溫敏含糖嵌段共聚物的合成及其膠束的自組裝*

周開春，徐慕儒，武俊紫，權(quán)　靜,2

(1.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620; 2.東華大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201620)

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溫敏含糖嵌段共聚物的合成及其膠束的自組裝*

周開春1，徐慕儒1，武俊紫1，權(quán)靜1,2

(1.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620; 2.東華大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201620)

采用酶促法合成含半乳糖單體6-O-乙烯基壬二酸-D-吡喃型半乳糖酯(OVZG),采用可逆加成-鏈斷裂轉(zhuǎn)移自由基聚合法(RAFT聚合)將大分子引發(fā)劑二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)和OVZG有效結(jié)合，制備相對(duì)分子質(zhì)量(簡(jiǎn)稱分子量)分散系數(shù)(PDI)較低的溫敏性含半乳糖嵌段共聚物PDEGMA-b-POVZG。通過核磁共振氫譜(1H NMR)，傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)，凝膠滲透色譜(GPC)對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)表征。通過紫外-可見光譜(UV-Vis)研究表明，共聚物的低臨界溶解溫度(LCST)可以通過共聚單體的比例進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)PDEGMA與OVZG的物質(zhì)的量之比為1∶63時(shí)，含糖共聚物的LCST值為33℃。在37℃生理溫度下，PDEGMA-b-POVZG可以自組裝形成納米膠束，透射電子顯微鏡(TEM)顯示自組裝形成的聚合物膠束是結(jié)構(gòu)均勻、形貌規(guī)整的球形，通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)得納米微球的粒徑約為167 nm，該溫敏性半乳糖嵌段共聚物在藥物載體方面具有潛在的應(yīng)用前景。

溫度敏感性；含糖嵌段共聚物；LCST；自組裝

0　引　言

近年來，隨著兩大新型活性聚合反應(yīng)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由聚合(RAFT)和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)[1]的廣泛應(yīng)用，使得可控聚合迅速發(fā)展起來。RAFT聚合由于其適用單體范圍較廣，反應(yīng)過程比較簡(jiǎn)單，所以成為合成具有生物醫(yī)藥用途的含糖聚合物的最佳方法之一。Lowe[2]等首次使用RAFT聚合法合成了分子量分散窄的含糖均聚物。

溫敏性雙親水含半乳糖嵌段共聚物是一類特殊的兩親性共聚物,在溫度變化的誘導(dǎo)下可以轉(zhuǎn)化為兩親性,從而形成對(duì)溫度變化敏感的聚集體[3]。半乳糖單體作為1種具有良好的親水性、細(xì)胞靶向識(shí)別性、生物相容性和生物降解性可被聚合到溫敏單體中形成溫敏性雙親水含半乳糖嵌段共聚物。而二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)是一類具有良好生物相容性，因而成為最常用的溫敏單體之一。由于其結(jié)合了半乳糖基的生物相容性、細(xì)胞靶向識(shí)別性和溫度敏感單體的環(huán)境刺激-響應(yīng)性，使其在藥物傳遞和基因治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值而備受關(guān)注。

以膠束為載體的給藥系統(tǒng)具有被動(dòng)靶向的性能，將藥物包封或嵌入到膠束后能選擇性地聚集于靶組織并達(dá)到緩慢釋放藥物的目的，以更好地發(fā)揮藥物的療效。Wang[4]等研究表明，含半乳糖的嵌段共聚物膠束可以特異性靶向HepG2肝細(xì)胞。Voit等[5]研究表明，與聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)相比，DEGMA結(jié)構(gòu)中沒有酰胺鍵，不易與生物體中的蛋白質(zhì)、多肽發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因而可廣泛運(yùn)用于生物體內(nèi)。同時(shí)，還表明將DEGMA與含糖單體聚合所得的共聚物兼具溫敏性，細(xì)胞靶向性和生物相容性[6-7]。

本文通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合(RAFT聚合法)，將溫敏性單體二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)和具有肝靶向性的含半乳糖單體6-O-乙烯基壬二酸-D-吡喃型半乳糖酯OVZG進(jìn)行嵌段共聚，制備分散度窄的半乳糖基溫敏性雙親水嵌段共聚物。通過對(duì)嵌段聚合物膠束的LCST的測(cè)定，聚合物在溫度高于33℃時(shí)，可以自組裝形成規(guī)整的球形納米膠束[8-9]。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1主要試劑及儀器

枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(100 U/mg，無錫雪梅科技有限公司)、偶氮二異丁腈(AIBN，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)、壬二酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)、二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA，Sigma-Aldrich，AR)、醋酸乙烯酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)、半乳糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)、S-氰甲基-N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基二硫代碳酸酯(CMPCD，Sigma-Aldrich，AR)，其余藥品均為分析純，購自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

Waters1525/2414 BI-MwA型凝膠滲透色譜(GPC)-散射(LS)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters，Brookhaven公司，色譜柱的型號(hào)為Waters Styragel HT)、Avance400型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker 公司)、紫外可見分光光度計(jì)(Lambda 35，美國(guó)PerkinElmer公司)、透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本JEOL公司)、傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700，美國(guó)Thermo Fisher公司)、激光光散射儀(BI-200SM,美國(guó)Brookhaven公司)。

1.2PDEGMA-b-POVZG的合成

在枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的催化下經(jīng)過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)獲得OVZG[10]。制備大分子引發(fā)劑，取1.13 g DEGMA、13.4 mg鏈轉(zhuǎn)移劑 CMPCD、引發(fā)劑 AIBN 2.1 mg，用 2 mL DMF溶劑溶解，經(jīng)過3次抽真空-充氮?dú)馓幚?，?0℃油浴中反應(yīng)1 h，然后置于冰水浴中冷卻5 min。把反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后，正己烷沉淀反復(fù)2～3次后，放入真空干燥箱干燥，得到0.83 g 黃色油狀物，即得大分子引發(fā)劑PDEGMA[11-12]。用RAFT 聚合合成PDEGMA-b-POVZG。OVZG與PDEGMA物質(zhì)的量之比分別為63∶1。反應(yīng)以DMF 為溶劑，以偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，單體、鏈轉(zhuǎn)移劑、引發(fā)劑的物質(zhì)的量之比為63:1:0.21，單體的質(zhì)量濃度為1 kg/L。取301.7 mg PDEGMA、239.7 mg OVZG、0.35 mg AIBN 溶于0.5 mL DMF 中，經(jīng)過3次抽真空-充氮?dú)馓幚?，?0℃油浴中反應(yīng)48 h，然后置于冰水浴中冷卻5 min。把反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，正己烷沉淀，如此反復(fù)2次，放入真空干燥箱干燥，得到0.23 g 黃色油狀物。合成路線如下所示

1.3聚合物表征

1.3.11HNMR測(cè)定

將反應(yīng)單體OVZG、PDEGMA 和合成的產(chǎn)物PDEGMA-b-POVZG通過1H NMR(400MHz；DMSO 或 CDCl3，Me4Si)進(jìn)行表征。

1.3.2傅里葉紅外光譜測(cè)定

將反應(yīng)單體 OVZG、PDEGMA 和合成的產(chǎn)物 PDEGMA-b-POVZG，通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)進(jìn)行表征。

1.3.3凝膠滲透色譜(GPC)

將聚合物 PDEGMA-b-POVZG 溶于四氫呋喃配制4 g/L的溶液，通過凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)試其分子量和分散度(PDI)。使用已知分子量的聚苯乙烯溶液作為標(biāo)準(zhǔn)參比分子。

1.3.4聚合物L(fēng)CST值測(cè)定

將聚合物配制成1 g/L的水溶液放在帶有變溫池的紫外可見分光光度計(jì)中，測(cè)其在500 nm處的吸光度(A)隨溫度(T)變化的情況。測(cè)試條件：升溫范圍25～55℃，升溫速率為0.5℃/min。

1.3.5動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試(DLSC)

將 PDEGMA-b-POVZG 溶解在雙蒸水中，制備成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的溶液。用0.45 μm的水相過濾膜將樣品進(jìn)行過濾，然后加入到干凈的樣品測(cè)試瓶中。使樣品室的溫度保持在25℃，在532 nm下進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試。

1.3.6膠束形貌的透射電子顯微鏡(TEM)表征

將嵌段聚合物溶解在三蒸水中，讓其自組裝形成膠束，然后將膠束溶液滴在備好的銅網(wǎng)上使水分蒸發(fā)制得樣品，通過透射電子顯微鏡觀測(cè)其表面形貌。

2　結(jié)果與討論

2.1核磁共振氫譜

圖1為反應(yīng)單體 OVZG、DEGMA 和合成產(chǎn)物 PDEGMA-b-POVZG的核磁共振氫譜。

圖1OVZG、DEGMA、PDEGMA-b-POVZG 的核磁共振氫譜(1HNMR)

Fig 11HNMR spectra of OVZG,DEGMA and PDEGMA-b-POVZG

2.2紅外光譜

圖2PDEGMA、OVZG、PDEGMA-b-POVZG的紅外光譜圖

Fig 2 IR spectra of PDEGMA,OVZG and PDEGMA-b-POVZG

2.3GPC

圖3為PDEGMA-b-POVZG的GPC 圖，可發(fā)現(xiàn)其為對(duì)稱單峰。GPC 測(cè)試結(jié)果表明，聚合產(chǎn)物多分散系數(shù)為1.55，聚合物的質(zhì)均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)為120 600，其數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量(Mn)為77 600。

圖3　共聚物凝膠滲透色譜(GPC)圖

2.4PDEGMA-b-POVZG共聚物的溫度敏感性

將嵌段聚合物(PDEGMA-b-POVZG)溶液放在帶有變溫池的紫外可見分光光度計(jì)中，測(cè)其在500 nm 處的吸光度(A)隨溫度(T)變化情況，如圖4 所示。

圖4PDEGMA-b-POVZG水溶液在500 nm處的吸光值A(chǔ) 曲線

Fig 4 Absorbance curves recorded for solution of PDEGMA-b-POVZG in water

根據(jù)定義[14]，低臨界溶解溫度(LCST)為達(dá)到溶液最大吸光度(A)50%時(shí)的溫度值。圖中可以看出該嵌段共聚物PDI的LCST值為33℃?？梢?，PDEGMA-b-POVZG的LCST 值與人體的溫度比較接近。當(dāng)溫度降到LCST以下時(shí)，膠束溶液又從混濁變得澄清，表明此類溫度敏感膠束的相轉(zhuǎn)變即溶解-不溶的轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是可逆的。又由于 PDEGMA-b-POVZG的LCST 值為33℃，低于人體溫度，在人體環(huán)境中可以快速形成納米膠束，使其在體內(nèi)藥物載體方面具潛在應(yīng)用。

2.5動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試

圖5是 PDEGMA-b-POVZG 通過動(dòng)態(tài)光散射得到的流體力學(xué)直徑圖，可發(fā)現(xiàn)其同樣為對(duì)稱單峰，且分布較為集中。平均粒徑為167 nm。

圖5　共聚物動(dòng)態(tài)光散射(DLS)圖

2.6聚合物膠束的自組裝

圖6是質(zhì)量濃度為0.5 g/L的嵌段聚合物溶液形成的膠束的表面形貌。

圖6　聚合物自組裝膠束透射電鏡(TEM)圖

Fig 6 TEM images of micelles self-assembled from PDEGMA-b-POVZG at low and high magnification

通過TEM的低倍和高倍圖可以觀察到，聚合物膠束為比較規(guī)整但表面不平滑的球形結(jié)構(gòu)，粒子的大小比較均勻，粒徑約為167 nm。由于在制備TEM樣品時(shí)的溫度是50℃高于嵌段共聚物的LCST值33℃，所以可以形成比較規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)。但又由于制樣過程中膠束中的水分蒸發(fā)，因此，粒徑小于DLS測(cè)試得到的結(jié)果。同時(shí)膠束會(huì)發(fā)生不同程度的坍縮，使得膠束的表面出現(xiàn)不同程度的凹凸現(xiàn)象[15]。在PDEGMA-b-POVZG中，OVZG與PDEGMA 通過主鏈連接起來。常溫下溶于水后主鏈無規(guī)成團(tuán)，溫度升高至LCST值后，溫敏部分 PDEGMA 向內(nèi)發(fā)生塌縮，而含有半乳糖基部分OVZG位于膠束表面。

3　結(jié)　論

通過酶促合成/RAFT聚合的方法在鏈轉(zhuǎn)移劑S-氰甲基-N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基二硫代碳酸酯(CMPCD)的作用下，將含半乳糖單體OVZG與溫敏性單體PDEGMA進(jìn)行可控聚合制備了分散度小且具有溫敏性雙親水性的共聚物。當(dāng)OVZG與PDEGMA 物質(zhì)的量之比為63∶1時(shí)，LCST值為33℃，低于人體溫度。在此條件下可以成功形成結(jié)構(gòu)規(guī)整的膠束，為該類材料在肝靶向藥物載體方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ohno Kohji,Tsujii Yoshinobu,Fukuda Takeshi.Synthesis of a well-defined glycopolymer by atom transfer radical polymerization [J].J Polym Sci A:Polym Chem,1998,36:2473-2481.

[2]Lowe A B,Sumerlin B S,McCormick C L,et al.The direct polymerization of 2-methacryloxyethyl glucoside via aqueous reversible addition-fragmentationchain transfer(RAFT)polymerization [J].Polymer,2003,44:6761-6765.

[3]Wei Hua,Cheng Sixue,Zhang Xianzheng,et al.Therm-sensitive polymeric micells based on poly(N-isopropylacrylamide)as drug carriers [J].Progress in Polymer Science,2009,34:893-910.

魏華，程思雪，張先正等.熱敏性聚合物聚(N-異丙基丙烯酰胺)作為藥物運(yùn)載的研究[J].聚合物科學(xué)進(jìn)展,2009,34:893-910.

[4]Wang Ying,Li Xin,Hong Chunyan,et al.Synthesis and micellization of thermoresponsive galactose-based diblock copolymers [J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2011,49:3280-3290.

王英，李鑫，鴻春燕，等.溫敏半乳糖嵌段共聚物的合成及其膠束化[J].高分子科學(xué)雜志,2011,49:3280-3290.

[5]?zyürek Z,Komber H,Gramm S,et al.Thermoresponsive glycopolymers via controlled radical polymerization [J].Macromolecular Chemistry and Physics,2007,208(10):1035-1049.

[6]Yu Hoshino,Masahiko Nakamoto,Yoshiko Miura.Control of protein-binding kinetics on synthetic polymer nanoparticles by tuning flexibility and inducing conformation changes of polymer chains [J].J Am Chem Soc,2012,134:15209-15212.

[7]Tian Jing,Wan Lingshu,Xu Zhikang.Synthesis of glycopolymers by controlled/living polymerization [J].Chemistry Online,2008,(2):102-109.

田靜，萬靈書，徐志康等.含糖聚合物可控合成研究進(jìn)展[J].化學(xué)通報(bào)，2008，(2)：102-109.

[8]Wu Chengyao,Branford-White Christopher,Quan Jing,et al.In vitro controlled release of polymeric drug-saccharide conjugates with ketoprofen,ibuprofen,and naproxen pendants [J].J Appl Polym Sci,2011,121:1654-1660.

[9]Li Xia,Wu Qi,Lu Min,et al.Novel hepatoma-targeting micelles based on chemoenzymatic synthesis and self-assembly of galactose-functionalized ribavirin-containing amphiphilic random copolymer [J].J Polym Sci Part A:Polym Chem,2008,46:2734-2744.

[10]Quan Jing,Wu Qi,Zhu Limin,et al.Chemo-enzymatic synthesis and sustained release of optically active polymeric prodrugs of chlorphenesin [J].Polymer,2008,49:3444-3449.

[11]Dupayage L,Save M,Dellacherie E,et al.PMMA-Grafted dextran giycopolymers by atom transfer radical polymerization [J].Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry,2008,46(23):7606-7620.

[12]Wang Z H,Li W B,Ma J,et al.Functionalized nonionic dextran backbones by atom transfer radical polymerization for efficient gene Delivery [J].Macromolecules,2011,44(2):230-239.

[13]Luca Albertin,Claudia Kohlert,Martina Stenzel,et al.Chemoenzymatic synthesis of narrow-polydispersity glycopolymers:poly(6-O-vinyladipoyl-D-glucopyranose)[J].Biomacromolecules,2004,5(2):255-260.

[14]Lou Shaofeng,Gareth R Williams,Christopher Branford-White,et al.Fabrication and aggregation of thermoresponsive glucose-functionalized double hydrophilic copolymers[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,105:180-186.

[15]Liu Li,Shi Haiting,Wang Xiaobei,et al.Synthesis of functional glycopolymers [J].Polymer Bulletin,2013,1:015.

劉麗，石海婷，王曉蓓，等.功能性含糖聚合物的研究 [J].高分子通報(bào)，2013，1：015.

Synthesis and self-assemble of thermosensitive galactose block polymer

ZHOU Kaichun1，XU Muru1,WU Junzi1,QUAN Jing1,2

(1.Donghua University,College of Chemistry,Chemical Engineering and Biotechnology, Shanghai 201620,China；2.Donghua University,Key Laboratory of Textile Science & Technology,Ministry of Education, Shanghai 201620,China)

The glycomonomer 6-O-vinylazelaic-D-galactopyranose(OVZG)was synthesized by lipase catalyzed transesterification of divinyladipate with D-galactopyranose.PDEGMA-b-POVZG with narrow polydispersity(PDI)and obvious thermosensitivity was effectively prepared via enzymatic synthesis combined with reversible addition-fragmentation chain transfer(RAFT)polymerization.The structure and molecular weight of the synthesized glycopolymer were characterized by1HNMR,FT-IR and gel permeation chromatography(GPC),respectively.Measurement by dynamic light scattering(DLS)and transmission electron microscopy(TEM)revealed that PDEGMA-b-POVZG was able to self-assemble into nano-micelles with well-defined structure and uniform size in aqueous solution.UV-Visible spectroscopy tests showed that the low critical solution temperature(LSCT)of the polymer can be controlled by the molar ratio of monomers.Especially,as the molar ratio of PDEGMA and OVZG was 1∶63,the LCST of PDEGMA-b-POVZG could be 33℃ in aqueous solution.The results demonstrate that PDEGMA-b-POVZG can form nano-micelles in the human body environments,which may have potential as functional drug carriers.

thermosensitivity；glycopolymer block；LCST；Self-assemble

1001-9731(2016)09-09158-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資項(xiàng)目(21303014)

2015-06-08

2016-04-04 通訊作者：權(quán)靜，E-mail:jquan@dhu.edu.cn

周開春(1990-)，男，安徽滁州人，碩士研究生，師承權(quán)靜副教授，主要從事藥物緩釋材料研究。

O631；TQ316

ADOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.09.030