柳州市16例吸毒者HIV-1病毒流行株亞型分布及耐藥情況分析

陳柳軍，余鈞池，黃萍，鐘祥海，劉鑫

柳州市疾病預(yù)防控制中心，廣西柳州545007

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柳州市16例吸毒者HIV-1病毒流行株亞型分布及耐藥情況分析

陳柳軍，余鈞池，黃萍，鐘祥海，劉鑫

柳州市疾病預(yù)防控制中心，廣西柳州545007

目的了解2011—2013年柳州市吸毒人群人類(lèi)免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）亞型分布和毒株耐藥情況。方法從2011—2013年柳州市吸毒人群HIV-1感染者中，隨機(jī)抽取16例作為研究對(duì)象，從血漿中抽提核酸RNA，用RT-PCR進(jìn)行g(shù)ag及pol基因擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析。結(jié)果16例標(biāo)本中存在2種HIV-1亞型：重組亞型CRF01_AE 14例（87.5%），重組亞型CRF07_BC 2例（12.5%）。6株發(fā)生相關(guān)耐藥突變，主要發(fā)生在NRTIs和NNRTIs相關(guān)突變。結(jié)論2011～2013年柳州市吸毒人群HIV-1感染主要以CRF01_AE為主，主要在NRTIs和NNRTIs相關(guān)耐藥突變。

HIV-1；吸毒人群；基因亞型；耐藥

獲得性人類(lèi)免疫缺陷綜合癥簡(jiǎn)稱(chēng)艾滋病，是由人類(lèi)免疫缺陷病毒（human Immunodeficiency virus，HIV）引起的一種慢性傳染病。HIV在我國(guó)的流行始于1985年，經(jīng)過(guò)散發(fā)期、蔓延期后，于1995年進(jìn)入了快速增長(zhǎng)期，HIV感染在全國(guó)范圍內(nèi)急劇上升，如不采取有效的控制措施，今后將會(huì)有更多的HIV感染者。中國(guó)自1996年在靜脈吸毒人群（IDU）中發(fā)現(xiàn)首例本土HIV感染者以來(lái)，感染人數(shù)逐年上升。而柳州市是艾滋病疫情嚴(yán)重的地區(qū)之一，感染方式主要以性傳播、靜脈吸毒為主。了解近幾年柳州市吸毒者HIV-1病毒流行株亞型分布及耐藥情況，對(duì)于防控柳州市艾滋病的傳播、治療有重大意義。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

從2011—2013年柳州市吸毒人群HIV感染者中，隨機(jī)抽取16例。所有研究對(duì)象均經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB）確認(rèn)為HIV-1陽(yáng)性。

1.2主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自西安天隆公司、核酸擴(kuò)增試劑盒PrimeScript one step RT-PCR、Premix TaqTM、LA TaqTM Version 2.0 plus dye和普通瓊脂糖購(gòu)自大連寶生物TaKaRa。

1.3核酸提取、擴(kuò)增及測(cè)序

使用病毒DNA/RNA提取試劑盒從200 μL保存好的血漿中提取HIV RNA，采用巢式PCR方法擴(kuò)增HIV-1 gag、pol基因片段，擴(kuò)增引物如表1所示。巢式PCR第一步擴(kuò)增使用PrimeScript one step RT-PCR試劑盒，第二步擴(kuò)增采用Premix TaqTM LA TaqTM Version 2.0 plus dye試劑盒。第二步擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

表1　擴(kuò)增gag、pol基因片段的反應(yīng)引物

1.4亞型分析

用Chromas查看測(cè)序所得序列，Vector NTI Suite 10的Contig Express進(jìn)行序列拼接，ClustalX2進(jìn)行序列比對(duì)，經(jīng)BioEdit序列比對(duì)、修飾后，用MEGA 5軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，所得進(jìn)化樹(shù)用Bootstrap法檢驗(yàn)（重復(fù)500次），根據(jù)序列與參考序列的聚集情況確定病毒亞型，參考序列均來(lái)自L(fǎng)os Alamos National Laboratory HIV database（http：//www.hiv.lanl.gov/）。

1.5耐藥性分析

將測(cè)序所得pol基因序列提交至美國(guó)斯坦福大學(xué)HIV耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)（Stanford University HIV Drug Resista nce Database，http：//hivdb.stanford.edu/），點(diǎn)擊進(jìn)入HIV db PROGRA，輸入已測(cè)序列即可獲得各序列的耐藥位點(diǎn)及相關(guān)耐藥信息。

2　結(jié)果

2.1基因分型

16份樣本成功擴(kuò)增測(cè)序得到14條gag和11條pol基因片段，將基因序列輸入到HIV BLAST中，發(fā)現(xiàn)CRF01_AE 14例，占87.5%（14/16），CRF07_BC 2例，占12.5%（2/16）。將gag基因片段序列與典型高頻參考序列進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖1，圖中實(shí)心圓圈“●”代表典型的高頻出現(xiàn)的共享序列，黑色實(shí)心三角“▲”代表測(cè)序后的基因片段。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，重組亞型CRF01_AE高頻參考序列出現(xiàn)的城市主要來(lái)自廣西、福建、江蘇、遼寧、四川，重組亞型CRF07_BC對(duì)應(yīng)的高頻參考序列出現(xiàn)的城市主要有廣西、北京、新疆。

2.2耐藥分析

在獲得的基因序列中，有6株產(chǎn)生耐藥相關(guān)突變，見(jiàn)表1。蛋白酶抑制劑（PIs）相關(guān)突變有一種，為L(zhǎng)10V；核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）相關(guān)突變有7種，分別為T(mén)69N、V75C、A62V、F116Y、Q151M、M184V和K65R；非核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）相關(guān)突變有五種，分別為Y181C、K101H、G190A、L100I和K103N。耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，PIs相關(guān)突變?yōu)闈撛诘投饶退?，不?huì)引起病毒對(duì)藥物敏感性的改變；在NRTIs相關(guān)突變中，Q151M突變或M184V突變可引起毒株對(duì)拉米夫定（3TC）和恩去他濱（FTC）產(chǎn)生高度耐藥，K65R突變可引起毒株對(duì)替諾福韋（TDF）、雙脫氧肌苷（ddI）、阿巴卡韋（ABC）和司他夫定（d4T）產(chǎn)生中度或高度耐藥；在NNRTIs相關(guān)突變中，K103N突變可引起毒株對(duì)奈韋拉平（NVP）產(chǎn)生高度耐藥，G190A突變可引起毒株對(duì)NVP產(chǎn)生高度耐藥及對(duì)依非韋侖（EFV）中度耐藥。見(jiàn)表2。值得引起注意的是，在11例患者中，有2例患者出現(xiàn)了NRTIs，NNRTIs雙突變。

表2　HIV-1流行株耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)及種類(lèi)

圖1　基于gag基因片段序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

3　討論

該研究對(duì)柳州市16例吸毒者HIV-1病毒流行株進(jìn)行基因亞型分析，發(fā)現(xiàn)柳州市吸毒人群HIV-1亞型主要以重組亞型CRF01_AE為主，其次為重組亞型CRF07_BC，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)重組亞型CRF08_BC，這與廣西HIV分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)論一致［1］。其中，CRF01_AE與廣西、福建、江蘇、遼寧、四川流行株的相似性較高，CRF07_BC與廣西，北京。新疆流行株的相似性較高。在上世紀(jì)90年代，中國(guó)首次在云南和廣西確認(rèn)CRF01_AE重組型毒株，隨后在性傳播和吸毒高危人群中傳播［2-3］，在2006年的全國(guó)HIV分子流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，CRF01_AE重組型毒株已迅速成為我國(guó)最廣泛流行的毒株［4-5］，至今在各個(gè)感染途徑中，仍占主要位置。由于柳州市吸毒人群HIV-1亞型沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CRF08_BC，而廣西全省流行的HIV-1亞型存在有CRF01_AE、CRF07_BC、 CRF08_BC、CRF55_01B和B型，因此對(duì)柳州市吸毒人群的HIV防治工作，應(yīng)制定符合本地方特色的策略，方能更好地控制HIV的蔓延。

從該次耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，吸毒人群HIV-1感染者經(jīng)過(guò)抗病毒治療后已有部分感染者產(chǎn)生耐藥，PIs相關(guān)突變?yōu)闈撛诘投饶退?，不?huì)引起病毒對(duì)藥物敏感性的改變；NRTIs相關(guān)突變存在著Q151M突變、M184V突變及K65R突變，該突變可引起HIV-1毒株對(duì)3TC、FTC、TDF、ddI、ABC和d4T產(chǎn)生中度或高度耐藥；NNRTIs相關(guān)突變存在著K103N突變和G190A突變，該突變可引起毒株對(duì)NVP和EFV產(chǎn)生中度或高度耐藥。隨著柳州市抗病毒治療人群的增加，治療人群的耐藥情況也會(huì)越發(fā)嚴(yán)重，并可能發(fā)生擴(kuò)散，這對(duì)柳州市艾滋病防控、治療提出了嚴(yán)峻考驗(yàn)。由于該次研究樣本量較少，而對(duì)于HIV-1流行株耐藥情況分析，需進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，方能及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的耐藥情況。因此，今后需加強(qiáng)該方面的監(jiān)測(cè)工作，為柳州市HIV-1抗病毒治療和防止耐藥株傳播提供技術(shù)支持。

［1］蘇齊鑒，周平，閉志友，等.柳州和南寧市HIV-1亞型分布及耐藥情況調(diào)查［J］.病毒學(xué)報(bào)，2010，7（4）：290-294.

［2］Liao H，Tee KK，Hase S，et al.Phylodynamic analysis of the dissemination of HIV-1 CRF01_AE in Vietnam［J］.Virology，2009，391（1）：51-56.

［3］Yu XF，Chen J，Shao Y，et al.Two subtypes of HIV-1 among injection-drug users in southern China［J］.Lancet，1998，351（9111）：1250.

［4］Zhao B，Han X，Dai D，et al.New trends of primary drug resistance among HIV type 1-infected men who have sex with men in Liaoning Province，China［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2011，27（10）：1047-1053.

［5］Zhang X，Li S，Li X，et al.Characterization of HIV-1 subtypes and viral antiretroviral drug resistance in men who have sex with men in Beijing，China［J］.AIDS，2007，21（Suppl 8）：S59-S65.

Analysis of HIV-1 Virus Epidemic Strain Subtype Distribution in 16 Cases of Drug Users in Liuzhou and Drug Resistance

CHEN Liu-jun，YU Jun-chi，HUANG Ping，ZHONG Xiang-hai，LIU Xin
Center for Disease Prevention and Control，Liuzhou，Guangxi Province，545007 China

Objective To know the HIV-1 virus epidemic strain subtype distribution in drug users in Liuzhou from 2011 to 2013 and drug resistance.Methods 16 cases of HIV-1 infected persons in the drug users in Liuzhou from 2011 to 2013 were randomly selected as the research objects，and the nucleic acid RNA was extracted from blood plasma，RT-PCR was used for gag and pol gene amplification，and the amplification products were given sequencing and sequential analysis.Results In the 16 cases of specimens，there were 2 HIV-1 subtypes，14 cases of reconstruction subtypes CRF01_AE（87.5%），and 2 cases of reconstruction subtypes CRF07_BC（12.5%），the related drug resistance mutation occurred to 6 strains，and NRTIs and NNRTIs related mutations were the main.Conclusion The HIV-1 infection of drug users in Liuzhou from 2011 to 2013 was mostly CRF01_AE，and the NRTIs and NNRTIs related mutations were the main.

HIV-1；Drug user；Gene subtype；Drug resistance

R52

A

1672-5654（2016）09（a）-0081-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.25.081

2016-05-25）

［課題資助］廣西科學(xué)技術(shù)廳立項(xiàng)課題（項(xiàng)目編號(hào)：桂科攻1140003A-44）；廣西衛(wèi)生廳資助課題（項(xiàng)目編號(hào)：Z2007289）。

陳柳軍（1966.11-），男，廣西柳州人，本科，副主任檢驗(yàn)技師，研究方向：病原微生物檢測(cè)。