GmMYB173互作。β-半乳糖苷酶活性分析發(fā)現(xiàn)， 與 GmMYB173互作最強(qiáng)的是 GmSGF14n， 其次是 GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o。這些結(jié)果說明14-3-3蛋白不僅與GmMYB173互作， 且可能調(diào)控其在細(xì)胞內(nèi)的定位， 有助于研究14-3-3蛋白與GmMYB173的互作關(guān)系及其在大豆生長發(fā)育中的作用。

14-3-3蛋白； GmMYB173； 亞細(xì)胞定位； 酵母雙雜交

14-3-3蛋白是一類在真核生物中廣泛存在的蛋白。關(guān)于植物中14-3-3蛋白的報道最先見于大麥［1］、擬南芥［2］和菠菜［3］。目前組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 14-3-3蛋白在植物基因組中存在多個編碼基因， 呈現(xiàn)差異表達(dá)。在擬南芥基因組中已經(jīng)鑒定出15個14-3-3蛋白基因， 其中13個有轉(zhuǎn)錄表達(dá)［4-5］。在水稻中鑒定出8個， 其中6個有轉(zhuǎn)錄表達(dá)［6］。Li等［7］在大豆基因組中發(fā)現(xiàn)了18個14-3-3蛋白基因， 其中16個即GmSGF14a～GmSGF14p可通過 RT-PCR檢測到其表達(dá)。14-3-3蛋白在植物體內(nèi)主要以同源或異源二聚體的形式存在。14-3-3蛋白與其他蛋白的結(jié)合主要通過磷酸化的多肽域來實(shí)現(xiàn)， 包括 2種序列模式， 一種是RSXpSXP， 另一種是RXY/FXpSXP， 其中X為任意氨基酸， pS是磷酸化的絲氨酸［8］。但是， 一些14-3-3蛋白也能通過識別非磷酸化的序列來實(shí)現(xiàn)與互作蛋白的結(jié)合［9-10］。由此可見， 不同14-3-3蛋白可能由于表達(dá)差異化、結(jié)合蛋白多樣化， 而呈現(xiàn)豐富的生理生化功能。

植物14-3-3蛋白家族基因調(diào)控著植物中多種生理生化過程。14-3-3蛋白在細(xì)胞核中能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活子的亞細(xì)胞定位和基因的表達(dá)。Carrasco等［11］研究發(fā)現(xiàn) 14-3-3蛋白能與 DNA結(jié)合蛋白磷酸酶（DBP1）結(jié)合而調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子的亞細(xì)胞定位， 并能將DBP1轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核， 且能與DBP1結(jié)合從而調(diào)控目的基因CEVI1的表達(dá)以應(yīng)對病毒入侵帶來的危害。14-3-3蛋白還參與了植物的光信號通路。Folta等［12］利用酵母雙雜交和免疫共沉淀證明14-3-3蛋白能夠與重要的光周期蛋白 Constans相互作用， 暗示14-3-3蛋白參與了植物的光信號途徑。此外， 14-3-3蛋白還參與了蛋白合成、蛋白折疊、質(zhì)膜質(zhì)子泵的初級代謝、激素代謝和染色質(zhì)重組等生理生化過程［13-14］。Hajduch等［15］對大豆種子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白對于大豆種子發(fā)育有重要的作用。

MYB超級家族是序列特異性轉(zhuǎn)錄因子家族之一，具有種類多和功能多樣化的特點(diǎn)［16］， 參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)， 激素和環(huán)境因子應(yīng)答， 并對植物的次生代謝以及葉片等器官形態(tài)的建成具有重要的調(diào)節(jié)作用［17］。Liao等［18］在大豆中獲得了48個具有基因全長開放閱讀框的MYB類似基因， 其中43個基因?qū)}、干旱、低溫和ABA處理產(chǎn)生了相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)。李曉薇［19］從大豆中克隆了兩個 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因GmMYB12a和GmMYB12B2， 對轉(zhuǎn)基因擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)， 植物類黃酮合成途徑中的多個關(guān)鍵酶基因均受這 2個基因的正向調(diào)控。Liu等［20］研究發(fā)現(xiàn)，GmMYB73可能通過減少GL2， 進(jìn)而釋放GL-2Y抑制性的PLDa1表達(dá)來積累油脂， GmMYB73的調(diào)控潛在提高豆類作物的油產(chǎn)量。Chen等［21］發(fā)現(xiàn)MYB56為CULLIN3 （CUL3）-based E3連接酶的一個新的靶位點(diǎn)， 遺傳學(xué)研究表明 MYB56是開花的負(fù)調(diào)控因子。Liu等［22］研究發(fā)現(xiàn)韌皮部中MYB30表達(dá)水平的提高通過直接調(diào)控FT而促進(jìn)擬南芥的開花。

14-3-3蛋白和 MYB類轉(zhuǎn)錄因子分別在植物的生理生化代謝中發(fā)揮重要的作用， 但是對于二者相互作用共同發(fā)揮作用的研究較少。Yi等［23］和Li等［24］發(fā)現(xiàn)了 1個單重復(fù)結(jié)構(gòu)域的 MYB轉(zhuǎn)錄因子基因GmMYB176。在大豆中， GmMYB176能夠調(diào)節(jié)CHS8的表達(dá)， 但是在發(fā)根中過表達(dá)此基因不足以增加CHS8的表達(dá)量和異黃酮的含量， 而與其互作的14-3-3蛋白編碼基因GmSGF14i的過表達(dá)引起了異黃酮表達(dá)模式的改變。高友菲等［25］利用酵母單雜交技術(shù)篩選到自貢冬豆中與T1元件結(jié)合的MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB173， 對GmMYB173功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究將對后續(xù)研究具有重要意義。

本研究利用 SOE-PCR及亞細(xì)胞定位間接證明了14-3-3蛋白對于 GmMYB173亞細(xì)胞定位的影響，利用酵母雙雜交證明了大豆中已知的16種在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的14-3-3蛋白能夠與 GmMYB173互作， 其中GmSGF14n編碼的14-3-3蛋白與GmMYB173互作的活性最強(qiáng)， 為后續(xù)深入研究14-3-3蛋白及GmMYB173的功能提供了一定的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆品種自貢冬豆由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。將大豆種子播于混有營養(yǎng)基質(zhì)和蛭石（體積比 1∶1）的花盆中， 置人工氣候箱培養(yǎng)至第 1片三出復(fù)葉完全展開， 取3株不同植株葉片于液氮中速凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。洋蔥購自超市。用于遺傳轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（Eschrichia coli）菌株 DH5α購自北京天根生化科技有限公司。用于酵母雙雜交的酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株 AH109及表達(dá)載體p16318-GFP、pGADT7和pGBKT7由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存

1.2 GmMYB173亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

根據(jù)GmMYB173的基因序列， 利用Primer Blast （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）設(shè)計克隆引物， 以實(shí)驗(yàn)室保存的pLB-GmMYB173為模板， F-1和R-1為引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 條件為94℃ 2 min； 98℃10 s， 55℃ 30 s， 68℃ 25 s； 30個循環(huán)； 68℃ 10 min；Sal I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物和p16318-GFP連接構(gòu)建表達(dá)載體p16318-GmMYB173。

表1 亞細(xì)胞定位載體基因克隆引物Table1 Primers of cloning gene in subcellular vector construction

1.3 缺失 14-3-3 蛋白結(jié)合多肽域序列的GmMYB173 deletion亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

以p16318-GmMYB173為模板， 以F-2、R-2、F′和R′為引物， 利用SOE-PCR方法， 先后進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增， 獲取缺失編碼14-3-3蛋白結(jié)合多肽域的GmMYB173 deletion， 其中第1輪擴(kuò)增條件為94℃ 2 min； 98℃ 10 s， 55℃ 30 s， 68℃ 15 s， 30個循環(huán)； 68 ℃ 10 min。第2輪擴(kuò)增條件為94℃ 2 min； 98℃ 10 s， 52℃ 30 s， 68℃ 25 s， 30個循環(huán)； 68℃ 10 min。Hind III和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物和p16318-GFP連接構(gòu)建表達(dá)載體p16318-GmMYB173 deletion。

1.4 目標(biāo)基因的亞細(xì)胞定位

參照曲夢楠［26］《大豆GmFT2b基因的功能分析》中“洋蔥表皮亞細(xì)胞定位觀察方法”。

1.5 14-3-3蛋白編碼基因GmSGF14家族基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫提供的基因信息設(shè)計克隆引物如表2所示， 并以自貢冬豆 cDNA為模板， 對GmSGF14家族基因進(jìn)行 PCR克?。?然后用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶將 GmSGF14家族基因連接到表達(dá)載體pGADT7。

1.6 以酵母雙雜交驗(yàn)證 14-3-3蛋白與轉(zhuǎn)錄因子GmMYB173互作

參照Clontech的Yeast Protocols Handbook中提供的方法。挑取營養(yǎng)缺陷平板上單菌落到Y(jié)PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12 h， 提取質(zhì)粒后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

表2 14-3-3蛋白編碼基因GmSGF14家族基因信息Table2 Information of GmSGF14 genes conforming 14-3-3 proteins

2 結(jié)果與分析

2.1 GmMYB173的序列分析

目的基因GmMYB173的開放閱讀框?yàn)?52 bp，編碼 284個氨基酸。利用 BaCelLo （http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/）對GmMYB173進(jìn)行亞細(xì)胞預(yù)測， 結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核中（圖1）。其蛋白序列與 NCBI中公布的部分 MYB類蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)， GmMYB173具有一個14-3-3蛋白的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。

圖1 GmMYB173的亞細(xì)胞定預(yù)測結(jié)果Fig.1 Results of prediction of subcellular location of GmMYB173

圖2 GmMYB173與其他MYB類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對Fig.2 Sequence multi-alignment of GmMYB173 with other MYB transcription factors

2.2 GmMYB173和GmMYB173 deletion表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

以保存的 pLB-GmMYB173載體為模板， 加有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到與目標(biāo)大小相符的特異性條帶（圖3-A）。對測序正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證， 酶切得到與目標(biāo)基因大小相符的條帶（圖4）， 證明GmMYB173已經(jīng)正確連接入表達(dá)載體中。

在表達(dá)載體 p16318-GmMYB173 deletion構(gòu)建中， 亞克隆得到與 GmMYB173 deletion大小相符的條帶（圖3-B）。測序后得到克隆無誤的 GmMYB173 deletion， 對提取的質(zhì)粒進(jìn)行了雙酶切驗(yàn)證， 得到了大小略小于GmMYB173條帶的840 bp左右的目標(biāo)條帶 GmMYB173 deletion （圖4）， 表明 GmMYB173 deletion已經(jīng)正確連接入表達(dá)載體中。

利用激光共聚焦顯微鏡對瞬時轉(zhuǎn)化 GFP、 GmMYB173-GFP和GmMYB173 deletion-GFP載體的洋蔥表皮細(xì)胞觀察表明， 對照GFP可在洋蔥表皮細(xì)胞中大量表達(dá)， 綠色熒光信號在細(xì)胞核， 細(xì)胞質(zhì)均有分布； 與對照相比， GmMYB173-GFP綠色熒光信號主要分布在細(xì)胞核中， 在細(xì)胞質(zhì)中未檢測到明顯的熒光信號； 而GmMYB173 deletion-GFP綠色熒光信號在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布， 失去了GmMYB173核表達(dá)的特異性（圖5）。

圖3 GmMYB173 PCR和GmMYB173 deletion擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of GmMYB173 and GmMYB173 deletion

圖4 p16318-GmMYB173和p16318-GmMYB173 deletion雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Identification of p16318-GmMYB173 and p16318-GmMYB173 deletion double enzyme digestion

2.3 14-3-3蛋白編碼基因GmSGF14家族基因的克隆及酵母雙雜交載體的構(gòu)建

以自貢冬豆葉片cDNA為模板， 表2中克隆引物對GmSGF14家族基因進(jìn)行克隆， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離， 得到與目標(biāo)基因大小相符的特異性條帶（圖6）， 膠經(jīng)回收并連接pLB載體后測序。將序列與NCBI中的參考序列比對發(fā)現(xiàn)， GmSGF14a、GmSGF14b、GmSGF14c、GmSGF14d、GmSGF14e、GmSGF14g和GmSGF14m與參考序列之間存在多處的SNP， 其余GmSGF14家族基因與參考序列相同。將連接入表達(dá)載體的陽性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證， 所有載體均得到與目標(biāo)基因大小相符的酶切片段， 表明目標(biāo)基因已正確連入載體中（圖7）。

圖5 GmMYB173-GFP和GmMYB173 deletion-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular location of GmMYB173-GFP and GmMYB173 deletion-GFP fusion proteins

圖6 14-3-3蛋白編碼基因GmSGF14a-p PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.6 PCR products of 14-3-3 proteins coding genes GmSGF14a-p

圖7 pGADT7-GmSGF14a-p和pGBKT7-GmMYB173載體雙酶切驗(yàn)證Fig.7 Identification of pGADT7-GmSGF14a-p and pGBKT7-GmMYB173 double enzyme digestion

2.4 以酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 GmMYB173與14-3-3蛋白互作

采用上述實(shí)驗(yàn)方法制備酵母感受態(tài)并轉(zhuǎn)化， 轉(zhuǎn)化后將感受態(tài)細(xì)胞分別涂布于營養(yǎng)缺陷平板 SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-Ade-His上。在SD/-Trp-Leu平板上均有酵母單菌落生長， 表明AD和BK載體已成功轉(zhuǎn)入酵母中。在SD/-Trp-Leu-Ade-His平板上， 只轉(zhuǎn)入AD和BK空載體的酵母不能在平板上生長。同時，轉(zhuǎn)入pGBKT7-GmMYB173和pGADT7載體的酵母也不能在平板上生長， 表明pGBKT7-GmMYB173不具有自激活活性。轉(zhuǎn)入pGBKT7和pGADT7-GmSGF14 family載體的酵母也不能生長（在此以 pGADT7-GmSGF14d的結(jié)果省略表示）， 表明 pGADT7-GmSGF14 family也不具有自激活活性。而同時轉(zhuǎn)入pGBKT7-GmMYB173和pGADT7-GmSGF14 family的酵母菌能夠生長出正常的菌斑（圖8）， 表明GmMYB173與GmSGF14 family存在互作。挑取SD/-Trp-Leu-Ade-His單菌落搖菌后提取質(zhì)粒， 菌落 PCR驗(yàn)證表明， pGBKT7-GmMYB173和pGADT7-GmSGF14 family均已轉(zhuǎn)入酵母中（圖9）。

圖8 GmMYB173與14-3-3蛋白的酵母雙雜交結(jié)果Fig.8 Results of yeast two-hybrid assay of GmMYB173 and 14-3-3 proteins

圖9 酵母雙雜實(shí)驗(yàn)中酵母單菌落的菌落PCR驗(yàn)證Fig.9 PCR Identification of yeast individual colony

2.5 GmMYB173與14-3-3蛋白互作強(qiáng)度測定

參照上述實(shí)驗(yàn)方法測定 β-半乳糖苷酶活性， 確定GmMYB173與14-3-3蛋白互作強(qiáng)度表明， 不同的14-3-3蛋白與 GmMYB173互作之后激活的 β-半乳糖苷酶活性存在一定的差異。其中， 對照AD/BK、GmMYB173/AD、SGF14d/BK在本底水平上存在一定的β-半乳糖苷酶活性， 與對照相比， GmSGF14n與GmMYB173互作后激活的 β-半乳糖苷酶活性最強(qiáng)，GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o稍次之（圖10），暗示GmSGF14n與GmMYB173在植物體中相互作用來發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。

3 討論

蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是功能基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容， 對其研究有助于更加系統(tǒng)全面地理解植物的生長發(fā)育， 形態(tài)建成等。融合報告基因定位法是研究蛋白亞細(xì)胞定位最廣泛使用的方法之一［27］。洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞因其具有不含葉綠體、結(jié)果容易觀察等諸多優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用作亞細(xì)胞定位的受體細(xì)胞［28］。本研究通過在線的BaCelLo對GmMYB173的亞細(xì)胞定位預(yù)測， 顯示其定位于細(xì)胞核中（圖1）。進(jìn)一步利用基因槍介導(dǎo)洋蔥表皮細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致（圖5）。通過氨基酸序列比對分析， 發(fā)現(xiàn)GmMYB173與GmMYB176相似，都存在一個潛在的14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)， 即pST結(jié)合位點(diǎn)， 氨基酸序列為 SSLFDITT［23］。進(jìn)一步利用SOE-PCR技術(shù)刪除相關(guān)編碼序列發(fā)現(xiàn) GmMYB173失去了細(xì)胞核表達(dá)特異性（圖5）， 這一結(jié)果與GmMYB176的亞細(xì)胞定位結(jié)果［23］類似。轉(zhuǎn)錄因子需要在細(xì)胞核中實(shí)現(xiàn)對靶基因的精準(zhǔn)調(diào)控［29］， 由此該結(jié)合位點(diǎn)不僅影響了GmMYB173的亞細(xì)胞表達(dá)特性，而且可能影響到 GmMYB173功能的發(fā)揮， 暗示14-3-3蛋白可能通過pST結(jié)合位點(diǎn)影響GmMYB173亞細(xì)胞定位進(jìn)而調(diào)控GmMYB173的功能。

圖10 β-半乳糖苷酶活性測定Fig.10 Identification of β-galactosidase activity

為進(jìn)一步明確 14-3-3蛋白是否能夠與GmMYB173互作， 本研究采用酵母雙雜交方法對此分析， 該方法是研究蛋白之間相互作用的經(jīng)典方法。利用此方法發(fā)現(xiàn)16個14-3-3蛋白與GmMYB173均能互作， 通過測定蛋白互作后激活的 β-半乳糖苷酶活性發(fā)現(xiàn)它們與GmMYB173互作能力各有不同，其中 GmSGF14n與 GmMYB173的結(jié)合活性最強(qiáng)，GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o稍次之， 這一方面表明在植物體中可能是 GmSGF14n與GmMYB173結(jié)合進(jìn)而調(diào)控靶基因的功能， 另一方面也說明植物有可能通過不同 14-3-3蛋白實(shí)現(xiàn)對GmMYB173的精準(zhǔn)調(diào)控。在對GmMYB176的研究中也發(fā)現(xiàn)16個14-3-3蛋白與GmMYB176均能產(chǎn)生互作， 其中GmSGF14i與GmMYB176互作激活的β-半乳糖苷酶活性最高［24］， 進(jìn)一步表明14-3-3蛋白有可能廣泛參與 MYB轉(zhuǎn)錄因子功能活性的調(diào)控， 但對于不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子又呈現(xiàn)一定的結(jié)合特異性。

轉(zhuǎn)錄因子GmMYB173是通過酵母單雜交技術(shù)，以自貢冬豆中開花基因GmFT2a的啟動子的T1元件為誘餌篩選出來的［25］。GmFT2a在大豆葉片中表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)莖尖端花分生組織決定基因的表達(dá)， 最終促進(jìn)大豆開花［30］。Li等［7］研究發(fā)現(xiàn)大豆中14-3-3蛋白表現(xiàn)不同的亞細(xì)胞分布和組織表達(dá)特異性， 其中GmSGF14n被定位于細(xì)胞核中， 并且在大豆葉片中的表達(dá)量最高。本研究也發(fā)現(xiàn)GmMYB173定位于細(xì)胞核中， 并且GmSGF14n與GmMYB173互作強(qiáng)度最高。由此推斷二者的互作可能會對GmFT2a的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響， 但是仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

由此可見， 14-3-3蛋白不僅與GmMYB173互作，而且可能對其在亞細(xì)胞中的定位產(chǎn)生影響， 也就會對其功能的發(fā)揮產(chǎn)生一定的影響， 這一研究結(jié)果有助于今后更好地研究14-3-3蛋白與GmMYB173的互作關(guān)系及其在大豆生長發(fā)育中的作用， 促進(jìn)大豆育種應(yīng)用研究。

4 結(jié)論

GmMYB173在細(xì)胞核中特異性表達(dá)， 這種特異性與14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)即 pST結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。GmMYB173可與大豆中所有檢測到表達(dá)的16個14-3-3蛋白 GmSGF14a-GmSGF14p互作， 其中與GmSGF14n互作最強(qiáng)。由此可見， 14-3-3蛋白不僅與GmMYB173互作， 而且可能通過pST結(jié)合位點(diǎn)對其在亞細(xì)胞中的定位產(chǎn)生影響。

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Interaction of Soybean 14-3-3 Proteins with Transcription Factor GmMYB173

DONG Meng1，2， GAO You-Fie2， HAN Tian-Fu2， DONG-FANG Yang1，*， and JIANG Bing-Jun2，*

1Life Science and Technology College， Hebei Normal University of Science ＆ Technology， Qinhuangdao 066000， China；2Key Laboratory of Soybean Biology （Beijing）， Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China

14-3-3 proteins， nearly existing in all eukaryotic cells， may regulate many physiological and biochemical processes through interacting with other proteins.As the largest class of transcription factors in plants， MYB gene family is widely involved in plant growth and metabolism regulation.A gene cloned from soybean cultivar Zigongdongdou， and specifically expressed in the nuclear in the subcellular location assay.Sequence analysis showed that there was a binding site of 14-4-4 proteins， namely the pST binding site， in GmMYB173 similar to that in GmMYB176.The nuclear-specific expression of GmMYB173 disappeared when the sequence of the pST binding site was deleted through the splicing by overlap extension PCR.All 14-3-3 proteins from GmSGF14a to GmSGF14p could interact with GmMYB173.Among them， GmSGF14n interacted with GmMYB173 strongest，GmSGF14e and GmSGF14k took second place， which was proved by the β-galactosidase activity analysis.These results suggest that 14-3-3 proteins not only interact with GmMYB173， but also probably regulate its subcellular location.The information provided by this study will facilitate the study of interaction relationship between 14-3-3 proteins and GmMYB173 and its function on the soybean development.

14-3-3 proteins； GmMYB173； Subcellular location； Yeast two-hybrid

10.3724/SP.J.1006.2016.01419

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-04）和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助。

This study was supported by the Special Program of Modern Agro-industry Technology System （CARS-04） and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences.

（Corresponding authors）： 東方陽， E-mail： yang_dongfang@hotmail.com， Tel： 13780335864； 蔣炳軍， E-mail： jiangbingjun @caas.cn， Tel： 13910305439

聯(lián)系方式： E-mail： dongmeng902@163.com， Tel： 13164257831

Received（）： 2016-03-15； Accepted（接受日期）： 2016-06-20； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-07-04.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160704.0826.010.html