兩種不同方法檢測降鈣素原結(jié)果的比較

董慧芳，薛海華

內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010

?

兩種不同方法檢測降鈣素原結(jié)果的比較

董慧芳，薛海華

內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010

目的比較ELISA法檢測降鈣素原和免疫熒光層析法檢測降鈣素原結(jié)果的一致性，為合理選擇降鈣素原檢測方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法應(yīng)用ELISA法檢測降鈣素原和免疫熒光層析法檢測降鈣素對(duì)87例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，通過直接比較和計(jì)算結(jié)果判斷檢測結(jié)果的一致性。結(jié)果87例標(biāo)本中兩種方法結(jié)果的符合率89.3%。結(jié)論兩種不同檢測降鈣素原的方法具有一定的可比性，可以根據(jù)臨床需要選擇不同的檢測方法。

降鈣素原；ELISA法；免疫熒光層析法；符合率

降鈣素原（PCT）是一種誘導(dǎo)膿毒蛋白，隨著細(xì)菌、寄生蟲感染和膿毒癥等因素的影響，導(dǎo)致其在血漿中的水平不斷升高。但是機(jī)體自身進(jìn)行免疫和病毒感染時(shí)并不會(huì)對(duì)PCT造成變化。磁瓦，機(jī)體局部小范圍細(xì)菌感染及慢性炎癥等也不會(huì)對(duì)其造成影響。PCT還可以反映出機(jī)體全身炎癥的實(shí)際變化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，感染器官的程度、細(xì)菌類型、炎癥程度等均會(huì)對(duì)PCT水平產(chǎn)生影響。另外，PCT可以在部分患者進(jìn)行大型外科術(shù)后檢測到。

PCT水平的升高會(huì)產(chǎn)生很多并發(fā)癥狀，給患者的日常生活造成了很大影響，嚴(yán)重時(shí)將發(fā)生休克及多器官功能紊亂綜合征等，同時(shí)還會(huì)受到細(xì)菌感染。但是，從當(dāng)前PCT水平發(fā)展變化情況來看，細(xì)菌性病灶在PCT發(fā)展中較低，使用腸道釋放細(xì)胞因子與細(xì)菌移位都會(huì)引起誘導(dǎo)。

所以PCT的主要作用是對(duì)早期敗血癥進(jìn)行檢測，同時(shí)可以對(duì)其嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)定［1-3］?，F(xiàn)階段，檢測PCT的實(shí)驗(yàn)室方法有很多，不僅可以定性，亦可以定量。該研究選用ELISA法檢測降鈣素原和免疫熒光層析法檢測降鈣素原，對(duì)比研究其檢測結(jié)果的一致性。

1　材料與方法

1.1儀器、試劑

1.1.1ELISA法檢測降鈣素原酶標(biāo)儀的型號(hào)MK3；試劑盒購自長沙三濟(jì)有限公司（批號(hào)：F68100801188）；免疫熒光層析法檢測降鈣素原：廣州萬孚生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的免疫熒光定量分析儀.試劑盒購廣州萬孚（批號(hào)：2400615）。

1.1.2標(biāo)本的來源收集該院2014年10—12月實(shí)驗(yàn)室接收的臨床送檢標(biāo)本，有MICU病房、兒科、呼吸科、外科等相關(guān)臨床科室的87例檢測標(biāo)本，其中男性48例，女性39例，年齡在5～79歲之間。87份標(biāo)本用兩種方法同時(shí)檢測.

1.2方法

1.2.1ELISA法檢測降鈣素原采用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人降鈣素原（PCT）水平。反應(yīng)板用純化的人降鈣素原抗體包被，同時(shí)將待測標(biāo)本加入等待完全孵育后，再將辣根過氧化物酶標(biāo)記的PCT抗體加入到內(nèi)部。標(biāo)本中如果含有降鈣素元，就會(huì)和包被在反應(yīng)板上的降鈣素原抗體結(jié)合在一起，進(jìn)而與HRP標(biāo)記的降鈣素原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，洗滌后加入一定的TMB底物，注意TMB加入后，會(huì)在HRP酶催化作用下變?yōu)樗{(lán)色；加入適量酸作后會(huì)轉(zhuǎn)化成黃色。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下對(duì)吸光度進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，（OD值）和標(biāo)本中降鈣素原加入量呈線性關(guān)系。使用加樣槍將取出的樣品進(jìn)行5倍稀釋，然后在待測樣本孔中加入40 μL的樣品稀釋液，最后加待測樣本10 μL，標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后準(zhǔn)確加樣50 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，封板置37℃恒溫箱中孵育30 min。洗滌：充分洗滌每孔，在每個(gè)孔中加入立即可用的酶標(biāo)抗體50 μL，37℃恒溫箱中再孵育30 min。洗板.每孔加A、B顯色劑各50 μL，輕輕震蕩混勻，同時(shí)在37℃下避光顯色15 min。每孔加入50 μL終止液，在450 nm下讀OD值。測定必須在加入終止液之后的15 min內(nèi)完成。結(jié)果：通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出標(biāo)本中PCT的含量。

1.2.2免疫熒光層析法檢測降鈣素原免疫熒光層析法主要利用利用高度特異性發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)，對(duì)標(biāo)本中的PCT和預(yù)先包被在聚酯膜進(jìn)行標(biāo)記，讓降鈣素原單克隆抗體結(jié)合，在毛細(xì)效應(yīng)下結(jié)合物會(huì)向上層析，隨后會(huì)被在膜上固定的降鈣素原單克隆抗體捕獲，降鈣素原的濃度就是利用標(biāo)本中的降鈣素原含量與內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線完成信號(hào)轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的。該次研究發(fā)現(xiàn)，所選試劑使用免疫熒光雙抗體夾心法與被捕獲的結(jié)合物含量呈正相關(guān)，利用免疫定量分析儀掃描檢測區(qū)后可獲得光學(xué)信號(hào)，然后再對(duì)人體中的血液、血漿及血清中的降鈣素濃度進(jìn)行檢測。完成操作后，將待測樣本緩慢加入到溶液中攪拌混勻，當(dāng)樣本中的降鈣素原抗原與緩沖液中的熒光標(biāo)記降鈣素原單克隆抗體結(jié)合后就會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)復(fù)合物。使用滴加法將混合樣本加入到測試卡的加樣孔中，在利用層析作用下，反應(yīng)復(fù)合物會(huì)順著沿著硝酸纖維膜不斷向前擴(kuò)散，被固定在硝酸纖維膜檢測線上包被的降鈣素最終被原單克隆抗體所捕獲。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，樣本中含有的降鈣素原越多，則檢測線上的復(fù)合物就越多。熒光抗體信號(hào)的強(qiáng)度可以反應(yīng)被捕獲的PCT量。經(jīng)廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的免疫熒光檢測儀，可檢測出樣本中降鈣素原的濃度。

方法：取50 μL血清或血漿加入反應(yīng)液中混勻1 min，取75 μL加入反應(yīng)板中，置室溫15 min后，免疫熒光定量分析儀檢測。

2　結(jié)果

該文共收集了87例標(biāo)本進(jìn)行了兩種方法的檢測，結(jié)果符合率為89.3%，見表1。

表187　例標(biāo)本兩種方法結(jié)果的比較

3　討論

現(xiàn)階段，怎樣正確合理的使用抗生素已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的主要課題。如果使用抗生素時(shí)有一個(gè)指標(biāo)可以清楚地反映出抗生素的治療療效，就可以給醫(yī)生提供參考，幫助醫(yī)生及時(shí)找到適合患者的抗生素藥物，控制好抗生素使用劑量和療程，進(jìn)而控制患者的病情，同時(shí)還縮短了住院天數(shù)，節(jié)省病人資金花費(fèi)，提高了治療效果。PCT是降鈣素前體，進(jìn)行表達(dá)時(shí)，主要由神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、肺組織完成C細(xì)胞表達(dá)，但是在生理情況下很難在血液中檢測到該種物質(zhì)。它是一種誘導(dǎo)蛋白的膿毒，是驗(yàn)證診斷的新指標(biāo)，現(xiàn)在，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到病情檢測，感染疾病診斷中，也是目前檢測抗生素使用的一個(gè)指標(biāo)。其濃度變化會(huì)隨著患者細(xì)菌感染的病情的發(fā)展不斷變化，并且不受其他治療藥物（如糖皮質(zhì)激素）的影響，此外，PCT水平還能用于評(píng)估病人的預(yù)后，不同的PCT濃度提示感染的嚴(yán)重程度，伴發(fā)器官功能不全的可能，死亡率。經(jīng)過十多年的臨床驗(yàn)證，PCT已經(jīng)成為許多醫(yī)院的重癥患者的常規(guī)檢查項(xiàng)目之一，國內(nèi)也有越來越多的醫(yī)生認(rèn)識(shí)到PCT的重要性。臨床上檢測PCT的主要方法是半定量法和定量法，兩種檢測方法都是加注抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)完成的。

PCT定量檢測是一種非常有效的方法，尤其對(duì)于需要定期觀測治療效果的患者，具有非常大的意義。在該次研究中，主要對(duì)兩種不同檢測方法的檢測效果進(jìn)行了比較。研究方法的選擇也會(huì)對(duì)試驗(yàn)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，該次研究使用的兩種分析方法都可以檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，從數(shù)值方面分析，該次所選用的兩種方法檢測結(jié)果一致。

免疫層析法的主要原理是使用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)，將標(biāo)本中的降鈣素元和在聚酯模上包被的金標(biāo)記降鈣素元進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合物首先記住毛細(xì)效應(yīng)向上層析，之后會(huì)被固定在模上的降鈣素元單克隆抗體捕獲，試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)標(biāo)本中降鈣素元與鋪貨的集合物含量呈現(xiàn)正相關(guān)，降鈣素原的濃度就是利用標(biāo)本中的降鈣素原含量與內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線完成信號(hào)轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的。免疫定量分析儀融合了膠體金免疫層析技術(shù)定量檢測方法，具有操作方便、重復(fù)性好、線性范圍廣的特點(diǎn)，可以將其應(yīng)用到各種實(shí)驗(yàn)室中，但會(huì)出現(xiàn)假陰性及假陽性結(jié)果，需要引起重視。

電化學(xué)發(fā)光法檢測PCT主要利用PCT雙抗原夾心二步法進(jìn)行。主要原理是利用待測樣本和生物素化的單克隆PCT抗體以及標(biāo)記的復(fù)合物PCT同時(shí)進(jìn)行孵育，然后形成抗原抗體夾心復(fù)合物。此種方法的主要特點(diǎn)是干擾因素較少、比較快速而且與國外很多先進(jìn)一起具有很多相關(guān)性優(yōu)點(diǎn)。

該文共收集了87例標(biāo)本進(jìn)行了兩種方法的檢測，結(jié)果符合率為89.3%。該研究主要對(duì)ELISA法檢測和免疫熒光層析法檢測兩種檢測方法的效果進(jìn)行了比較，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，這兩種檢測結(jié)果不存在相關(guān)性，所以該文做了符合率的統(tǒng)計(jì)，判斷二者檢測結(jié)果是否一致。

ELISA法檢測PCT需要做出標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品，同時(shí)還要從實(shí)驗(yàn)室效益角度進(jìn)行分析，可以應(yīng)用到臨床標(biāo)本較多的實(shí)驗(yàn)室檢測。免疫熒光層析法具有操作簡便、精確度高、檢測范圍寬及重復(fù)性好等優(yōu)勢已經(jīng)廣泛用于實(shí)驗(yàn)室檢測中，但由于檢測方法的局限性，會(huì)產(chǎn)生假陰性和假陽性兩種結(jié)果，比較適合急診科、ICU等重癥監(jiān)護(hù)患者的病情檢測。通過比較，兩種不同檢測降鈣素原的方法具有一定的可比性，可以根據(jù)臨床需要選擇不同的檢測方法。ELISA法檢測降鈣素原適用于批量檢測，免疫熒光層析法檢測降鈣素可用于急診隨時(shí)檢測。

在該次研究中，兩種檢測的檢測結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種檢測方法均是臨床上實(shí)用性較大的檢測方法，由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室情況不同，在實(shí)際檢測中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況針對(duì)性選擇測方法，為臨床提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

綜上所述，兩種檢測降鈣素元的方法各有優(yōu)勢，但是由于實(shí)際檢測實(shí)驗(yàn)室不同，在實(shí)際檢測中應(yīng)該針對(duì)性進(jìn)行選擇，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。通常情況下，急診檢測中通常應(yīng)用免疫熒光層析法，對(duì)臨川疾病診斷及抗生素的合理應(yīng)用具有很大作用；如果進(jìn)行PCT高濃度檢測時(shí)，可以使用電化學(xué)發(fā)光法或經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法，對(duì)免疫熒光層析法進(jìn)行校正。

［1］Sudhir U，Venkatachalniah RK，Kumar TA，et al.Significance of senm Procalcitionin in sepsis［J］.Indian J Cnl Care Med，2011，15（1）：1-5.

［2］陳自武.降鈣素原、超敏C反應(yīng)蛋白與外周血堿性磷酸酶幾份在細(xì)菌感染中應(yīng)用探討［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，9（8）：572-573.

［3］杜冀暉，蘇卓娃，等.血清降鈣素原測定在兒科感染性疾病診斷中的應(yīng)用［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（9）：1320-1321.

［4］高紅軍，鄭敏，等.兩種降鈣素原檢測方法的比較研究［J］.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2011（8）：32.

Comparison of Results of Two Different Methods in Testing Procalcitonin

DONG Hui-fang，XUE Hai-hua
Inner Mongolia Steel Hospital，Baotou，Inner Mongolia，014010 China

Objective To compare the result consistency of ELISA method andimmunofluorescence chromatography in testing procalcitonin and provide the experimental basis for rational choice of procalcitonin test methods.Methods The procalcitonin of 87 cases of clinical specimens were detected by the ELISA method andimmunofluorescence chromatography，and the consistency of test results was determined by the direct comparison and result calculation.Results The coincidence rate of two methods of 87 cases of specimens was 89.3%.Conclusion The two different methods of testing procalcitonin have a certain comparability，and we can select the different test methods according to the clinical needs.

Procalcitonin；ELISA method；Immunofluorescence chromatography；Coincidence rate

R446.6

A

1672-5654（2016）09（a）-0111-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.25.111

2016-06-06）

董慧芳（1964.1-），女，山東肥城人，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事免疫檢驗(yàn)工作及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的檢測工作。