降解菌DNEH-S1的室內(nèi)模擬試驗(yàn)

張 奇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150036）

降解菌DNEH-S1的室內(nèi)模擬試驗(yàn)

張 奇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150036）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的農(nóng)藥、地膜、化肥等農(nóng)用化學(xué)品，造成多種有機(jī)物對(duì)土壤的復(fù)合污染。當(dāng)有害物質(zhì)過(guò)多，超過(guò)土壤的自凈能力，就會(huì)引起土壤的組成、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，微生物活動(dòng)受到抑制，有害物質(zhì)或其分解產(chǎn)物在土壤中逐漸積累，并間接危害人體健康。鄰苯二甲酸酯（PAEs）是一類環(huán)境內(nèi)分泌物質(zhì)，作為農(nóng)用塑料地膜中的增塑劑被大量使用，易從塑料地膜中釋放而造成土壤污染。我國(guó)農(nóng)田土壤普遍存在農(nóng)藥、PAEs等有機(jī)物復(fù)合污染，生物降解是削減土壤中有機(jī)污染物的重要途徑。試驗(yàn)研究了降解菌DNEH-S1在土壤中對(duì)DEHP降解特性及土壤中養(yǎng)分的動(dòng)態(tài)變化，探討了典型有機(jī)物復(fù)合污染土壤生物降解技術(shù)的可行性。

鄰苯二甲酸酯；生物降解；土壤修復(fù)；模擬試驗(yàn)

1　前言

DEHP是人工合成的化學(xué)物質(zhì)，其的中文名為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯，廣泛應(yīng)用于塑料制品中，包括農(nóng)用薄膜和塑料大棚膜。我國(guó)每年地膜使用量近百萬(wàn)噸，地膜覆蓋面積達(dá)1000多萬(wàn)公頃，覆蓋作物達(dá)40多種［1］。聚乙烯類地膜以其質(zhì)輕、透光、保溫保濕性好，在我國(guó)被廣泛應(yīng)用于冬季暖棚蔬菜生產(chǎn)及早稻、西瓜、棉花等地覆膜育秧，但隨著地膜老化、破碎和回收不凈，造成地膜在田間的殘留量不斷增加［2］。大量殘留地膜不但對(duì)農(nóng)田耕作、植物生長(zhǎng)等造成影響，其深層次的影響還在于地膜中的增塑劑（鄰苯二甲酸酯類化合物（PAEs），又稱酞酸酯）的污染。

當(dāng)大量PAES進(jìn)入土壤環(huán)境中，土壤微生物群落的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和多樣性都會(huì)受到影響，最終使土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能受到損害［2-5］。PAEs在植物體中有較強(qiáng)的富集作用，甚至在它們的深加工產(chǎn)品中都發(fā)現(xiàn)了PAEs的存在［6］。DEHP濃度增加，葉綠素含量逐漸下降，DEHP10mg/kg時(shí)，豇豆葉綠素a含量比空白下降8.6%，葉綠素b含量比空白下降13.3%；DEHP50mg/kg時(shí)，豇豆葉綠素a含量下降23.5%，葉綠素b含量下降26.7%［7］。

人類通過(guò)皮膚、呼吸、食物鏈等途徑長(zhǎng)期接觸環(huán)境雌激素PAEs，可能導(dǎo)致人肢體畸形、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖系統(tǒng)病變，精子數(shù)量減少，乳腺癌發(fā)病率升高等不良后果，而且可以通過(guò)胎盤和授乳產(chǎn)生跨代影響［8］。總之，鄰苯二甲酸酯類對(duì)人類和其他生物都存在潛在危害。

DEHP是我國(guó)優(yōu)先控制的PAEs類污染物之一，在環(huán)境中難以自發(fā)降解，在土壤中的殘留量大，威脅生態(tài)安全。因而找到可行性高、效果好的方法控制和降低DEHP在環(huán)境中的含量和危害刻不容緩。由于常規(guī)處理方法難以對(duì)其有較好的處理，因此，利用微生物降解DEHP修復(fù)污染土壤是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

本研究在室內(nèi)條件下將DEHP降解菌DNEH-S1施用于DEHP污染土壤中，探究了該降解菌在土壤中的實(shí)際修復(fù)效果及修復(fù)過(guò)程中土壤養(yǎng)分含量的變化。以期為DEHP污染土壤的生物修復(fù)提供依據(jù)。

2　材料與方法

2.1儀器與試劑

儀器：UV-2051PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；TPY-6土壤養(yǎng)分快速測(cè)試儀。

試劑：DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度≥99%）；三氯甲烷（分析純）；乙醇（分析純）；N、P、K養(yǎng)分測(cè)試試劑。

2.2測(cè)定方法

2.2.1土壤中DEHP含量的測(cè)定

2.2.1.1土壤中DEHP的萃取

土壤經(jīng)風(fēng)干、研磨、過(guò)篩，用10 mL三氯甲烷超聲萃取二次，每次萃取時(shí)間10min。

2.2.1.2土壤中DEHP含量測(cè)定

（1）測(cè)定波長(zhǎng)選擇：以三氯甲烷為空白，作掃描基線校正。并對(duì)DEHP和樣品檢測(cè)液在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均在某一波長(zhǎng)處有最大吸收峰，即可確定為最佳吸收波長(zhǎng)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取DEHP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用三氯甲烷溶解并定容，分別配制成一定濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最佳波長(zhǎng)下，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以吸光度對(duì)DEHP 質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得出線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

（3）回收率試驗(yàn)：向無(wú)DEHP土壤中加入一定量的已知濃度的DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用三氯甲烷進(jìn)行萃取。對(duì)萃取后溶液進(jìn)行DEHP含量的測(cè)定，計(jì)算樣品回收率。

（4）樣品測(cè)定：分別取3份土樣，用三氯甲烷萃取，在最佳波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)對(duì)萃取后溶液進(jìn)行測(cè)定，得出其吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算DEHP的含量。

2.2.2土壤中速效養(yǎng)分含量的測(cè)定

土壤中N、P、K含量：依照TPY-6土壤養(yǎng)分快速測(cè)試儀說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3試驗(yàn)設(shè)置

供試土壤采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)，分為處理組和對(duì)照組。在供試土壤中加入一定量的DEHP，使兩組土壤中DEHP含量達(dá)到50mg/kg，在處理土壤中接入一定量的DEHP降解菌DNEH-S1，對(duì)照組土壤中不接入菌。將兩組樣品置于25℃的培養(yǎng)箱中，為防止DEHP光解造成誤差，在三角燒瓶外裹錫紙，并且在修復(fù)試驗(yàn)期間定期補(bǔ)無(wú)菌水。本試驗(yàn)中的降解菌DNEH-S1來(lái)自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院環(huán)境污染生物修復(fù)研究室，經(jīng)16S的DNA鑒定為Pseudomonas aeruginosa。

3　試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1土壤中DEHP的含量

3.1.1最佳吸收波長(zhǎng)確定

以三氯甲烷為空白對(duì)DEHP和樣品檢測(cè)液在250～ 700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，樣品在275nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選擇275nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.1.2DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用三氯甲烷溶解并定容，分別配制成30、50、70、90、100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在275nm波長(zhǎng)處的吸光度。以吸光度對(duì)DEHP質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及線性回歸方程，如圖1所示。相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9911，表明該方法線性關(guān)系良好，測(cè)定數(shù)值比較準(zhǔn)確。

圖1　DEHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.3回收率試驗(yàn)

向100g土壤中，分別加入70mg/kg和100mg/kg的DEHP標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻后取10g樣品，用10mL三氯甲烷進(jìn)行萃取，用“1.5”方法對(duì)萃取后溶液進(jìn)行5次平行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

由表可知，DEHP 的回收率為92.02%～102.93%，表明樣品的回收率可靠。

3.1.4降解菌修復(fù)效果研究

本試驗(yàn)研究了6周內(nèi)DNEH-S1菌株對(duì)污染土壤的修復(fù)效果，如圖2所示。對(duì)照組土壤中在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中DEHP含量降低了3.09mg/kg，降解率為6%，這可能是因?yàn)橥寥乐性⑸锶郝鋵?duì)DEHP有一定的降解效果。

處理組初始DEHP濃度為50mg/kg，6周之后處理組土壤中DEHP含量下降為10.56mg/kg，降解率高達(dá)79%，說(shuō)明降解菌DNEH-S1在土壤中修復(fù)效果較好，可以進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用研究。

DEHP加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表

圖2　降解菌修復(fù)效果

本試驗(yàn)研究了6周內(nèi)處理組與對(duì)照組土壤內(nèi)速效氮含量的變化，如圖3所示。對(duì)照組土壤中在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中速效氮的含量變化較小，變化可能是因?yàn)橥寥乐性⑸锶郝鋵?duì)土壤中的氮有一定的吸收效果。

處理組初始速效氮濃度為10.44mg/L，6周之后處理組土壤中速效氮含量下降為9.01mg/L，吸收率高達(dá)13.70%。

本試驗(yàn)研究了6周內(nèi)處理組與對(duì)照組土壤內(nèi)速效磷含量的變化，如圖4所示。對(duì)照組土壤中在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中速效磷的含量變化較小，變化可能是因?yàn)橥寥乐性⑸锶郝鋵?duì)土壤中的磷有一定的吸收效果。

處理組初始速效磷濃度為9.51mg/L，6周之后處理組土壤中速效氮含量下降為7.80mg/L，吸收率高達(dá)17.98%。

本試驗(yàn)研究了6周內(nèi)處理組與對(duì)照組土壤內(nèi)速效鉀含量的變化，如圖5所示。對(duì)照組土壤中在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中速效鉀的含量變化較小，變化可能是因?yàn)橥寥乐性⑸锶郝鋵?duì)土壤中的鉀有一定的吸收效果。

處理組初始速效鉀濃度為54.69mg/L，6周之后處理組土壤中速效鉀含量下降為39.63mg/L，吸收率高達(dá)27.54%。

圖3 修復(fù)期間土壤中N含量

圖4　修復(fù)期間土壤中P含量

3.2修復(fù)過(guò)程中土壤N、P、K含量變化

圖5　修復(fù)期間土壤中K含量

綜上所述，修復(fù)過(guò)程土壤中的N、P、K含量變化如圖3、圖4、圖5所示。在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中，處理組土壤N、P、K含量均大幅降低，對(duì)照組土壤中N、P、K含量在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中基本保持不變，可見(jiàn)該降解菌在土壤中生長(zhǎng)狀況良好，能適應(yīng)該土壤的生活環(huán)境，具有持續(xù)開發(fā)的潛力，可進(jìn)行進(jìn)一步的研究與應(yīng)用。

4　結(jié)論

鄰苯二甲酸酯（PAEs）作為農(nóng)用塑料地膜中的增塑劑被大量使用，易從塑料地膜中釋放出而造成土壤污染。我國(guó)農(nóng)田土壤普遍存在農(nóng)藥、PAEs等有機(jī)物復(fù)合污染，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，生物降解是削減土壤中有機(jī)污染物的重要途徑。本試驗(yàn)研究了降解菌DNEH-S1在土壤中對(duì)DEHP降解特性及土壤中速效養(yǎng)分的動(dòng)態(tài)變化，探討了典型有機(jī)物復(fù)合污染土壤的生物降解的技術(shù)可行性。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論：

初始DEHP濃度為50mg/kg，6周之后處理組土壤中DEHP含量下降為10.56mg/kg，降解率高達(dá)79%，由試驗(yàn)結(jié)果可知，降解菌DNEH-S1對(duì)于土壤中DEHP污染有較好的修復(fù)效果。

在連續(xù)6周的營(yíng)養(yǎng)物監(jiān)測(cè)試驗(yàn)中，速效N、P、K含量不斷降低，說(shuō)明降解菌DNEH-S1在土壤中生長(zhǎng)狀況良好，能適應(yīng)該處土壤環(huán)境。具有持續(xù)開發(fā)的潛力，可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究與應(yīng)用。

［1］ 何文清，嚴(yán)昌榮，趙彩霞，等.我國(guó)地膜應(yīng)用污染現(xiàn)狀及其防治途徑研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（3）：533-538.

［2］ 滕應(yīng)，黃昌勇.重金屬污染土壤的微生物生態(tài)效應(yīng)及其修復(fù)研究進(jìn)展［J］.土壤與環(huán)境，2002，11（1）：85-89.

［3］ 謝慧君，石義靜，滕少香，等.鄰苯二甲酸酯對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響［J］.環(huán)境科學(xué)，2009，30（5）：1286-1291.

［4］ Liang，D W，F(xiàn)ang H H P，Zhang T. Microbial characterization and quantification of an anaerobic sludge degrading dimethyl phthalate.［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，106（1）：296-305.

［5］ 苗靜，祝惠，王鑫宏，等. DOP與Pb單一及復(fù)合污染對(duì)土壤酶活性的影響［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2009，22（7）：856-861.

［6］ 安瓊，靳偉.酞酸酯類增塑劑對(duì)土壤-作物系統(tǒng)的影響［J］.土壤學(xué)報(bào)，1999，36 （1）：118-126.

［7］ 王曙光，林先貴，尹睿.土壤中酞酸酯（PAEs）對(duì)叢枝菌根化植物生長(zhǎng)的影響［J］.生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)， 2003，19（1）：31-35.

［8］ 王麗霞.保護(hù)地鄰苯二甲酸酯污染的研究［D］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

Indoor Simulation Examination of Degradation Bacteria DNEH - S1

ZHANG Qi
（Northeast Agricultural University， Harbin 150036， China）

Phthalic acid esters （PAEs） is a kind of environmental endocrine substances that is widely used as the plasticizer in the farming-use plastic film， easy to release from the plastic film and cause soil pollution. Farmland soils commonly show pesticides， PAEs and other organic compound pollution in China and biodegradation is an important approach to cut down organic pollutants in soil. This experiment studies the degradation bacteria DNEH - S1 in the soil of DEHP degradation charac-teristics and the dynamic changes of the nutrients in the soil， discussing the bio-degradation technology feasibility of typical organic compound contaminated soil.

DEHP； bio-degradation； soil remediation； simulated test

X53

A

1006-5377（2016）09-0052-04