荔枝果肉多糖級(jí)分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

黃 菲，張瑞芬，董麗紅，肖 娟，唐小俊，張名位

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

荔枝果肉多糖級(jí)分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

黃 菲，張瑞芬，董麗紅，肖 娟，唐小俊，張名位*

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

為了探究不同荔枝果肉多糖級(jí)分的理化性質(zhì)、抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性差異，采用DEAE-52離子交換樹脂分離純化得到2種荔枝果肉多糖級(jí)分LPI和LPII，比較兩者的中性糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量，并采用氧自由基清除能力（ORAC）和細(xì)胞抗氧化（CAA）評(píng)價(jià)其抗氧化活性，采用對(duì)-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）法探究其α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究結(jié)果表明LPII含有較多的中性糖和蛋白質(zhì)，較少的糖醛酸，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中LPI和LPII的ORAC和CAA值分別是24.51，30.08 μmol/g和5.36，8.72 μmol/g，其抑制α-葡萄糖苷的IC50值分別是0.33，0.26 mg/mL。荔枝果肉多糖的生物活性與其中性糖和蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)。

荔枝；多糖；抗氧化；α-葡萄糖苷酶

HUANG Fei，ZHANG Ruifen，DONG Lihong，et al.Antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory effect of litchi pulp polysaccharide fractions［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:26-30.

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是熱帶亞熱帶地區(qū)的特色水果，其果肉營(yíng)養(yǎng)豐富，滋味甜美，深受消費(fèi)者喜愛。中醫(yī)認(rèn)為“常食荔枝能補(bǔ)腦健身，治療瘰疬，開胃益脾；干制能補(bǔ)元?dú)?，可作為產(chǎn)婦及老弱者的補(bǔ)品”?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)多糖是荔枝中的主要活性成分，具有抗氧化［1］、免疫調(diào)節(jié)［2-4］和降血糖［5］的作用。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)荔枝果肉粗多糖具有清除DPPH·、OH·和O2-·等作用［6］；能提高肝臟和血清中總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧化酶活力［7］。但是對(duì)于純化后的荔枝果肉多糖級(jí)分具有怎樣的抗氧化活性尚不清楚。由于傳統(tǒng)的抗氧化方法主要是利用DPPH·和ABTS+·等自由基，而這些自由基不是生理上直接相關(guān)的自由基，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果對(duì)抗氧化物質(zhì)真實(shí)的生理活性的參照性較小。以偶氮化合物ABAP作為過氧自由基來(lái)源的氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）檢測(cè)法因其自由基、檢測(cè)環(huán)境更接近生理狀態(tài)，檢測(cè)結(jié)果更能反映抗氧化物質(zhì)真實(shí)的生理活性而受到廣泛關(guān)注。此外，細(xì)胞抗氧化（cellular antioxidant activity，CAA）因其采用人體肝癌細(xì)胞株HepG2為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，能反?yīng)抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝情況，檢測(cè)結(jié)果比傳統(tǒng)的化學(xué)檢測(cè)方法更有意義，從而被認(rèn)為是抗氧化劑研究方法中的革命。因此，本研究對(duì)荔枝果肉粗多糖進(jìn)一步分離純化，采用ORAC和CAA兩種方法來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。

此外，張鐘等［8］研究發(fā)現(xiàn)荔枝果肉粗多糖具有顯著的體外抑制α-葡萄糖苷酶活性，且可以體內(nèi)降低糖尿病小鼠血糖和糖化血紅蛋白含量、提高肝糖原合成能力，表現(xiàn)出降血糖作用［5］。以上研究均以粗多糖為原料，對(duì)于純化后的荔枝多糖是否還具有降血糖活性尚不清楚。因此，本研究采用對(duì)-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）法分析純化后的荔枝果肉多糖級(jí)分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用來(lái)探究其降血糖活性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

荔枝品種為“黑葉”，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供，于2015年6月采自其實(shí)驗(yàn)果園。人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)。

葡萄糖醛酸、Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）、熒光素鈉鹽、ABAP（2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）-dihydrochloride）、DEAE-52纖維素離子交換樹脂、α-糖苷酶、DCFH-DA、槲皮素、對(duì)-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）、拜唐蘋，美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HBSS緩沖溶液，美國(guó)Gibco公司；間羥基聯(lián)苯，日本TCI公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Infinite Pro 200型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；冷凍干燥儀，北京德天佑科技發(fā)展公司；Eyelan-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，東京理化器械株式會(huì)社；SBS-Z100型數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器，上海青浦瀘西儀器廠；HL-2型恒流泵，上海青浦瀘西儀器廠。

1.3方法

1.3.1荔枝果肉多糖的提取

將熱風(fēng)干燥的荔枝干去殼和核，加無(wú)水乙醇后用打漿機(jī)粉碎，再用無(wú)水乙醇在4℃浸泡12 h后，離心（4 500 r/min，10 min）收集沉淀。將沉淀按料液比1∶20加入蒸餾水后采用95℃熱水浸提4 h，趁熱過濾，分別收集濾液和濾渣，將濾渣重復(fù)浸提一次，過濾后合并2次的濾液。將濾液濃縮為原來(lái)體積的1/4后用Sevag法脫去游離蛋白，再向溶液中按照體積比1∶4加入無(wú)水乙醇，將溶液于4℃靜置12 h后抽濾收集多糖沉淀。將沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次，再冷凍干燥得到荔枝粗多糖。

1.3.2多糖級(jí)分的制備

將100 mg粗多糖溶于5 mL去離子水中，4 500 r/min離心10 min后，將上清液加入DEAE-52離子交換層析柱（2.6 cm×50 cm）中。采用0.3 mol/L NaCl和0.3 mol/L NaOH以1 mL/min的流速依次洗脫10 h，5 mL/管收集洗脫液。苯酚-硫酸法檢測(cè)每管吸光度后，按吸光度強(qiáng)度收集組分，將收集的洗脫液用透析袋透析3 d脫去鹽離子，再進(jìn)一步冷凍干燥得到2個(gè)荔枝多糖組分，分別是LPI和LPII。

1.3.3基本成分分析

中性糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法［9］；糖醛酸含量測(cè)定采用Blumenkrantz和Asboe-Hanaen的方法［10］；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測(cè)定。測(cè)定重復(fù)3次。

1.3.4紫外光譜分析

配置1 mg/mL的多糖溶液5 mL，離心（4 500 r/min，10 min）后取2 mL上清液，采用紫外-可見分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.3.5抗氧化活性

1.3.5.1氧自由基吸收能力測(cè)定

參考續(xù)潔琨等［11］的方法并稍作修改。先將緩沖液（空白）、不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液、不同濃度的多糖級(jí)分溶液及0.96 μmol/L熒光素工作液加入到96孔板各孔后，37℃孵育10 min。再向未加熒光素的每孔中加入0.96 μmol/L的熒光工作液，37℃孵育20 min后，迅速向各孔加入119 mmol/L ABAP溶液后檢測(cè)各孔的熒光衰退情況。檢測(cè)條件:37℃，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，每4.5 min測(cè)一次，測(cè)定35次。結(jié)果以每克干基中所含相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的量（μmol/g）表示。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.5.2細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定

參考Wolfe［12］的方法并稍作修改。向96孔板中加入6×105cell/mL的HepG2細(xì)胞懸液100 μL/孔，孵育24 h后棄去培養(yǎng)基，向各孔中分別加入100 μL含有25 μmol/L DCFH-DA的不同濃度槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同質(zhì)量濃度的多糖級(jí)分溶液液，孵育1 h后，每孔加入100 μL含600 μmol/L ABAP的PBS配制的溶液，后續(xù)測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度。檢測(cè)條件:37℃，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，每5 min測(cè)一次，測(cè)定12次。結(jié)果以每克干基中所含相當(dāng)于槲皮素的量（μmol/g）表示。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.6對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考張鐘等［8］的方法稍作修改。將1 mL 0.1 mol/L的pH為6.8的磷酸緩沖液和5 U的α-糖苷酶混勻，制成反應(yīng)酶液；將多糖級(jí)分分別用磷酸緩沖液制成0.05～1 mg/mL的多糖溶液。磷酸緩沖液為空白對(duì)照。向96孔板各孔分別加入40 μL多糖溶液后，再向每孔加入20 μL酶液，并在37℃孵育10 min。然后用多道移液器迅速在各孔加入60 μL的20 mmol/L的PNPG溶液，37℃孵育10 min后，每孔加入0.2 mol/L Na2CO3（160 μL）終止反應(yīng)，在405 nm下檢測(cè)吸光值。同時(shí)設(shè)定樣品背景對(duì)照組、空白對(duì)照組和以拜唐蘋為抑制劑的陽(yáng)性對(duì)照組，計(jì)算酶活抑制率。α-糖苷酶活性抑制率計(jì)算見式（1）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并以S-N-K檢驗(yàn)比較各組間差異，顯著性水平為p＜0.05，以不同小寫字母表示。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1荔枝果肉多糖級(jí)分的基本成分分析

荔枝果肉多糖級(jí)分LPI和LPII的基本化學(xué)成分見表1。LPI和LPII的中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量均存在顯著性差異（p＜0.05）。LPI的中性糖和蛋白質(zhì)含量低于LPII（p＜0.05），但其糖醛酸含量顯著高于LPII（p＜0.01）。

表1　荔枝果肉多糖級(jí)分的化學(xué)組成Table 1 Chemical compositions of LPI and LPII

2.2荔枝果肉多糖級(jí)分的紫外光譜特征

LPI和LPII的紫外掃描圖譜見圖1。由圖1可知，LPI在260 nm和280 nm處沒有吸收峰出現(xiàn)，說明LPI中不含有或者含有很少量的核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)；LPII在280 nm處有顯著凸起的吸收峰，說明LPII含有蛋白質(zhì)，此結(jié)果與考馬斯亮蘭法檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3荔枝果肉多糖級(jí)分的抗氧化活性

2.3.1ORAC抗氧化能力

ORAC法通過以偶氮類化合物ABAP作為自由基來(lái)源，熒光素鈉鹽作為熒光指示劑，通過記錄ABAP和熒光素鈉反應(yīng)使其逐漸轉(zhuǎn)化為非熒光物質(zhì)時(shí)熒光強(qiáng)度的變化過程，來(lái)判斷抗氧化物質(zhì)抑制自由基的能力，見圖2。由圖2可知，LPI和LPII的ORAC值分別是24.51和30.08 μmol/g，LPII的氧自由基吸收能力顯著強(qiáng)于LPI（p＜0.05）。

圖1　荔枝果肉多糖級(jí)分LPI和LPII的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectra of LPI and LPII

2.3.2CAA抗氧化能力

本身無(wú)熒光的DCFH-DA可被細(xì)胞酯酶分解形成還原型DCFH，進(jìn)一步在氧自由基的作用下形成氧化型的熒光物質(zhì)DCH。CAA法通過測(cè)定抗氧化劑結(jié)合在細(xì)胞膜或進(jìn)入細(xì)胞后，阻止ABAP產(chǎn)生的氧自由基形成DCH。通過與對(duì)照物相比，細(xì)胞熒光物質(zhì)的減少量反映化合物的抗氧化能力，見圖3。由圖3可知，LPI和LPII的CAA值分別是5.36和8.72 μmol/g，LPII的細(xì)胞抗氧化能力顯著強(qiáng)于LPI（p＜0.05），此結(jié)果與ORAC檢測(cè)方法一致。

圖2　荔枝多糖級(jí)分LPI和LPII的ORAC值Fig.2 ORAC values of LPI and LPII

圖3　荔枝多糖級(jí)分LPI和LPII的CAA值Fig.3 CAA values of LPI and LPII

采用兩種不同檢測(cè)方法均發(fā)現(xiàn)LPII比LPI具有更好的抗氧化活性，其活性差異與其中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸有關(guān)。鄧媛元等［13］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的苦瓜多糖的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)中性糖含量最高的3個(gè)品種的苦瓜多糖的ORAC指數(shù)也是最大的；Guo等［14］研究發(fā)現(xiàn)Oidiodendron truncatumGW真菌多糖中的蛋白質(zhì)有利于其抗氧化活性的發(fā)揮；Jiang等［15］研究發(fā)現(xiàn)不同的青蛤多糖級(jí)分中蛋白質(zhì)含量最高的CSPS-3具有最強(qiáng)的抗氧化活性。本研究中中性糖和蛋白質(zhì)含量高的LPII比LPI具有更好的抗氧化活性，此結(jié)果與他人研究結(jié)果一致。

2.4荔枝果肉多糖級(jí)分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶，它可以從低聚糖類物質(zhì)的非還原末端切開α-1，4糖苷鍵釋放出葡萄糖，被認(rèn)為是控制II型糖尿病患者餐后血糖升高的治療靶點(diǎn)。在本研究中，LPI和LPII對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在劑量依賴關(guān)系，相同濃度下LPII的抑制作用顯著強(qiáng)于LPI（p＜0.05）。在0.05～1 mg/mL，LPI、LPII和拜唐蘋的抑制率分別是13.00%～77.69%，13.76%～81.89%和31.95%～92.03%。LPI、LPII和拜唐蘋抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值分別是0.327，0.256，0.109 mg/mL。結(jié)果表明LPII對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)于LPI，但是兩者均低于拜唐蘋，見圖4。

圖4　荔枝多糖級(jí)分LPI和LPII的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.4 α-Glucosidase inhibitory activities of LPI and LPII

多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性與其基本組成密切相關(guān)。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)茶樹葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨其中性糖含量的增加而增強(qiáng)；Hsu等［17］研究發(fā)現(xiàn)云芝菌絲體多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性與其蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)［16］。本研究中LPII因其含有更多的中性糖和蛋白質(zhì)，表現(xiàn)出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，與文獻(xiàn)［16-17］的研究結(jié)果一致。此外，對(duì)于多糖表現(xiàn)出不同的α-葡萄糖苷酶抑制活性，有研究表明多糖的單糖組成和糖苷鏈的差異導(dǎo)致其與α-葡萄糖苷酶的活性中心反應(yīng)程度不同，從而表現(xiàn)出不同的活性。荔枝果肉多糖與α-葡萄糖苷酶抑制活性的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié) 論

通過分析荔枝果肉多糖不同級(jí)分的基本組成、ORAC和CAA抗氧化能力及其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)LPII因含有更多的中性糖和蛋白質(zhì)，具有更好的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究結(jié)果在一定程度上豐富了荔枝果肉多糖的生物活性，為其構(gòu)效研究提供了基礎(chǔ)。

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Antioxidant Activity and α-Glucosidase Inhibitory Effect of Litchi Pulp Polysaccharide Fractions

HUANG Fei，ZHANG Ruifen，DONG Lihong，XIAO Juan，TANG Xiaojun，ZHANG Mingwei*
（Sericultural and Agri-Food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，China）

In order to explore the differences of litchi pulp polysaccharide fractions，the content and composition，as well as antioxidant capacities and α-glucosidase inhibitory activities of varied litchi pulp polysaccharide fractions were studied.A DEAE-52 anion-exchange column was used to obtain two different litchi pulp polysaccharide fractions，denoted as LPI and LPII.The contents of neutral sugar，uronic acid，and protein were analyzed.In addition，their antioxidant activities were evaluated by oxygen radical absorbance capacity（ORAC）and cellular antioxidant activity（CAA）.The p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside method was used to measure the α-glucosidase inhibitory activity.The results showed that LPII contained more neutral sugar and protein than LPI，but less uronic acid.LPII exhibited higher antioxidant activity in ORAC value（30.08 μmol/g）and CAA value（8.72 μmol/g）that those of LPI（24.51 μmol/g and 5.36 μmol/g）.In addition，the IC50values of α-glucosidase inhibition were 0.33 and 0.26 mg/mL for LPI and LPII.The results demonstrated that bioactivities of litchi pulp polysaccharide fractions were related to its neutral sugar and protein contents.

litchi；polysaccharides；antioxidant activity；α-glucosidase

TS255.2；TS201.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.005

2095-6002（2016）04-0026-05引用格式：黃菲，張瑞芬，董麗紅，等.荔枝果肉多糖級(jí)分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，34（4）:26-30.

（責(zé)任編輯:檀彩蓮）

20160704

國(guó)家自然科學(xué)基金-廣東聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（U1301211）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2016A030310321）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016B070701012）。

黃 菲，女，助理研究員，博士，主要從事植物多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性研究；

*張名位，男，研究員，博士，主要從事植物活性成分和功能性食品研究。通信作者。