循經(jīng)選穴針刺對(duì)失眠大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)褪黑素含量及其受體基因表達(dá)的影響

謝莉娜 謝志強(qiáng) 郭鑫 魏歆然 岳增輝

摘要：目的 觀察循經(jīng)選穴針刺對(duì)失眠大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)褪黑素（MT）含量及其受體MT1、MT2基因表達(dá)的影響，探討針刺治療失眠癥的作用機(jī)制及循經(jīng)選穴針刺對(duì)腧穴配伍的效應(yīng)。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、百會(huì)+神門組、百會(huì)+三陰交組、百會(huì)+非經(jīng)非穴組，每組12只。大鼠腹腔注射DL-4-氯苯基丙氨酸混懸液建立失眠模型，各治療組針刺相應(yīng)腧穴，每次30 min，治療7 d。采用ELISA檢測(cè)大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)MT含量；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)MT1、MT2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組MT含量及MT1、MT2 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各針刺組MT含量及MT1、MT2 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），且以百會(huì)+神門組升高最為明顯。結(jié)論 針刺通過調(diào)節(jié)失眠大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)MT含量及其受體MT1、MT2 mRNA的表達(dá)發(fā)揮治療作用，且循經(jīng)選穴針刺可能是腧穴配伍效應(yīng)的影響因素之一。

關(guān)鍵詞：針刺；失眠；褪黑素；褪黑素受體1a；褪黑素受體1b；循經(jīng)選穴；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.011

中圖分類號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0040-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection on the melatonin （MT） content and the expression of MT1 and MT2 genes in the ventrolateral preoptic area （VLPO） of insomnia rats； To investigate the therapeutic mechanism of acupuncture in treating insomnia and the effect of acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection on compatibility effect of acupoints. Methods Totally sixty SD rats were randomly divided into blank group， model group， Baihui + Shenmen group， Baihui + Sanyinjiao group and Baihui + non-acupoint group， with 12 rats in each group. Chlorophenylalanine suspension was intraperitoneal injected to establish insomnia model rats. Each treatment group received acupuncture in relevant acupoints， 30 min each time， for 7 d. Levels of MT in the VLPO were detected by ELISA， and real-time fluorescence quantitative PCR was used to measure the expressions of MT1 and MT2 mRNA in VLPO of rats. Results Compared with blank group， levels of MT and expressions of MT1 and MT2 mRNA in model group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； Compared with model group， levels of MT and expressions of MT1 and MT2 mRNA in acupuncture groups increased significantly （P<0.05， P<0.01）， and Baihui + Shenmen group increased the most obvious. Conclusion Acupuncture treatment can play a therapeutic role by regulating levels of MT and the expressions of MT1 and MT2 mRNA in the VLPO of insomnia rats， and acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection may be one of the factors that cause the difference of compatibility effect of acupoints.

Keywords： acupuncture； insomnia； melatonin； MT1； MT2； meridians and acupoint selection； rats

失眠是一種最常見的睡眠障礙，主要特點(diǎn)為持續(xù)長時(shí)間不能獲得正常睡眠或?qū)λ哔|(zhì)量不滿意。其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，患病率在快節(jié)奏生活方式的現(xiàn)代社會(huì)中有逐年增高趨勢(shì)，世界范圍內(nèi)失眠障礙臨床患病率約為10%～12%[1]。研究表明，睡眠是大腦中調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期的多個(gè)中心共同參與的神經(jīng)化學(xué)過程，而下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateral preoptic area，VLPO）為其中一主要結(jié)構(gòu)[2-3]。褪黑素（melatonin，MT）于1959年被國外學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)，在人體廣泛分布，主要存在于視交叉上核，為松果體分泌的吲哚類激素，研究發(fā)現(xiàn)其有鎮(zhèn)靜催眠和調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期的作用[4]。研究表明，褪黑素調(diào)節(jié)睡眠是通過與褪黑素受體1a（MT1）、褪黑素受體1b（MT2）作用來實(shí)現(xiàn)，而這兩受體作用方式不同，前者主要抑制神經(jīng)元活動(dòng)，后者主要誘導(dǎo)相位轉(zhuǎn)變[5]。

近年來，針刺治療失眠療效顯著[6]，且越來越被患者接受。臨床上針刺治療失眠選穴方法多樣，正確的腧穴配伍是提高針刺療效的關(guān)鍵因素之一，不同的腧穴配伍方式與針刺治療失眠的療效密切相關(guān)[7-8]。而循經(jīng)選穴作為腧穴配伍的重要原則之一，主要是指根據(jù)經(jīng)脈循行所過部位的病變、經(jīng)脈所屬臟腑的病變選擇相應(yīng)經(jīng)脈上的腧穴進(jìn)行治療的方法[9]。本研究通過固定按部選穴（百會(huì)），對(duì)比配伍本經(jīng)穴、他經(jīng)穴、非經(jīng)非穴對(duì)失眠大鼠VLPO區(qū)MT1、MT2表達(dá)的影響，探討針刺治療失眠的療效機(jī)制及循經(jīng)選穴針刺對(duì)腧穴配伍效應(yīng)的影響，為臨床針灸治療失眠的選穴原則及配穴方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SD雄性大鼠60只，SPF級(jí)，8～9周齡，體質(zhì)量220～250 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（湘）2013-0004。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每籠5只，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，溫度23～26 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，所有動(dòng)物在同等條件下按組分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、百會(huì)+神門組、百會(huì)+三陰交組、百會(huì)+非經(jīng)非穴組，每組12只。

1.2 主要試劑及儀器

DL-4-氯苯基丙氨酸（PCPA），美國Sigma公司；戊巴比妥鈉，Merck公司；碳酸氫鈉片、氫氧化鈉片，成都市科龍化工試劑廠；阿拉伯膠，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；動(dòng)物型超純水機(jī)，摩爾公司；pH精密試紙（5.5～9.0），墊中墊公司；電熱水恒溫杯，Promega公司；RNA提取試劑Trizol Reagent，Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄（M-MLV）、核糖核酸酶抑制劑（RNasin）、dNTP、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）、隨機(jī)引物（Random primers）、瓊脂糖（agarose），美國Promega公司；熒光定量試劑盒（SYBR Green qPCR），Promega公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀，ABI 7500 FAST，美國ABI公司；ABI 7300 Real-Time PCR System，美國ABI公司；超低溫冰箱，德國賀利氏公司；UVP凝膠掃描系統(tǒng)，美國UVP公司；微量移液器，德國Gilson公司；DYZ-22A型雙恒定時(shí)電泳儀、DYY-Ⅱ橋式電泳儀，北京六一儀器廠；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；0.25 mm×25 mm華佗牌一次性使用無菌針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 造模

采用經(jīng)典PCPA方法建立失眠大鼠模型[10]。實(shí)驗(yàn)前大鼠稱重；除空白組外，其余組第8日開始腹腔注射PCPA混懸液（500 mg/kg，50 mg/mL），1次/d，連續(xù)2 d，制作失眠大鼠模型。具體操作：PCPA臨用前按大鼠體質(zhì)量用事先配制的弱堿性生理鹽水（pH值7～8）配制成混懸液。預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得PCPA按大鼠體質(zhì)量35 mg/kg劑量腹腔注射為引起100%大鼠睡眠的最小閾劑量。用注射器取與大鼠體質(zhì)量相應(yīng)劑量的混懸液腹腔注射。同時(shí)，空白組取等體積弱堿性生理鹽水腹腔注射。首次注射PCPA混懸液36 h后，觀察模型組大鼠生理狀態(tài)，失眠大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律缺失、日間與夜晚皆活動(dòng)不斷、對(duì)外界刺激異常敏感、煩躁不安等相關(guān)癥狀，結(jié)合經(jīng)典的戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)，觀察空白組與模型組大鼠睡眠潛伏期及睡眠總時(shí)間的差異，進(jìn)行失眠模型評(píng)價(jià)，若模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則提示造模成功[11]。

1.4 干預(yù)

造模后，于第2次注射PCPA混懸液24 h后，開始對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行干預(yù)。各針刺組大鼠選穴參考大鼠穴位定位[12]。

空白組：大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理；模型組：大鼠予以仰臥位束縛于鼠板上，只捆綁，不進(jìn)行針刺，每日1次，30 min/次，連續(xù)7 d，每日捆綁結(jié)束后正常進(jìn)食；百會(huì)+神門組選取“百會(huì)”（位于頂骨正中處）、雙側(cè)“神門”（位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣）；百會(huì)+三陰交組選取“百會(huì)”、雙側(cè)“三陰交”（位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm）；百會(huì)+非經(jīng)非穴組選取“百會(huì)”、非經(jīng)非穴點(diǎn)（位于肘內(nèi)側(cè)，肘尖與腋窩連線中點(diǎn)，在非經(jīng)脈循行路線上及非穴位所在部位，此點(diǎn)參照成都中醫(yī)藥大學(xué)所制定的選穴方法）。具體操作如下：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，定穴后剪毛、消毒，0.25 mm×25 mm華佗牌針灸針進(jìn)行針刺，“百會(huì)”從后向前平刺20 mm，“神門”直刺1 mm，“三陰交”和非經(jīng)非穴點(diǎn)均直刺5 mm，留針30 min，每10 min行針1次，行針時(shí)間1 min，不提插、只捻轉(zhuǎn)，行平補(bǔ)平瀉手法，幅度和頻率為均等手法，30 min時(shí)，在行針結(jié)束后出針，每日1次，每日治療后正常進(jìn)食，連續(xù)7 d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 行為學(xué)觀察

觀察大鼠精神狀態(tài)、動(dòng)作與反應(yīng)靈敏性、晝夜節(jié)律、體質(zhì)量及活動(dòng)度、飲食、飲水等與失眠相關(guān)的指標(biāo)變化。

1.5.2 ELISA檢測(cè)褪黑素含量

所有大鼠于末次治療后，禁食不禁水12 h，斷頭處死后立即剪開顱骨頂骨、硬腦膜，冰臺(tái)上取出VLPO區(qū)組織，置于-80 ℃冰箱保存。測(cè)定時(shí)以空白管調(diào)零，450 nm波長依序測(cè)量各孔吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10 min內(nèi)進(jìn)行。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再將樣品的OD值代入回歸方程計(jì)算出樣品濃度。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)褪黑素受體1、2基因表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。冰浴條件下超聲粉碎VLPO區(qū)組織，離心，先后加入氯仿、異丙醇、75%乙醇，RPE Solution，離心，再加入75%乙醇，離心，加入30 μL DEPC-treated ddH2O，放置5 min，離心，即得RNA溶液；電泳槽中電泳后，定性檢驗(yàn)提取RNA質(zhì)量，行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終放入熒光定量PCR儀進(jìn)行定量反應(yīng)，計(jì)算PCR產(chǎn)物2-ΔΔCt值，即相對(duì)定量法測(cè)定初始模板量。引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，經(jīng)檢驗(yàn)滿足正態(tài)性及方差齊性，采用方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較；不滿足方差齊性，用Tamhane'T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空白組造模前后睡眠潛伏期及睡眠總時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；造模組大鼠注射戊巴比妥鈉后，與造模前比較，造模后睡眠潛伏期顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），睡眠總時(shí)間顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 大鼠死亡情況

實(shí)驗(yàn)中共有7只大鼠死亡，其中模型組4只，百會(huì)+三陰交組1只，百會(huì)+非經(jīng)非穴組2只。

2.3 大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果

空白組大鼠晝夜節(jié)律及飲食、飲水量正常，行為活動(dòng)正常，大小便變化不明顯，毛發(fā)光澤；與空白組比較，造模組大鼠注射PCPA混懸液后出現(xiàn)晝夜活動(dòng)不停，飲食量顯著減少，飲水量顯著增多，晝夜節(jié)律消失，互相攻擊，對(duì)外界各種刺激敏感度提高，毛發(fā)光澤度差，籠內(nèi)墊料較潮濕，糞便顏色變淺、質(zhì)地較軟；與模型組比較，各針刺組于治療第3日開始恢復(fù)晝夜節(jié)律，飲食量較前遞增，飲水量較前遞減，糞便顏色恢復(fù)正常黃褐色，質(zhì)地較前變硬。

2.4 針刺對(duì)失眠大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)褪黑素含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠VLPO區(qū)MT含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，各針刺組大鼠VLPO區(qū)MT含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與非經(jīng)非穴組比較，百會(huì)+神門組大鼠VLPO區(qū)MT含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3。

2.5 針刺對(duì)失眠大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)褪黑素受體1、2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠VLPO區(qū)MT1、MT2 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，各針刺組大鼠VLPO區(qū)MT1、MT2 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與百會(huì)+神門組比較，百會(huì)+三陰交組、百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠VLPO區(qū)MT1、MT2 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與百會(huì)+三陰交組比較，百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠VLPO區(qū)MT1、MT2 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表4。

3 討論

失眠屬中醫(yī)學(xué)“不寐”范疇。病因大致為臟腑陰陽失衡、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、久病體虛等。病機(jī)雖復(fù)雜，關(guān)鍵在神失所主、心神不安。故其病位主要在心，且與脾、腎等密切相關(guān)。心藏神，外邪侵?jǐn)_，神不守舍，陽不入陰故失眠；心主血脈，心血虧虛、心神失養(yǎng)故不寐。脾主運(yùn)化，主統(tǒng)血，脾氣生化無源，心失氣血濡養(yǎng)可致不寐，《素問·厥論篇》“太陰之厥，則腹?jié)M脹，后不利，不欲食，食則嘔，不得臥”；脾主思，思慮過度致氣結(jié)或氣滯，亦可形成不寐，《類證治裁》所論“思慮傷脾，脾血虧損，經(jīng)年不寐”。腎主水，為先天之本，腎中真元不足，可致陽不入陰，神不安守，多表現(xiàn)為入睡困難、易醒早醒，《醫(yī)法圓通》謂：“不臥一證……有因腎陽衰而不能啟真水上升以交于心，心氣即不得下降，故不臥。”頭為諸陽之會(huì)，百會(huì)位于巔頂，為經(jīng)脈之氣會(huì)聚之處，具有醒腦開竅、鎮(zhèn)靜安神之功，楊上善說“胃流津液滲入骨空，變而為髓，頭中最多，故為海也。是腎所生，其氣上輸腦蓋百會(huì)穴，下輸風(fēng)府也”?！敖?jīng)脈所過，主治所及”，神門為心經(jīng)原穴，有鎮(zhèn)靜安神功效，心安則能入眠。三陰交屬足太陰脾經(jīng)，為三陰經(jīng)交匯處，調(diào)三經(jīng)之氣而使陰可斂陽。由此可知，以上3穴與失眠關(guān)系密切，本研究以百會(huì)作為固定按部選穴，各針刺組在此基礎(chǔ)上分別配以不同經(jīng)脈穴位，神門為本經(jīng)穴，三陰交為他經(jīng)穴，為說明循經(jīng)選穴是否有特異性，另設(shè)百會(huì)+非經(jīng)非穴作為對(duì)照，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為合理。

MT分泌晝夜節(jié)律性與光照有關(guān)，由視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）控制，日光照射通過此結(jié)構(gòu)抑制MT的分泌，因此夜間MT分泌明顯升高[13]。MT有3個(gè)受體，分別為MT1、MT2和MT3，其廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦SCN、海馬、小腦皮質(zhì)、前額葉、基底節(jié)，以及視網(wǎng)膜、血管、乳腺、肝、腎和胃腸道等系統(tǒng)的細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)與睡眠有關(guān)的是MT1和MT2，MT通過與MT1和MT2作用來調(diào)節(jié)睡眠、恢復(fù)晝夜節(jié)律、提高睡眠質(zhì)量，改善身體的機(jī)能，提高生活質(zhì)量[14]。針灸是治療失眠的有效方法，因其療效確切且不良反應(yīng)少而廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可顯著改善大鼠睡眠-覺醒晝夜節(jié)律紊亂，其機(jī)制可能與其對(duì)血清MT水平及節(jié)律的調(diào)節(jié)有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的PCPA造模方法建立失眠大鼠模型，結(jié)合戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)，通過觀察大鼠睡眠時(shí)間和生理指標(biāo)的變化確定造模成功。與模型組比較，各針刺組大鼠經(jīng)治療后VLPO區(qū)MT含量及MT1、MT2 mRNA表達(dá)明顯升高，且均為百會(huì)+神門組優(yōu)于其余2組。以上數(shù)據(jù)結(jié)果與其表現(xiàn)出的晝夜節(jié)律、興奮性、納食進(jìn)水量等生理指標(biāo)的變化有一定程度的吻合，表明針刺治療失眠的療效確切，其改善睡眠的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)失眠大鼠VLPO區(qū)MT含量及MT1、MT2 mRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，腧穴配伍不同，其療效也各異，本實(shí)驗(yàn)通過固定取穴（“百會(huì)”），再分別配以不同經(jīng)脈腧穴（心經(jīng)穴、脾經(jīng)穴、非經(jīng)非穴），比較本經(jīng)穴、他經(jīng)穴、非經(jīng)非穴的療效差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，神門可作為臨床治療失眠的必要穴位，三陰交可作為符合辨證的首選穴位。同時(shí)表明，MT及其受體與睡眠有密切的關(guān)系，循經(jīng)選穴針刺是腧穴配伍效應(yīng)的影響因素之一。

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