• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質(zhì)與水分結(jié)構(gòu)變化

    2016-10-18 06:03:34王艷敏高瑞昌
    食品科學(xué) 2016年18期
    關(guān)鍵詞:凡納濱曼光譜拉曼

    袁 麗,紀(jì) 秀,石 彤,王艷敏,高瑞昌*

    (江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質(zhì)與水分結(jié)構(gòu)變化

    袁麗,紀(jì)秀,石彤,王艷敏,高瑞昌*

    (江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    探明凍藏過程中凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)與水分的結(jié)構(gòu)變化有助于揭示蛋白質(zhì)冷凍變性機(jī)理,采用拉曼光譜技術(shù)對凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在不同凍藏溫度條件下的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并結(jié)合重水置換技術(shù)表征肌肉蛋白質(zhì)的氘代動力學(xué),從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表層水分子角度研究凍藏溫度對蛋白質(zhì)冷凍變性的影響。結(jié)果表明:凍藏過程中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)由規(guī)整轉(zhuǎn)向松散,肽鏈展開,且-18 ℃凍藏的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散性比-40 ℃顯著;伴隨蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開,表面疏水性增加,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水的相互作用減弱,且凍藏溫度越高,相互作用減弱越劇烈,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也越不穩(wěn)定,水分越容易流失;而凍藏溫度越低,蛋白質(zhì)與水分的相互作用越強(qiáng),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,越有利于保持對蝦原有品質(zhì)。

    凡納濱對蝦;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);水;凍藏;拉曼光譜;重水置換

    我國有一半以上的加工水產(chǎn)品為冷凍產(chǎn)品,大量水產(chǎn)品得以順利走入市場依賴于冷凍保藏技術(shù)的發(fā)展[1]。凡納濱對蝦肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富,是深受人們喜愛的水產(chǎn)品之一。凍藏是凡納濱對蝦貯藏與加工的必要手段,然而在冷藏或凍藏過程中,肌肉蛋白質(zhì)容易發(fā)生冷凍變性,造成食用品質(zhì)下降,影響產(chǎn)品質(zhì)量[2]。實質(zhì)上,蛋白質(zhì)的變性是指在某些物理化學(xué)作用下,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,分子內(nèi)部構(gòu)象出現(xiàn)變化,生物活性也隨之變化。水產(chǎn)品動物蛋白質(zhì)在特定因素的作用下(如凍藏),分子結(jié)構(gòu)從有序結(jié)構(gòu)可以轉(zhuǎn)變成無序結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)不同的構(gòu)象,同時分子的功能特性減弱或消失,最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降[3]。目前對于水產(chǎn)品冷凍變性的評價指標(biāo)主要依賴Ca-ATPase活性、蛋白溶解度等蛋白質(zhì)生化特性[4-8],而從冷凍水產(chǎn)品蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)變化的角度研究較少。

    拉曼光譜技術(shù)被證實是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的一個重要手段,具有快速、無損、不受水溶液影響的特性[9-11]。最近有研究[12]表明,拉曼光譜還可以用于研究蛋白質(zhì)和水的相互作用、水變化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,O—H鍵的伸縮振動是研究水和蛋白質(zhì)的相互作用的主要依據(jù)。氫/氘交換技術(shù)主要運(yùn)用于核磁共振波譜法對蛋白質(zhì)的研究中,利用氘代后質(zhì)量的不同區(qū)分氫原子的化學(xué)位移變化[13],也被用來研究蛋白質(zhì)構(gòu)象二、三級結(jié)構(gòu)及分子活動性[14-16]。本研究采用拉曼光譜技術(shù)對冷凍對蝦的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析,結(jié)合重水置換技術(shù),分析重水峰峰強(qiáng)變化、O—H/C—H的峰面積比和特征譜帶的相對強(qiáng)度變化,表征蛋白質(zhì)冷凍變性過程中蛋白質(zhì)與水分子的相互作用強(qiáng)弱,闡述凍藏溫度對凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響,從蛋白與水結(jié)構(gòu)變化角度闡釋蛋白質(zhì)冷凍變性機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    新鮮凡納濱對蝦 歐尚超市。

    重水(純度99%) 美國Sigma公司;其他化學(xué)試劑(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2儀器與設(shè)備

    VERTEX 70傅里葉變換拉曼光譜 德國Bruker公司;透析管(3 500~5 000 D) 美國Spectrum公司。

    1.3方法

    1.3.1樣品預(yù)處理

    取新鮮對蝦和不同凍藏條件下的對蝦樣品,去頭尾,去皮,切成肉糜狀后置于4 ℃條件下備用,用于重水交換和拉曼光譜的測定。

    1.3.2拉曼光譜測定

    參考Sánchez-gonzález等[14]的方法進(jìn)行氫/氘同位素交換,將對蝦肉糜置于透析管中,再放置在D2O中進(jìn)行交換,15 ℃分別處理0、1、3、5、7 h。用傅里葉拉曼光譜儀進(jìn)行掃描,激光器波長為1 064 nm,分辨率為4.0 cm—1,激光功率為300 mW,保持15~20 ℃恒溫,累計掃描2 000 次,每個樣品掃描2 遍,用OPUS軟件記錄下位移范圍在400~4 000 cm—1的拉曼光譜。

    1.3.3凡納濱對蝦肌動球蛋白表面疏水性的測定

    1.3.3.1凡納濱對蝦肌動球蛋白的提取

    取2 個凍藏溫度不同凍藏時間的凡納濱對蝦,去頭尾、去皮、肌肉組織勻漿,隨后加入4 倍體積的磷酸緩沖液(pH 7.0),3 000 r/min離心10 min,傾去上清液,再加入磷酸緩沖液進(jìn)行離心,重復(fù)3 次。將去除雜質(zhì)的肌肉蛋白加入3 倍體積的磷酸鹽緩沖液,靜置過夜,再經(jīng)8 000 r/min離心15 min,然后將上清液用2 層紗布過濾,濾液緩慢倒入10 倍體積冷卻蒸餾水中,用15%醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5~6.6,隨后再靜置4~5 h,經(jīng)6 000 r/min離心10 min得到沉淀,然后再用0.6 mol/L KCl溶液溶解沉淀,放入0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate緩沖液中透析一夜。將透析后的溶液10 000 r/min離心1 h,取上清液緩慢倒入10 倍體積的冷卻蒸餾水中,再次稀釋沉淀,即得到精提的肌動球蛋白樣品,所有操作均在低于4 ℃環(huán)境下進(jìn)行,制備的樣品置于冰上保存待用。

    1.3.3.2肌動球蛋白疏水性的測定

    參考Yongsawatdigul等[17]的方法,將上述蛋白質(zhì)樣品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液中,使肌動球蛋白質(zhì)量濃度(C)范圍落在0.05~10.8 mg/mL,取8 mmol/L的8-苯胺基萘-1-磺酸鹽40 μL,與4 mL樣品溶液置于黑暗處反應(yīng)10 min,用磷酸緩沖液做空白對照。設(shè)定熒光分光光度計的狹縫校正5 nm,激發(fā)波長為386 nm,發(fā)射波長為478 nm,測定相對熒光強(qiáng)度(R),由R與C的比值可得肌動球蛋白的疏水性。

    1.3.4氘代動力學(xué)分析

    氘代動力學(xué)表征為凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在重水置換的動態(tài)過程中,重水中的OD與蛋白質(zhì)和水分子中的CH、OH相互置換的強(qiáng)弱能夠反映蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用的變化情況。計算方法定義為未置換的對蝦蛋白質(zhì)樣品中拉曼光譜中的O—H/C—H的面積比值為1,以置換時間為橫坐標(biāo),O—H/C—H面積比的變化情況為縱坐標(biāo)做散點圖并擬合得到不同凍藏溫度條件下的氘代動力學(xué)變化圖[14]。

    1.4譜圖處理

    將得到的拉曼圖譜在OMNIC軟件上進(jìn)行平滑和基線校正處理,在Peakfit軟件上進(jìn)行去卷積和求二階導(dǎo)數(shù),以利于區(qū)別重疊子峰,用曲線擬合處理,得到圖譜的峰強(qiáng)和峰面積,用Orign 8.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白二級結(jié)構(gòu)變化

    拉曼波譜主要來源于蛋白質(zhì)分子中的C—N鍵和C=O鍵的伸縮振動,拉曼圖譜中1 655 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶的變化與蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的各種二級結(jié)構(gòu)含量變化密切相關(guān)[11,18]。但是實驗中由于表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的多個振動吸收峰易重疊在一起,拉曼光譜圖譜中容易出現(xiàn)寬峰,因此常運(yùn)用去卷積和曲線擬合的方法來區(qū)分不同的重疊譜帶,得到單個譜帶的信息。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指在肽鏈中部分肽段的骨架所形成的結(jié)構(gòu),它主要包含α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲結(jié)構(gòu)和環(huán)形等不同的類型[19],其中α-螺旋結(jié)構(gòu)表征蛋白質(zhì)分子的規(guī)整性,β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)反映蛋白質(zhì)分子的松散性。

    表1 -18 ℃凍藏條件下的凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量變化Table1 Changes in secondary structure contents of whiteleg shrimp muscle protein frozen at -18 ℃%

    表2 -40 ℃凍藏條件下的凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量變化Table2 Changes in secondary structure contents of whiteleg shrimp muscle protein frozen at-40 ℃%

    從表1、2可以看出,肌肉蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量在-18 ℃和-40 ℃凍藏溫度條件下均隨凍藏時間的延長呈下降趨勢,分別下降35.76% 和27.23%。而肌肉蛋白質(zhì)的β-折疊和轉(zhuǎn)角含量在-18 ℃和-40 ℃凍藏條件下整體上呈上升趨勢,同一凍藏時間內(nèi)兩種凍藏樣品間的β-折疊含量差異不明顯,但是轉(zhuǎn)角則表現(xiàn)為凍藏溫度越高其含量隨貯藏時間延長上升越大??娝傻龋?0]研究了凍藏過程中的扇貝的質(zhì)量變化,結(jié)果表明凍藏溫度不同能造成蛋白質(zhì)的變性程度的不同,在-25 ℃凍藏溫度條件下扇貝蛋白質(zhì)的變性速度顯著低于-18 ℃凍藏溫度條件下的扇貝。Herrera等[21]也報道在-10 ℃和-30 ℃兩個凍藏溫度條件下魚肉蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)均會發(fā)生變化,但-10 ℃的結(jié)構(gòu)變化更加明顯。結(jié)果顯示,在2 個凍藏溫度條件下,凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)隨著凍藏時間的延長發(fā)生了較大變化,其中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量減少,β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量增加,可能發(fā)生了α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。如前所述,蛋白質(zhì)分子的α-螺旋結(jié)構(gòu)的降低和β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的升高意味著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化,并且與凍藏溫度存在相關(guān)性,溫度越高,結(jié)構(gòu)松散性越明顯。

    2.2凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)表面疏水性的變化

    圖1 凍藏期間對蝦肌動球蛋白表面疏水性變化Fig.1 Changes in surface hydrophobicity of shrimp myosin during frozen storage

    由于表面疏水性測定要求蛋白純化程度較高,所以實驗中通過提取對蝦肌肉蛋白質(zhì)主體部分肌動球蛋白進(jìn)行測定,以表征肌肉蛋白質(zhì)的表面疏水性變化趨勢。由圖1可知,隨凍藏時間的延長,肌動球蛋白的表面疏水性總體呈上升趨勢,且凍藏溫度越高,表面疏水性越高。在凍藏前4 周,對蝦肌動球蛋白的表面疏水性均增加顯著,-18 ℃和-40 ℃條件下的樣品增加幅度分別為75%

    和74%。之后的4~12 周,-18 ℃條件下凍藏樣品的表面疏水性仍有較大幅度上升,而-40 ℃條件下凍藏樣品的表面疏水性上升幅度趨于平緩。蛋白質(zhì)的表面疏水性是由蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對含量決定的,對于某些蛋白質(zhì),表面疏水性的增加反映了蛋白質(zhì)的變性程度的增加。低溫凍藏過程中,蝦肉蛋白質(zhì)表面疏水性的增加歸因于蛋白質(zhì)的去折疊和或伸展導(dǎo)致疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露,是表征蛋白質(zhì)變性的重要指標(biāo)之一。結(jié)果與前面所述的凡納濱對蝦蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變規(guī)律一致,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由規(guī)整轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮ⅰ?/p>

    2.3凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)氘代后的重水峰強(qiáng)度變化

    圖2 肌肉蛋白質(zhì)氘代前后的拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of shrimp muscle protein before and after H/D exchange

    利用拉曼光譜法和同位素氫/氘置換技術(shù)測定凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在不同凍藏溫度條件下其分子內(nèi)及表面的氫和重水中的氘相互置換的程度變化規(guī)律,探索蛋白質(zhì)表面水分子在冷凍變性過程中的變化規(guī)律。如圖2所示,2 500 cm-1附近的拉曼譜帶表征O—D鍵的伸縮振動,此波帶附近的拉曼強(qiáng)度值的變化可表征蝦肉蛋白質(zhì)的重水置換程度,強(qiáng)度越高代表重水置換程度越高,即蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和表層可置換的氫原子越多。因此實驗利用此峰的強(qiáng)度變化來表征蛋白質(zhì)與水分子的相互作用強(qiáng)弱變化,同時也可表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。Khoshtariya等[22]用光譜研究水合牛血清蛋白質(zhì)的高度可極化水-水氫鍵和界面滲透網(wǎng)絡(luò)時表明,位于3 260、2 840 cm—1處有非常寬的OH亞鍵,OD鍵相應(yīng)的處于2 350、2 050 cm—1,被指這些鍵是水分子的伸縮振動,包括水-水氫鍵和蛋白質(zhì)-水相互作用。

    圖3 -18 ℃(a)和-40 ℃(b)條件下對蝦肌肉蛋白質(zhì)重水置換的拉曼圖譜重水峰強(qiáng)度變化Fig.3 Raman intensity of H/D isotopic exchange for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 ℃ and -40 ℃

    圖3為-18 ℃和-40 ℃凍藏條件下不同凍藏時間的O—D鍵的拉曼強(qiáng)度值變化,表征凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)氘代程度變化。結(jié)果顯示,無論是新鮮還是凍藏后的樣品,2 500 cm—1附近的拉曼譜帶強(qiáng)度都隨置換時間延長而增加,并且實驗過程中發(fā)現(xiàn),拉曼強(qiáng)度在置換7 h后趨于穩(wěn)定,特別是-40 ℃條件下的樣品更明顯。-18 ℃條件下凍藏8 周的未氘代樣品的拉曼強(qiáng)度是0.001 2 cps,氘代7 h后拉曼強(qiáng)度增加到0.011cps;而相應(yīng)的-40 ℃條件下樣品氘代后拉曼強(qiáng)度從0.001 1 cps增加到0.007 cps。表明凍藏溫度越低,樣品氘代后的重水峰變化越集中,規(guī)律越明顯,而溫度升高(-18 ℃),樣品的氘代變化曲線比較分散,變化趨勢不集中。這可能與蛋白質(zhì)變性密切關(guān)系,如前所述,凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)在-18 ℃的變性程度要高于-40 ℃,二級結(jié)構(gòu)的展開程度也更明顯,轉(zhuǎn)角的含量和表面疏水性也高于-40 ℃凍藏同時間的樣品。在蛋白質(zhì)變性過程中,穩(wěn)定結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮⒔Y(jié)構(gòu)即由α-螺旋形成了β-折疊和轉(zhuǎn)角,形成的β-折疊又進(jìn)一步解散成轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,導(dǎo)致原有氫鍵網(wǎng)絡(luò)的破壞和疏水面的增加,原來與蛋白質(zhì)密切結(jié)合的表層甚至內(nèi)部維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的水分子被暴露出來,同時蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的NH也暴露出來,從而提供了更多可與重水置換的氫原子,產(chǎn)生較高的氘代,隨著置換進(jìn)行可置換氫不斷減少直至置換飽和,峰強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。結(jié)果顯示凍藏溫度越低,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越規(guī)整,其可置換的氫原子越少,原有水分子與蛋白質(zhì)相互作用未被破壞,也可以理解為表層結(jié)合水分子的保留有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

    2.4凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)的氘代動力學(xué)

    圖4 -18 ℃(a)和-40 ℃(b)條件下凍藏凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)未氘代分?jǐn)?shù)變化Fig.4 Kinetics of H/D exchange for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃

    由圖4可知,置換前3 h的數(shù)據(jù)顯示,隨凍藏時間延長,未氘代分?jǐn)?shù)顯著下降,即氘代分?jǐn)?shù)顯著增加,且未氘代分?jǐn)?shù)的降低與凍藏時間呈正相關(guān)。這可能與蛋白質(zhì)在凍藏過程中二級結(jié)構(gòu)含量的變化密切有關(guān),-18 ℃條件下凍藏4 周的蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,β-轉(zhuǎn)角和β-折疊結(jié)構(gòu)含量增多,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散,暴露出充足的可氘代的氫,所以氘代程度隨凍藏時間延長而增加,未氘代分?jǐn)?shù)降低。而置換3 h之后未氘代分?jǐn)?shù)變化不明顯,甚至變性程度高的樣品未氘代分?jǐn)?shù)反而會增加,分析可能的原因有:1)-18 ℃條件下,凍藏時間越長,α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量變化越大,蛋白質(zhì)的變性程度越劇烈,疏水作用增強(qiáng),重水置換難度增加,導(dǎo)致凍藏第4、8周的未氘代分?jǐn)?shù)值上升;同理,-40 ℃條件下,凍藏時間延長,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化及疏水作用共同影響蛋白質(zhì)的氫/氘交換作用,使得凍藏第8周的蛋白質(zhì)未氘代分?jǐn)?shù)值上升。2)隨著置換時間的延長,使疏水作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)繼續(xù)變性,疏水作用能力大于氫/氘交換作用力,阻止了氫/氘的交換作用,導(dǎo)致未氘代分?jǐn)?shù)值增大[23]。3)凍藏時間延長,蛋白質(zhì)聚集增大,導(dǎo)致氫/氘交換作用中表面溶劑接觸面積減小,也會影響未氘代分?jǐn)?shù)值的變化。

    表3 -18 ℃和-40 ℃條件下的凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)氘代速率(k值)Table3 Changes in H/D exchange ratio for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃

    在置換的前3 h內(nèi),O—H/C—H的面積比隨置換時間的延長,呈線性減小的趨勢,且在不同凍藏時間條件下,氘代動力學(xué)的變化趨勢相同,但氘代程度不同。以擬合直線的斜率為氘代速率,表示為k值。由表3可知,氘代速率k值隨著凍藏時間的延長而不斷增大,且凍藏溫度越高,k值越大,說明隨蛋白質(zhì)變性的進(jìn)行,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水的相互作用逐漸減弱,反之可理解為隨水分子的丟失和轉(zhuǎn)移促進(jìn)了蛋白的變性。凍藏2 周后,-40 ℃條件下的氘代速率為0.108 6,而-18 ℃凍藏溫度條件下的氘代速率為0.139 3,分別比未凍藏的蛋白質(zhì)分子的氘代速率增加0.009 6和0.040 3。凍藏過的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,蛋白質(zhì)與水分子的作用減弱,導(dǎo)致同一置換時間可氘代氫的數(shù)量多于未凍藏的新鮮樣品,因此氘代速率大。在-40 ℃條件下凍藏與-18 ℃相比,具有相對穩(wěn)定的蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水相互作用保持較強(qiáng)的狀態(tài),表層水分子較穩(wěn)定,所以可被氘代氫的數(shù)目較少,故氘代速率相對較低。氫/氘同位素交換初期,氘代主要發(fā)生在與蛋白質(zhì)表層水分子中的O—H鍵,隨著氘代的進(jìn)行,氘代可與蛋白質(zhì)中的酰胺鍵的N—H甚至內(nèi)部的水分子發(fā)生置換。在不同凍藏溫度條件下,氘代速率k值變化可能是凍藏過程中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少速率不同即肽鏈展開程度不同引起的。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)展開程度的不同造就了氫原子的暴露出現(xiàn)差異,因此蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的變化和氘代速率的差異密切相關(guān),且凍藏溫度是引起差異的根本原因。此外,氘代動力學(xué)的快慢可能與蛋白質(zhì)中水的氫鍵強(qiáng)度相關(guān),氫鍵強(qiáng)度越高,動力學(xué)越慢,因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高,氘代速率越低。這與Ignacio等[14]研究具有相似性的結(jié)論,-40 ℃條件下的凍藏蛋白質(zhì)與結(jié)合水的氫鍵更穩(wěn)定,所以氘代動力學(xué)較慢。

    結(jié)果顯示,在不同的凍藏溫度條件下,蛋白質(zhì)發(fā)生變性的速率不同造成了二級結(jié)構(gòu)的展開存在差異,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水的相互作用隨展開程度提高而減弱,蛋白質(zhì)表層的結(jié)合水暴露程度也存在區(qū)別。可置換氫增加表明蛋白質(zhì)與水分子相互作用的減弱,也意味著水分流失增加,最終導(dǎo)致鮮嫩的對蝦制品經(jīng)凍藏后品質(zhì)變差,且凍藏溫度越高,品質(zhì)變化越大,而凍藏溫度越低,越有利于保持蛋白質(zhì)天然特性。

    3 結(jié) 論

    在-18 ℃和-40 ℃凍藏溫度條件下,凡納濱對蝦蛋白質(zhì)均發(fā)生變性,蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)由緊密向松散發(fā)展,肽鏈逐漸展開,且凍藏溫度越高,結(jié)構(gòu)松散性越明顯。蛋白質(zhì)的未氘代分?jǐn)?shù)隨凍藏時間延長顯著下降,即氘代分?jǐn)?shù)顯著增加,在一定凍藏時間內(nèi),未氘代分?jǐn)?shù)與凍藏時間存在正相關(guān)性。伴隨蛋白質(zhì)的展開而結(jié)構(gòu)趨于松散,疏水性增加,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水相互作用減弱,且凍藏溫度越高,這種相互作用越弱,意味著蛋白質(zhì)周圍的水分越容易流失;而凍藏溫度越低,蛋白質(zhì)與表層結(jié)合水相互作用越強(qiáng),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高,蛋白質(zhì)變性速率越慢,越有利于保持蛋白質(zhì)天然品質(zhì)。

    [1] 關(guān)志強(qiáng), 宋小勇, 李敏, 等. 抗凍技術(shù)在改善冷凍水產(chǎn)品品質(zhì)中的應(yīng)用研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(2): 54-57. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2006.02.017.

    [2] 蘇永玲, 謝晶. 南美白對蝦冷凍保鮮研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011, 39(4): 2286-2288. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2011.04.142.

    [3] 孫璐. 基于拉曼光譜技術(shù)的南美白對蝦蛋白變溫特性研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2013: 61-63.

    [4] SOOTTAWAT B, WONNOP V, CHUTIMA T, et al. Comparative study on physicochemical changes of muscle proteins from some tropical fish during frozen storage[J]. Food Research International,2003, 36(8): 787-795. DOI:10.1016/S0963-9969(03)00073-5.

    [5] 曾名勇, 黃海, 李八方. 鳙肌肉蛋白質(zhì)生化特性在凍藏過程中的變化[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2003, 27(5): 480-485.

    [6] SYCH J, LACROIX C, CARRIER M. Determination of optimal level of lactitol for surimi[J]. Journal of Food Science, 1991, 56(2): 285-290.

    [7] SOOTTAWAT B, NUNTAPOL S. Muscle changes in hard and soft shell crabs during frozen storage[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 42(3): 723-729. DOI:10.1016/j.lwt.2008.10.003.

    [8] RAMIAREZ J A, MARTIAN-POLO M O, BANDMAN E. Fish myosin aggregation as affected by freezing and initial physical state[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(4): 556-560. DOI:10.1111/j.1365-2621.2000.tb16047.x.

    [9] 孫璐. 拉曼光譜技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用[J]. 中國食品學(xué)報, 2012,12(12): 113-118.

    [10] 許以明. 拉曼光譜及其在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 4-7.

    [11] LI-CHAN E C Y. The applications of Raman spectroscopy in food science[J]. Trends in Food Science and Technology, 1996, 7(11): 361-370. DOI:10.1016/S0924-2244(96)10037-6.

    [12] HERRERO A M, CARMONA P, GARCíA M L, et al. Ultrastructural changes and structure and mobility of myowater in frozen-stored hake(Merluccius merluccius L.) muscle: relationship with functionality and texture[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(7): 2558-2566. DOI:10.1021/jf0490706.

    [13] 翟翠萍, 劉學(xué)軍, 趙揚(yáng), 等. 用核磁共振技術(shù)研究[C4mim][BF4]在重水和氘代氯仿中的聚集行為[J]. 物理化學(xué)學(xué)報, 2009, 25(6): 1185-1189.

    [14] SáNCHEZ-GONZáLEZ I, CARMONA P, MORENO P, et al. Protein and water structural changes in fish surimi during gelation as revealed by isotopic H/D exchange and Raman spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2008, 106(1): 56-64. DOI:10.1016/ j.foodchem.2007.05.067.

    [15] 汪世龍. 蛋白質(zhì)化學(xué)[M]. 上海: 同濟(jì)大學(xué)出版社, 2012: 359-361.

    [16] 章正廉, 楊景文, 鈕擇玲, 等. 水合溶菌酶的H-D交換與分子活動性[J].生物物理學(xué)報, 1986(4): 91-96.

    [17] YONGSAWATDIGUL J, PARK J W. Thermal denaturation and aggregation of threadfin bream actomyosin[J]. Food Chemistry, 2003,83(3): 409-416. DOI:10.1016/S0308-8146(03)00105-5.

    [18] 陳倩, 李沛軍, 孔保華. 拉曼光譜技術(shù)在肉品科學(xué)研究中的應(yīng)用[J].食品科學(xué), 2012, 33(15): 307-313.

    [19] 閆隆飛, 孫之榮. 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 1999: 20-40.

    [20] 繆松, 馮志哲, 彭智學(xué). 凍藏溫度對凍結(jié)扇貝質(zhì)量變化和實用貯藏期的影響[J]. 制冷, 2001, 20(4): 10-15.

    [21] HERRERA J R, MACKIE I M. Cryoprotection of frozen-stored actomyosin of farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by some sugars and polyols[J]. Food Chemistry, 2004, 84(1): 91-97. DOI:10.1016/S0308-8146(03)00178-X.

    [22] KHOSHTARIYA D E, HANSEN E, LEECHAROEN R, et al. Probing protein hydration by the difference OH (OD) vibrational spectroscopy: interfacial percolation network involving highly polarizable waterwater hydrogen bonds[J]. Journal of Molecular Liquids, 2003, 105(1): 13-36. DOI:10.1016/S0167-7322(03)00009-6.

    [23] PARKER M J, CLARKE A R. Amide backbone and water-related H/D isotope effects on the dynamics of a protein folding reaction[J]. Biochemistry, 1997, 36(19): 5786-5794. DOI:10.1021/bi9629283.

    Protein and Water Structural Changes in Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei) during Frozen Storage as Revealed by Raman Spectroscopy

    YUAN Li, JI Xiu, SHI Tong, WANG Yanmin, GAO Ruichang*
    (School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

    The mechanism of protein denaturation during frozen storage can be revealed by the interaction between muscle protein and water. In this study, the effect of storage temperature on protein denaturation in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) muscle was examined in terms of protein structure and surface water molecules. The secondary structure and deuteration kinetics of whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃ were analyzed by Raman spectroscopy and H/D exchange method. The results showed that the secondary structure of protein molecules changed from tight to loose,suggesting protein unfolding. Furthermore, the structure of protein stored at -18 ℃ was more loose than at -40 ℃. With the unfolding of the protein secondary structure, the surface hydrophobicity of the protein increased, while the interaction between protein and bound water was weakened. The higher the storage temperature was, the more intensely the interaction was weakened, the less stable protein structure was and the more easily moisture loss occurred. In contrast, the lower the frozen temperature was, the stronger the interaction between protein and water was. Consequently, protein structure was more stable. The results showed that lower frozen storage temperature was more effective to maintain protein properties.

    whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei); protein secondary structure; water; frozeng storage;Raman spectroscopy; deuterium

    10.7506/spkx1002-6630-201618033

    S966

    A

    1002-6630(2016)18-0202-06

    袁麗, 紀(jì)秀, 石彤, 等. 拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質(zhì)與水分結(jié)構(gòu)變化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(18): 202-207. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618033. http://www.spkx.net.cn

    YUAN Li, JI Xiu, SHI Tong, et al. Protein and water structural changes in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) during frozen storage as revealed by raman spectroscopy[J]. Food Science, 2016, 37(18): 202-207. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618033. http://www.spkx.net.cn

    2016-03-17

    國家自然科學(xué)基金面上項目(31471611;31671882);江蘇大學(xué)“青年骨干教師培養(yǎng)工程”項目

    袁麗(1978—),女,副教授,碩士,研究方向為食品加工與營養(yǎng)。E-mail:yuanli24@163.com

    高瑞昌(1976—),男,教授,博士,研究方向為水產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail:xiyuan2008@ujs.edu.cn

    猜你喜歡
    凡納濱曼光譜拉曼
    賊都找不到的地方
    凡納濱對蝦白斑綜合征病毒防治研究進(jìn)展(一)
    基于單光子探測技術(shù)的拉曼光譜測量
    電子測試(2018年18期)2018-11-14 02:30:36
    基于相干反斯托克斯拉曼散射的二維溫度場掃描測量
    凡納濱對蝦與點帶石斑魚的混養(yǎng)模式
    凡納濱對蝦CTSL基因與生長相關(guān)的SNP位點的特征
    三聚氰胺在凡納濱對蝦中的殘留消除規(guī)律研究
    BMSCs分化為NCs的拉曼光譜研究
    便攜式薄層色譜-拉曼光譜聯(lián)用儀重大專項獲批
    苯的激光拉曼光譜研究
    物理與工程(2013年1期)2013-03-11 16:03:39
    久久这里只有精品中国| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲成人久久爱视频| 久久人人爽人人片av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av在线亚洲专区| 国产久久久一区二区三区| 国产人妻一区二区三区在| 午夜老司机福利剧场| 欧美色视频一区免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美bdsm另类| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲无线在线观看| 九九热线精品视视频播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 69人妻影院| 插阴视频在线观看视频| 51国产日韩欧美| 偷拍熟女少妇极品色| 久久精品综合一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 99久久精品国产国产毛片| 久久人人爽人人片av| 免费看av在线观看网站| 亚洲成人久久爱视频| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 极品教师在线视频| 亚洲人成网站在线播| 又爽又黄a免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩高清综合在线| 老女人水多毛片| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产成人aa在线观看| 一本久久精品| 久久久色成人| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一本久久精品| 简卡轻食公司| 亚洲成a人片在线一区二区| 两个人视频免费观看高清| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲四区av| 中出人妻视频一区二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 色视频www国产| 国产伦理片在线播放av一区 | 日本欧美国产在线视频| 黄色欧美视频在线观看| 1000部很黄的大片| 国产成人福利小说| 国产人妻一区二区三区在| 青春草视频在线免费观看| av在线蜜桃| 哪里可以看免费的av片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产av麻豆久久久久久久| 伦理电影大哥的女人| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产色婷婷99| 亚洲,欧美,日韩| 国产熟女欧美一区二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 丰满的人妻完整版| 亚洲乱码一区二区免费版| eeuss影院久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 美女 人体艺术 gogo| 一级av片app| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲在久久综合| 亚洲欧美精品自产自拍| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲无线在线观看| 日韩av在线大香蕉| 99在线视频只有这里精品首页| 久久久久性生活片| 精品久久久久久成人av| 亚洲天堂国产精品一区在线| a级一级毛片免费在线观看| 色综合色国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 好男人视频免费观看在线| 国产日本99.免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 夜夜爽天天搞| 99在线视频只有这里精品首页| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 婷婷精品国产亚洲av| 两个人的视频大全免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩av在线大香蕉| 简卡轻食公司| 亚洲国产精品国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产老妇女一区| 久久99蜜桃精品久久| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩亚洲欧美综合| 中文字幕免费在线视频6| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲色图av天堂| 国产极品精品免费视频能看的| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲国产色片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲精品影视一区二区三区av| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久精品大字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久热精品热| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 天美传媒精品一区二区| 一本一本综合久久| 欧美高清性xxxxhd video| 看片在线看免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 少妇的逼好多水| 日韩欧美精品免费久久| 久久草成人影院| 国产精品野战在线观看| 岛国毛片在线播放| 2022亚洲国产成人精品| 波多野结衣高清作品| 午夜福利在线观看吧| 国产精品蜜桃在线观看 | 日韩欧美 国产精品| 少妇丰满av| 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻久久中文字幕网| 亚洲图色成人| 男女那种视频在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 91久久精品电影网| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲最大成人手机在线| 成年av动漫网址| 久久久久久久久久成人| 日韩精品青青久久久久久| 99热只有精品国产| 69人妻影院| 色视频www国产| 午夜免费男女啪啪视频观看| 身体一侧抽搐| 99久久精品热视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩亚洲欧美综合| av在线老鸭窝| 插逼视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 长腿黑丝高跟| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品伦人一区二区| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 我要搜黄色片| 桃色一区二区三区在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 简卡轻食公司| 联通29元200g的流量卡| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成年人精品一区二区| 免费搜索国产男女视频| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品不卡视频一区二区| 精品一区二区三区人妻视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品久久视频播放| 秋霞在线观看毛片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费av不卡在线播放| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品久久久久久久久免| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产熟女欧美一区二区| 我的女老师完整版在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 色尼玛亚洲综合影院| 久久亚洲国产成人精品v| 此物有八面人人有两片| 久久精品影院6| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲人成网站在线播| 成年版毛片免费区| 亚洲国产精品sss在线观看| 成人特级av手机在线观看| 久久久久网色| 看片在线看免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精品国产av成人精品| 国产 一区 欧美 日韩| 九九在线视频观看精品| 日日撸夜夜添| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久人妻av系列| 黄色日韩在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美成人a在线观看| 直男gayav资源| av.在线天堂| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 国产成人精品一,二区 | 禁无遮挡网站| 国产 一区 欧美 日韩| 国内精品美女久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 男人的好看免费观看在线视频| 国产乱人偷精品视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 69av精品久久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久中文看片网| 一本一本综合久久| 欧美潮喷喷水| 波多野结衣高清无吗| 丰满乱子伦码专区| 国产亚洲欧美98| 日韩欧美在线乱码| 久久精品人妻少妇| 国产黄a三级三级三级人| 性色avwww在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产高潮美女av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费看av在线观看网站| 一个人看的www免费观看视频| 26uuu在线亚洲综合色| 六月丁香七月| 久久人妻av系列| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品一区二区三区四区久久| 99久国产av精品国产电影| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲av一区综合| 成年av动漫网址| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 有码 亚洲区| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美+日韩+精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一本久久精品| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品久久久久久久久久久久久| 免费av不卡在线播放| 亚洲自偷自拍三级| 少妇人妻精品综合一区二区 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 舔av片在线| 老司机福利观看| 伦理电影大哥的女人| 日日撸夜夜添| 能在线免费观看的黄片| 国产伦在线观看视频一区| 欧美bdsm另类| 一级毛片我不卡| 99热这里只有是精品50| ponron亚洲| a级毛片免费高清观看在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品福利在线免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 高清在线视频一区二区三区 | 国产在线男女| 亚洲自拍偷在线| 天美传媒精品一区二区| 午夜久久久久精精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 一区二区三区免费毛片| 黄色欧美视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 大香蕉久久网| 久久国产乱子免费精品| 一级毛片我不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 乱人视频在线观看| 精品久久久久久成人av| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久网色| 搞女人的毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国内精品久久久久精免费| 日韩一本色道免费dvd| 一区二区三区四区激情视频 | 日韩精品有码人妻一区| 欧美色视频一区免费| 在线国产一区二区在线| 久久国产乱子免费精品| 国内精品宾馆在线| 亚洲性久久影院| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一级av片app| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利高清视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 成人特级黄色片久久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 中文资源天堂在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 少妇的逼水好多| 九色成人免费人妻av| 久久久精品大字幕| 有码 亚洲区| 国产精品电影一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品三级大全| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产黄色小视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人毛片60女人毛片免费| 国产高清有码在线观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品国产av成人精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 美女 人体艺术 gogo| 岛国毛片在线播放| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲不卡免费看| 久久久午夜欧美精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美变态另类bdsm刘玥| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 在线观看午夜福利视频| 在线观看免费视频日本深夜| 好男人视频免费观看在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久国内精品自在自线图片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久九九热精品免费| 婷婷亚洲欧美| 丰满乱子伦码专区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美成人a在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 黄片wwwwww| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美区成人在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久午夜欧美精品| 久久国内精品自在自线图片| 搞女人的毛片| 精品午夜福利在线看| 国产精品蜜桃在线观看 | 少妇丰满av| 久久人人爽人人片av| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲五月天丁香| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 欧美成人精品欧美一级黄| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 69人妻影院| kizo精华| 国产精品三级大全| 亚洲人成网站在线播| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久国内精品自在自线图片| www.av在线官网国产| 中文字幕熟女人妻在线| 男女那种视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 少妇人妻精品综合一区二区 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 晚上一个人看的免费电影| 久久精品人妻少妇| 男人的好看免费观看在线视频| 伦精品一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产成人精品久久久久久| 中国美女看黄片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| ponron亚洲| 性插视频无遮挡在线免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 五月玫瑰六月丁香| 色尼玛亚洲综合影院| 黄片无遮挡物在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品女同一区二区软件| 精品久久久噜噜| 丰满的人妻完整版| 国产69精品久久久久777片| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 久久久久国产网址| 美女xxoo啪啪120秒动态图| av专区在线播放| 波多野结衣高清作品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩欧美精品v在线| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美日韩综合久久久久久| 69av精品久久久久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产综合懂色| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久精品94久久精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日日啪夜夜撸| 一本一本综合久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人午夜高清在线视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品午夜福利在线看| 丝袜喷水一区| 婷婷六月久久综合丁香| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 少妇高潮的动态图| 一级二级三级毛片免费看| 少妇的逼水好多| 一边亲一边摸免费视频| 中文在线观看免费www的网站| 91av网一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人一区二区视频在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 99在线视频只有这里精品首页| 欧美不卡视频在线免费观看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 真实男女啪啪啪动态图| 激情 狠狠 欧美| 99久久九九国产精品国产免费| 最后的刺客免费高清国语| 日本-黄色视频高清免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩三级伦理在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 哪个播放器可以免费观看大片| 热99re8久久精品国产| 欧美精品一区二区大全| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费看光身美女| 97在线视频观看| 精品久久久噜噜| 国产精品久久久久久精品电影| 成年免费大片在线观看| 亚洲成人久久性| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品乱码一区二三区的特点| 少妇的逼好多水| 十八禁国产超污无遮挡网站| 草草在线视频免费看| 欧美3d第一页| 22中文网久久字幕| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲综合色惰| 国产一级毛片在线| av天堂在线播放| 国产美女午夜福利| 精品熟女少妇av免费看| 日韩高清综合在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产精品一二三区在线看| 欧美又色又爽又黄视频| 免费在线观看成人毛片| 精品熟女少妇av免费看| 国产高清有码在线观看视频| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美精品专区久久| 日韩一区二区三区影片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲成人av在线免费| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 国产高清视频在线观看网站| 国产高清三级在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 午夜精品国产一区二区电影 | 久久久欧美国产精品| а√天堂www在线а√下载| 一个人看的www免费观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 我的老师免费观看完整版| 夜夜夜夜夜久久久久| av免费观看日本| 久久久a久久爽久久v久久| a级毛片a级免费在线| 婷婷精品国产亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| www日本黄色视频网| 老女人水多毛片| 成人漫画全彩无遮挡| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久午夜欧美精品| 九九爱精品视频在线观看| 国产av不卡久久| 搞女人的毛片| 日韩av在线大香蕉| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产真实乱freesex| 美女大奶头视频| 一本精品99久久精品77| 淫秽高清视频在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 久久九九热精品免费| 国产三级在线视频| 免费看日本二区| av免费在线看不卡| 成人一区二区视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲av一区综合| 国产精品人妻久久久久久| 久久久久久久午夜电影| 一级毛片我不卡| av黄色大香蕉| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品无人区乱码1区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产真实乱freesex| 身体一侧抽搐| 国产亚洲av嫩草精品影院| 夫妻性生交免费视频一级片| 春色校园在线视频观看| 中文字幕av成人在线电影| 国产单亲对白刺激| 黄片wwwwww| 男女那种视频在线观看| 一级毛片电影观看 | 久久人人爽人人片av| www日本黄色视频网| 老女人水多毛片| 久久久精品94久久精品| 亚洲欧美日韩东京热| 一本久久精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产一区二区在线观看日韩| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 丰满乱子伦码专区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲va在线va天堂va国产| 永久网站在线| 秋霞在线观看毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品永久免费网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 午夜福利在线在线| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 成年女人看的毛片在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产伦精品一区二区三区视频9|