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    拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質(zhì)與水分結(jié)構(gòu)變化

    2016-10-18 06:03:34王艷敏高瑞昌
    食品科學(xué) 2016年18期
    關(guān)鍵詞:凡納濱曼光譜拉曼

    袁 麗,紀(jì) 秀,石 彤,王艷敏,高瑞昌*

    (江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質(zhì)與水分結(jié)構(gòu)變化

    袁麗,紀(jì)秀,石彤,王艷敏,高瑞昌*

    (江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    探明凍藏過程中凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)與水分的結(jié)構(gòu)變化有助于揭示蛋白質(zhì)冷凍變性機(jī)理,采用拉曼光譜技術(shù)對凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在不同凍藏溫度條件下的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并結(jié)合重水置換技術(shù)表征肌肉蛋白質(zhì)的氘代動力學(xué),從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表層水分子角度研究凍藏溫度對蛋白質(zhì)冷凍變性的影響。結(jié)果表明:凍藏過程中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)由規(guī)整轉(zhuǎn)向松散,肽鏈展開,且-18 ℃凍藏的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散性比-40 ℃顯著;伴隨蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開,表面疏水性增加,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水的相互作用減弱,且凍藏溫度越高,相互作用減弱越劇烈,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也越不穩(wěn)定,水分越容易流失;而凍藏溫度越低,蛋白質(zhì)與水分的相互作用越強(qiáng),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,越有利于保持對蝦原有品質(zhì)。

    凡納濱對蝦;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);水;凍藏;拉曼光譜;重水置換

    我國有一半以上的加工水產(chǎn)品為冷凍產(chǎn)品,大量水產(chǎn)品得以順利走入市場依賴于冷凍保藏技術(shù)的發(fā)展[1]。凡納濱對蝦肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富,是深受人們喜愛的水產(chǎn)品之一。凍藏是凡納濱對蝦貯藏與加工的必要手段,然而在冷藏或凍藏過程中,肌肉蛋白質(zhì)容易發(fā)生冷凍變性,造成食用品質(zhì)下降,影響產(chǎn)品質(zhì)量[2]。實質(zhì)上,蛋白質(zhì)的變性是指在某些物理化學(xué)作用下,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,分子內(nèi)部構(gòu)象出現(xiàn)變化,生物活性也隨之變化。水產(chǎn)品動物蛋白質(zhì)在特定因素的作用下(如凍藏),分子結(jié)構(gòu)從有序結(jié)構(gòu)可以轉(zhuǎn)變成無序結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)不同的構(gòu)象,同時分子的功能特性減弱或消失,最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降[3]。目前對于水產(chǎn)品冷凍變性的評價指標(biāo)主要依賴Ca-ATPase活性、蛋白溶解度等蛋白質(zhì)生化特性[4-8],而從冷凍水產(chǎn)品蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)變化的角度研究較少。

    拉曼光譜技術(shù)被證實是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的一個重要手段,具有快速、無損、不受水溶液影響的特性[9-11]。最近有研究[12]表明,拉曼光譜還可以用于研究蛋白質(zhì)和水的相互作用、水變化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,O—H鍵的伸縮振動是研究水和蛋白質(zhì)的相互作用的主要依據(jù)。氫/氘交換技術(shù)主要運(yùn)用于核磁共振波譜法對蛋白質(zhì)的研究中,利用氘代后質(zhì)量的不同區(qū)分氫原子的化學(xué)位移變化[13],也被用來研究蛋白質(zhì)構(gòu)象二、三級結(jié)構(gòu)及分子活動性[14-16]。本研究采用拉曼光譜技術(shù)對冷凍對蝦的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析,結(jié)合重水置換技術(shù),分析重水峰峰強(qiáng)變化、O—H/C—H的峰面積比和特征譜帶的相對強(qiáng)度變化,表征蛋白質(zhì)冷凍變性過程中蛋白質(zhì)與水分子的相互作用強(qiáng)弱,闡述凍藏溫度對凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響,從蛋白與水結(jié)構(gòu)變化角度闡釋蛋白質(zhì)冷凍變性機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    新鮮凡納濱對蝦 歐尚超市。

    重水(純度99%) 美國Sigma公司;其他化學(xué)試劑(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2儀器與設(shè)備

    VERTEX 70傅里葉變換拉曼光譜 德國Bruker公司;透析管(3 500~5 000 D) 美國Spectrum公司。

    1.3方法

    1.3.1樣品預(yù)處理

    取新鮮對蝦和不同凍藏條件下的對蝦樣品,去頭尾,去皮,切成肉糜狀后置于4 ℃條件下備用,用于重水交換和拉曼光譜的測定。

    1.3.2拉曼光譜測定

    參考Sánchez-gonzález等[14]的方法進(jìn)行氫/氘同位素交換,將對蝦肉糜置于透析管中,再放置在D2O中進(jìn)行交換,15 ℃分別處理0、1、3、5、7 h。用傅里葉拉曼光譜儀進(jìn)行掃描,激光器波長為1 064 nm,分辨率為4.0 cm—1,激光功率為300 mW,保持15~20 ℃恒溫,累計掃描2 000 次,每個樣品掃描2 遍,用OPUS軟件記錄下位移范圍在400~4 000 cm—1的拉曼光譜。

    1.3.3凡納濱對蝦肌動球蛋白表面疏水性的測定

    1.3.3.1凡納濱對蝦肌動球蛋白的提取

    取2 個凍藏溫度不同凍藏時間的凡納濱對蝦,去頭尾、去皮、肌肉組織勻漿,隨后加入4 倍體積的磷酸緩沖液(pH 7.0),3 000 r/min離心10 min,傾去上清液,再加入磷酸緩沖液進(jìn)行離心,重復(fù)3 次。將去除雜質(zhì)的肌肉蛋白加入3 倍體積的磷酸鹽緩沖液,靜置過夜,再經(jīng)8 000 r/min離心15 min,然后將上清液用2 層紗布過濾,濾液緩慢倒入10 倍體積冷卻蒸餾水中,用15%醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5~6.6,隨后再靜置4~5 h,經(jīng)6 000 r/min離心10 min得到沉淀,然后再用0.6 mol/L KCl溶液溶解沉淀,放入0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate緩沖液中透析一夜。將透析后的溶液10 000 r/min離心1 h,取上清液緩慢倒入10 倍體積的冷卻蒸餾水中,再次稀釋沉淀,即得到精提的肌動球蛋白樣品,所有操作均在低于4 ℃環(huán)境下進(jìn)行,制備的樣品置于冰上保存待用。

    1.3.3.2肌動球蛋白疏水性的測定

    參考Yongsawatdigul等[17]的方法,將上述蛋白質(zhì)樣品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液中,使肌動球蛋白質(zhì)量濃度(C)范圍落在0.05~10.8 mg/mL,取8 mmol/L的8-苯胺基萘-1-磺酸鹽40 μL,與4 mL樣品溶液置于黑暗處反應(yīng)10 min,用磷酸緩沖液做空白對照。設(shè)定熒光分光光度計的狹縫校正5 nm,激發(fā)波長為386 nm,發(fā)射波長為478 nm,測定相對熒光強(qiáng)度(R),由R與C的比值可得肌動球蛋白的疏水性。

    1.3.4氘代動力學(xué)分析

    氘代動力學(xué)表征為凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在重水置換的動態(tài)過程中,重水中的OD與蛋白質(zhì)和水分子中的CH、OH相互置換的強(qiáng)弱能夠反映蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用的變化情況。計算方法定義為未置換的對蝦蛋白質(zhì)樣品中拉曼光譜中的O—H/C—H的面積比值為1,以置換時間為橫坐標(biāo),O—H/C—H面積比的變化情況為縱坐標(biāo)做散點圖并擬合得到不同凍藏溫度條件下的氘代動力學(xué)變化圖[14]。

    1.4譜圖處理

    將得到的拉曼圖譜在OMNIC軟件上進(jìn)行平滑和基線校正處理,在Peakfit軟件上進(jìn)行去卷積和求二階導(dǎo)數(shù),以利于區(qū)別重疊子峰,用曲線擬合處理,得到圖譜的峰強(qiáng)和峰面積,用Orign 8.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白二級結(jié)構(gòu)變化

    拉曼波譜主要來源于蛋白質(zhì)分子中的C—N鍵和C=O鍵的伸縮振動,拉曼圖譜中1 655 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶的變化與蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的各種二級結(jié)構(gòu)含量變化密切相關(guān)[11,18]。但是實驗中由于表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的多個振動吸收峰易重疊在一起,拉曼光譜圖譜中容易出現(xiàn)寬峰,因此常運(yùn)用去卷積和曲線擬合的方法來區(qū)分不同的重疊譜帶,得到單個譜帶的信息。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指在肽鏈中部分肽段的骨架所形成的結(jié)構(gòu),它主要包含α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲結(jié)構(gòu)和環(huán)形等不同的類型[19],其中α-螺旋結(jié)構(gòu)表征蛋白質(zhì)分子的規(guī)整性,β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)反映蛋白質(zhì)分子的松散性。

    表1 -18 ℃凍藏條件下的凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量變化Table1 Changes in secondary structure contents of whiteleg shrimp muscle protein frozen at -18 ℃%

    表2 -40 ℃凍藏條件下的凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量變化Table2 Changes in secondary structure contents of whiteleg shrimp muscle protein frozen at-40 ℃%

    從表1、2可以看出,肌肉蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量在-18 ℃和-40 ℃凍藏溫度條件下均隨凍藏時間的延長呈下降趨勢,分別下降35.76% 和27.23%。而肌肉蛋白質(zhì)的β-折疊和轉(zhuǎn)角含量在-18 ℃和-40 ℃凍藏條件下整體上呈上升趨勢,同一凍藏時間內(nèi)兩種凍藏樣品間的β-折疊含量差異不明顯,但是轉(zhuǎn)角則表現(xiàn)為凍藏溫度越高其含量隨貯藏時間延長上升越大??娝傻龋?0]研究了凍藏過程中的扇貝的質(zhì)量變化,結(jié)果表明凍藏溫度不同能造成蛋白質(zhì)的變性程度的不同,在-25 ℃凍藏溫度條件下扇貝蛋白質(zhì)的變性速度顯著低于-18 ℃凍藏溫度條件下的扇貝。Herrera等[21]也報道在-10 ℃和-30 ℃兩個凍藏溫度條件下魚肉蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)均會發(fā)生變化,但-10 ℃的結(jié)構(gòu)變化更加明顯。結(jié)果顯示,在2 個凍藏溫度條件下,凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)隨著凍藏時間的延長發(fā)生了較大變化,其中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量減少,β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量增加,可能發(fā)生了α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。如前所述,蛋白質(zhì)分子的α-螺旋結(jié)構(gòu)的降低和β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的升高意味著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化,并且與凍藏溫度存在相關(guān)性,溫度越高,結(jié)構(gòu)松散性越明顯。

    2.2凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)表面疏水性的變化

    圖1 凍藏期間對蝦肌動球蛋白表面疏水性變化Fig.1 Changes in surface hydrophobicity of shrimp myosin during frozen storage

    由于表面疏水性測定要求蛋白純化程度較高,所以實驗中通過提取對蝦肌肉蛋白質(zhì)主體部分肌動球蛋白進(jìn)行測定,以表征肌肉蛋白質(zhì)的表面疏水性變化趨勢。由圖1可知,隨凍藏時間的延長,肌動球蛋白的表面疏水性總體呈上升趨勢,且凍藏溫度越高,表面疏水性越高。在凍藏前4 周,對蝦肌動球蛋白的表面疏水性均增加顯著,-18 ℃和-40 ℃條件下的樣品增加幅度分別為75%

    和74%。之后的4~12 周,-18 ℃條件下凍藏樣品的表面疏水性仍有較大幅度上升,而-40 ℃條件下凍藏樣品的表面疏水性上升幅度趨于平緩。蛋白質(zhì)的表面疏水性是由蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對含量決定的,對于某些蛋白質(zhì),表面疏水性的增加反映了蛋白質(zhì)的變性程度的增加。低溫凍藏過程中,蝦肉蛋白質(zhì)表面疏水性的增加歸因于蛋白質(zhì)的去折疊和或伸展導(dǎo)致疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露,是表征蛋白質(zhì)變性的重要指標(biāo)之一。結(jié)果與前面所述的凡納濱對蝦蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變規(guī)律一致,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由規(guī)整轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮ⅰ?/p>

    2.3凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)氘代后的重水峰強(qiáng)度變化

    圖2 肌肉蛋白質(zhì)氘代前后的拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of shrimp muscle protein before and after H/D exchange

    利用拉曼光譜法和同位素氫/氘置換技術(shù)測定凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在不同凍藏溫度條件下其分子內(nèi)及表面的氫和重水中的氘相互置換的程度變化規(guī)律,探索蛋白質(zhì)表面水分子在冷凍變性過程中的變化規(guī)律。如圖2所示,2 500 cm-1附近的拉曼譜帶表征O—D鍵的伸縮振動,此波帶附近的拉曼強(qiáng)度值的變化可表征蝦肉蛋白質(zhì)的重水置換程度,強(qiáng)度越高代表重水置換程度越高,即蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和表層可置換的氫原子越多。因此實驗利用此峰的強(qiáng)度變化來表征蛋白質(zhì)與水分子的相互作用強(qiáng)弱變化,同時也可表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。Khoshtariya等[22]用光譜研究水合牛血清蛋白質(zhì)的高度可極化水-水氫鍵和界面滲透網(wǎng)絡(luò)時表明,位于3 260、2 840 cm—1處有非常寬的OH亞鍵,OD鍵相應(yīng)的處于2 350、2 050 cm—1,被指這些鍵是水分子的伸縮振動,包括水-水氫鍵和蛋白質(zhì)-水相互作用。

    圖3 -18 ℃(a)和-40 ℃(b)條件下對蝦肌肉蛋白質(zhì)重水置換的拉曼圖譜重水峰強(qiáng)度變化Fig.3 Raman intensity of H/D isotopic exchange for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 ℃ and -40 ℃

    圖3為-18 ℃和-40 ℃凍藏條件下不同凍藏時間的O—D鍵的拉曼強(qiáng)度值變化,表征凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)氘代程度變化。結(jié)果顯示,無論是新鮮還是凍藏后的樣品,2 500 cm—1附近的拉曼譜帶強(qiáng)度都隨置換時間延長而增加,并且實驗過程中發(fā)現(xiàn),拉曼強(qiáng)度在置換7 h后趨于穩(wěn)定,特別是-40 ℃條件下的樣品更明顯。-18 ℃條件下凍藏8 周的未氘代樣品的拉曼強(qiáng)度是0.001 2 cps,氘代7 h后拉曼強(qiáng)度增加到0.011cps;而相應(yīng)的-40 ℃條件下樣品氘代后拉曼強(qiáng)度從0.001 1 cps增加到0.007 cps。表明凍藏溫度越低,樣品氘代后的重水峰變化越集中,規(guī)律越明顯,而溫度升高(-18 ℃),樣品的氘代變化曲線比較分散,變化趨勢不集中。這可能與蛋白質(zhì)變性密切關(guān)系,如前所述,凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在-18 ℃的變性程度要高于-40 ℃,二級結(jié)構(gòu)的展開程度也更明顯,轉(zhuǎn)角的含量和表面疏水性也高于-40 ℃凍藏同時間的樣品。在蛋白質(zhì)變性過程中,穩(wěn)定結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮⒔Y(jié)構(gòu)即由α-螺旋形成了β-折疊和轉(zhuǎn)角,形成的β-折疊又進(jìn)一步解散成轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,導(dǎo)致原有氫鍵網(wǎng)絡(luò)的破壞和疏水面的增加,原來與蛋白質(zhì)密切結(jié)合的表層甚至內(nèi)部維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的水分子被暴露出來,同時蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的NH也暴露出來,從而提供了更多可與重水置換的氫原子,產(chǎn)生較高的氘代,隨著置換進(jìn)行可置換氫不斷減少直至置換飽和,峰強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。結(jié)果顯示凍藏溫度越低,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越規(guī)整,其可置換的氫原子越少,原有水分子與蛋白質(zhì)相互作用未被破壞,也可以理解為表層結(jié)合水分子的保留有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

    2.4凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)的氘代動力學(xué)

    圖4 -18 ℃(a)和-40 ℃(b)條件下凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)未氘代分?jǐn)?shù)變化Fig.4 Kinetics of H/D exchange for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃

    由圖4可知,置換前3 h的數(shù)據(jù)顯示,隨凍藏時間延長,未氘代分?jǐn)?shù)顯著下降,即氘代分?jǐn)?shù)顯著增加,且未氘代分?jǐn)?shù)的降低與凍藏時間呈正相關(guān)。這可能與蛋白質(zhì)在凍藏過程中二級結(jié)構(gòu)含量的變化密切有關(guān),-18 ℃條件下凍藏4 周的蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,β-轉(zhuǎn)角和β-折疊結(jié)構(gòu)含量增多,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散,暴露出充足的可氘代的氫,所以氘代程度隨凍藏時間延長而增加,未氘代分?jǐn)?shù)降低。而置換3 h之后未氘代分?jǐn)?shù)變化不明顯,甚至變性程度高的樣品未氘代分?jǐn)?shù)反而會增加,分析可能的原因有:1)-18 ℃條件下,凍藏時間越長,α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量變化越大,蛋白質(zhì)的變性程度越劇烈,疏水作用增強(qiáng),重水置換難度增加,導(dǎo)致凍藏第4、8周的未氘代分?jǐn)?shù)值上升;同理,-40 ℃條件下,凍藏時間延長,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化及疏水作用共同影響蛋白質(zhì)的氫/氘交換作用,使得凍藏第8周的蛋白質(zhì)未氘代分?jǐn)?shù)值上升。2)隨著置換時間的延長,使疏水作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)繼續(xù)變性,疏水作用能力大于氫/氘交換作用力,阻止了氫/氘的交換作用,導(dǎo)致未氘代分?jǐn)?shù)值增大[23]。3)凍藏時間延長,蛋白質(zhì)聚集增大,導(dǎo)致氫/氘交換作用中表面溶劑接觸面積減小,也會影響未氘代分?jǐn)?shù)值的變化。

    表3 -18 ℃和-40 ℃條件下的凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)氘代速率(k值)Table3 Changes in H/D exchange ratio for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃

    在置換的前3 h內(nèi),O—H/C—H的面積比隨置換時間的延長,呈線性減小的趨勢,且在不同凍藏時間條件下,氘代動力學(xué)的變化趨勢相同,但氘代程度不同。以擬合直線的斜率為氘代速率,表示為k值。由表3可知,氘代速率k值隨著凍藏時間的延長而不斷增大,且凍藏溫度越高,k值越大,說明隨蛋白質(zhì)變性的進(jìn)行,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水的相互作用逐漸減弱,反之可理解為隨水分子的丟失和轉(zhuǎn)移促進(jìn)了蛋白的變性。凍藏2 周后,-40 ℃條件下的氘代速率為0.108 6,而-18 ℃凍藏溫度條件下的氘代速率為0.139 3,分別比未凍藏的蛋白質(zhì)分子的氘代速率增加0.009 6和0.040 3。凍藏過的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,蛋白質(zhì)與水分子的作用減弱,導(dǎo)致同一置換時間可氘代氫的數(shù)量多于未凍藏的新鮮樣品,因此氘代速率大。在-40 ℃條件下凍藏與-18 ℃相比,具有相對穩(wěn)定的蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水相互作用保持較強(qiáng)的狀態(tài),表層水分子較穩(wěn)定,所以可被氘代氫的數(shù)目較少,故氘代速率相對較低。氫/氘同位素交換初期,氘代主要發(fā)生在與蛋白質(zhì)表層水分子中的O—H鍵,隨著氘代的進(jìn)行,氘代可與蛋白質(zhì)中的酰胺鍵的N—H甚至內(nèi)部的水分子發(fā)生置換。在不同凍藏溫度條件下,氘代速率k值變化可能是凍藏過程中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少速率不同即肽鏈展開程度不同引起的。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)展開程度的不同造就了氫原子的暴露出現(xiàn)差異,因此蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的變化和氘代速率的差異密切相關(guān),且凍藏溫度是引起差異的根本原因。此外,氘代動力學(xué)的快慢可能與蛋白質(zhì)中水的氫鍵強(qiáng)度相關(guān),氫鍵強(qiáng)度越高,動力學(xué)越慢,因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高,氘代速率越低。這與Ignacio等[14]研究具有相似性的結(jié)論,-40 ℃條件下的凍藏蛋白質(zhì)與結(jié)合水的氫鍵更穩(wěn)定,所以氘代動力學(xué)較慢。

    結(jié)果顯示,在不同的凍藏溫度條件下,蛋白質(zhì)發(fā)生變性的速率不同造成了二級結(jié)構(gòu)的展開存在差異,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水的相互作用隨展開程度提高而減弱,蛋白質(zhì)表層的結(jié)合水暴露程度也存在區(qū)別。可置換氫增加表明蛋白質(zhì)與水分子相互作用的減弱,也意味著水分流失增加,最終導(dǎo)致鮮嫩的對蝦制品經(jīng)凍藏后品質(zhì)變差,且凍藏溫度越高,品質(zhì)變化越大,而凍藏溫度越低,越有利于保持蛋白質(zhì)天然特性。

    3 結(jié) 論

    在-18 ℃和-40 ℃凍藏溫度條件下,凡納濱對蝦蛋白質(zhì)均發(fā)生變性,蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)由緊密向松散發(fā)展,肽鏈逐漸展開,且凍藏溫度越高,結(jié)構(gòu)松散性越明顯。蛋白質(zhì)的未氘代分?jǐn)?shù)隨凍藏時間延長顯著下降,即氘代分?jǐn)?shù)顯著增加,在一定凍藏時間內(nèi),未氘代分?jǐn)?shù)與凍藏時間存在正相關(guān)性。伴隨蛋白質(zhì)的展開而結(jié)構(gòu)趨于松散,疏水性增加,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水相互作用減弱,且凍藏溫度越高,這種相互作用越弱,意味著蛋白質(zhì)周圍的水分越容易流失;而凍藏溫度越低,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水相互作用越強(qiáng),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高,蛋白質(zhì)變性速率越慢,越有利于保持蛋白質(zhì)天然品質(zhì)。

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    Protein and Water Structural Changes in Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei) during Frozen Storage as Revealed by Raman Spectroscopy

    YUAN Li, JI Xiu, SHI Tong, WANG Yanmin, GAO Ruichang*
    (School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

    The mechanism of protein denaturation during frozen storage can be revealed by the interaction between muscle protein and water. In this study, the effect of storage temperature on protein denaturation in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) muscle was examined in terms of protein structure and surface water molecules. The secondary structure and deuteration kinetics of whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃ were analyzed by Raman spectroscopy and H/D exchange method. The results showed that the secondary structure of protein molecules changed from tight to loose,suggesting protein unfolding. Furthermore, the structure of protein stored at -18 ℃ was more loose than at -40 ℃. With the unfolding of the protein secondary structure, the surface hydrophobicity of the protein increased, while the interaction between protein and bound water was weakened. The higher the storage temperature was, the more intensely the interaction was weakened, the less stable protein structure was and the more easily moisture loss occurred. In contrast, the lower the frozen temperature was, the stronger the interaction between protein and water was. Consequently, protein structure was more stable. The results showed that lower frozen storage temperature was more effective to maintain protein properties.

    whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei); protein secondary structure; water; frozeng storage;Raman spectroscopy; deuterium

    10.7506/spkx1002-6630-201618033

    S966

    A

    1002-6630(2016)18-0202-06

    袁麗, 紀(jì)秀, 石彤, 等. 拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質(zhì)與水分結(jié)構(gòu)變化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(18): 202-207. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618033. http://www.spkx.net.cn

    YUAN Li, JI Xiu, SHI Tong, et al. Protein and water structural changes in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) during frozen storage as revealed by raman spectroscopy[J]. Food Science, 2016, 37(18): 202-207. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618033. http://www.spkx.net.cn

    2016-03-17

    國家自然科學(xué)基金面上項目(31471611;31671882);江蘇大學(xué)“青年骨干教師培養(yǎng)工程”項目

    袁麗(1978—),女,副教授,碩士,研究方向為食品加工與營養(yǎng)。E-mail:yuanli24@163.com

    高瑞昌(1976—),男,教授,博士,研究方向為水產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail:xiyuan2008@ujs.edu.cn

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