蓮藕不同部位多糖的理化特征與抗氧化活性研究

李正一，連成杰，孫 杰，閔 婷，2，易 陽(yáng)，2，*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

專題研究專欄

蓮藕不同部位多糖的理化特征與抗氧化活性研究

李正一1，連成杰1，孫 杰1，閔 婷1，2，易 陽(yáng)1，2，*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

編者按：廣泛存在于動(dòng)植物中的多糖，不僅作為生物的組織支持和能量來(lái)源，還參與生物合成、細(xì)胞識(shí)別、增殖、轉(zhuǎn)移等多種生理過(guò)程。許多天然來(lái)源多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、促進(jìn)腸道健康等功能活性。特色農(nóng)產(chǎn)品中多糖的結(jié)構(gòu)特征及其生物活性研究，一直是功能食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本期兩篇文章分別對(duì)蓮藕不同部位的多糖和荔枝果肉不同多糖級(jí)分的理化性質(zhì)及其抗氧化活性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果可為多糖類功能性食品開(kāi)發(fā)提供參考。

（主持人：張名位研究員）

采用分步醇沉法制備蓮藕食用部位、皮和節(jié)中多糖（EP60/75/90、PP60/75/90和NP60/ 75/90），分析其基本組成、理化特征及抗氧化活性，明確活性多糖在蓮藕中的分布。不同部位多糖的組成存在明顯差異，其中由食用部位制備多糖的純度較低。高效分子排阻色譜分析發(fā)現(xiàn)，蓮藕不同部位多糖均以1.30～1.63 ku的低分子組分為主，且含有少量的結(jié)合蛋白。體外抗氧化活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)：食用部位多糖的抗氧化活性較藕皮多糖和藕節(jié)多糖弱，尤其是DPPH自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力（p＜0.05）；藕皮多糖的抗氧化活性均為PP60＞PP75＞PP90；藕節(jié)多糖NP60和NP90的活性相當(dāng)，其羥自由基清除能力強(qiáng)于NP75（p＜0.05），而FRAP總抗氧化能力則較弱（p＜0.05）。蓮藕抗氧化活性多糖主要分布于皮和節(jié)中，其活性強(qiáng)弱可能與結(jié)合蛋白含量和分子量的高低有關(guān)。

蓮藕；多糖；理化特征；抗氧化活性

引用格式：李正一，連成杰，孫杰，等.蓮藕不同部位多糖的理化特征與抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，34（4）:18-25.

LI Zhengyi，LIAN Chengjie，SUN Jie，et al.Study on physicochemical characteristics and antioxidant activities of polysaccharides from different parts of lotus root［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:18-25.

蓮藕是多年生水生植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的肥大根莖，亦是我國(guó)種植面積最大且產(chǎn)量最高的水生蔬菜［1］。蓮藕因風(fēng)味獨(dú)特且富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分而頗受消費(fèi)者喜愛(ài)，同時(shí)作為一種藥用植物亦備受關(guān)注［2］。據(jù)中藥藥典所述，蓮藕生用可清熱、涼血、散疲、治熱病煩渴，熟用可健脾、開(kāi)胃、益血、生肌、止瀉［3］，但當(dāng)前對(duì)其功效成分及作用機(jī)理所知甚少。

多糖作為一種重要的生物活性大分子，成為蓮藕營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)的重要切入點(diǎn)。研究證實(shí)，蓮藕多糖具有良好的抗氧化活性［4-7］，包括:有效清除多種自由基；抑制紅細(xì)胞氧化損傷；增強(qiáng)糖尿病小鼠多種組織器官的SOD活性，并降低MDA含量。鑒于蓮藕加工水平低且產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重的現(xiàn)狀，活性多糖開(kāi)發(fā)利用有望成為高值化新產(chǎn)品創(chuàng)制的重要途徑之一，然而，相關(guān)研究選材以藕渣和藕節(jié)為主，尚缺乏對(duì)蓮藕這一資源中活性多糖的全面分析評(píng)價(jià)。

植物不同組織部位中多糖的含量、理化特性和抗氧化活性往往存在顯著差異［8-9］，而蓮藕不同部位多糖的理化及活性差異鮮見(jiàn)報(bào)道。此外，多糖的理化特性與抗氧化活性之間的關(guān)系極為復(fù)雜，如蛋白質(zhì)含量［10-13］和分子量［14-15］等對(duì)多糖抗氧化活性的影響尚無(wú)定論，涉及蓮藕多糖理化特征與抗氧化活性的相互關(guān)系亦未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用分步醇沉法制備蓮藕不同部位多糖，分析其基本組成、光譜特征和分子量分布，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，旨為蓮藕天然抗氧化活性多糖開(kāi)發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮蓮藕，購(gòu)于武漢市常青花園武商量販超市；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ），東京化成工業(yè)株式會(huì)社；α-淀粉酶（BR），阿拉丁試劑公司；總蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；水溶性聚氧化乙烯標(biāo)準(zhǔn)品（重均分子量分別為24.2，41.3，67.5，149，313 ku），美國(guó)Waters公司；濃硫酸、苯酚、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、乙醇、硫酸亞鐵等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（包括2414型差示折光檢測(cè)器、2489型紫外檢測(cè)器、1525型二元泵、Ultrahydrogel 1000型分子排阻色譜柱），Waters公司；Nicolet 5SXC型紅外光譜儀，美國(guó)Thermo公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；12N型冷凍干燥儀和XHF-D型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；V-1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1蓮藕多糖的分離制備

新鮮蓮藕經(jīng)洗凈后切分為藕皮、藕節(jié)和食用部位，并分別粉碎，參考文獻(xiàn)［16］方法提取多糖。取粉碎原料100 g加入1 L蒸餾水中，采用高速勻漿機(jī)以11 800 r/min轉(zhuǎn)速均質(zhì)處理5 min，將勻漿置于89℃熱水浴中浸提2 h；離心（4 500 r/min，10 min）、過(guò)濾分離上清液，進(jìn)一步真空濃縮至約200 mL；采用α-淀粉酶酶解濃縮液至碘反應(yīng)不顯色，并應(yīng)用Sevage法脫除蛋白質(zhì)；濃縮液中加入無(wú)水乙醇（體積分?jǐn)?shù)為60%，75%，90%）分步沉淀多糖，并經(jīng)冷凍干燥成粉末。相應(yīng)地，藕食用部位分離制備得到多糖EP60、EP75和EP90，藕皮制備得到多糖PP60、PP75和PP90，藕節(jié)制備得到多糖NP60、NP75和NP90，而得率以所得多糖占原料鮮重的質(zhì)量百分比計(jì)。

1.3.2蓮藕多糖的理化特征分析

1.3.2.1基本組成測(cè)定

采用DNS法［17］和苯酚-硫酸法［17-18］分別測(cè)定樣品中還原糖和總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以總糖和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之差計(jì)；樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

1.3.2.2紫外和紅外光譜掃描

制備100 μg/mL的樣品溶液，在波長(zhǎng)190～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。取1 mg樣品與100～200 mg KBr粉末在研缽中混勻研磨，置于模具內(nèi)壓成透明薄片，在波數(shù)400～4000 cm-1進(jìn)行紅外掃描。

1.3.2.3分子量分布測(cè)定

分子量分布參考文獻(xiàn)［16］中高效分子排阻色潽法（HPSEC）測(cè)定，采用紫外檢測(cè)器和差示折光檢測(cè)器進(jìn)行串聯(lián)分析，并以已知分子量的聚氧化乙烯標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算色譜峰對(duì)應(yīng)的分子量大小。

1.3.3蓮藕多糖的抗氧化活性評(píng)價(jià)

DPPH自由基清除活性參考文獻(xiàn)［16］測(cè)定。FRAP總抗氧化能力參考文獻(xiàn)［18］測(cè)定。羥自由基清除活性參考文獻(xiàn)［19］方法（稍作修改）測(cè)定:0.6 mL不同濃度的多糖溶液與1 mL FeSO4溶液（1.5 mmol/L）、0.4 mL水楊酸溶液（2 mmol/L）和1 mL H2O2（6 mmol/L）混勻后置于37℃恒溫水浴反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后以蒸餾水調(diào)零測(cè)定510 nm吸光值；空白組用蒸餾水代替多糖溶液，對(duì)照組用蒸餾水代替水楊酸。羥自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式（1）中:A1為測(cè)試樣品的吸光度；A2為對(duì)照組的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS19軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的S-N-K檢驗(yàn)，顯著性水平為p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1蓮藕不同部位粗多糖的基本組成

分步醇沉制備蓮藕食用部位、皮和節(jié)中多糖，各步醇沉多糖的得率及基本組成如表1。乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)的粗多糖得率較高，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)占各部位粗多糖總量的55%以上。藕食用部位制備粗多糖得率較高，達(dá)2.28%，而藕皮次之。不同部位所得粗多糖主要由多糖、還原糖和蛋白質(zhì)組成，但各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在明顯差異。食用部位多糖EP60、EP75和EP90中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著差異（p＞0.05），但均顯著低于其他多糖（p＜0.05）。藕皮和藕節(jié)多糖PP60和NP60具有相對(duì)較高的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別達(dá)9.70%和7.06%。EP60、EP75和EP90中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于29.60%～42.93%，顯著高于其他多糖（p＜0.05）。相應(yīng)地，藕皮和藕節(jié)粗多糖的純度較高，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于70%。

表1　蓮藕不同部位粗多糖的基本組成Tab.1 Basic components of crude polysaccharides from different parts of lotus root%

圖1　蓮藕不同部位粗多糖的紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectrograms of crude polysaccharides from different parts of lotus root

2.2蓮藕不同部位粗多糖的光譜特征

分析蓮藕不同部位粗多糖的紫外光譜特征（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn):藕食用部位多糖EP60、EP75和EP90在280 nm附近無(wú)明顯吸收峰，呼應(yīng)較低蛋白質(zhì)含量（＜0.5%）；PP60、NP60、NP75和NP90在280 nm附近有較弱的吸收峰，吸收信號(hào)稍強(qiáng)于PP75和PP90，與蛋白質(zhì)含量高低結(jié)果一致。掃描蓮藕不同部位粗多糖的紅外光譜，如圖2。各粗多糖均顯現(xiàn)多糖的特征譜帶，包括:3 200～3 600 cm-1和1 010～1 075 cm-1范圍O—H伸縮/彎曲振動(dòng)的羥基特征吸收峰，2 926 cm-1附近C—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的烷基特征吸收峰，1 410 cm-1附近C—O伸縮振動(dòng)的羧基吸收峰。同時(shí)，在1 610～1 630 cm-1因N—H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生氨基特征峰，印證所有粗多糖均含有蛋白質(zhì)。此外，EP90和NP90在1 733 cm-1附近的吸收峰來(lái)源于糖醛酸羧基形成酯鍵—COOR中C==O的伸縮振動(dòng)；EP90和PP90分別在925.42和933.12 cm-1處的反對(duì)稱環(huán)振動(dòng)吸收峰，以及777.30和775.58 cm-1處的對(duì)稱環(huán)振動(dòng)吸收峰，均說(shuō)明其中含有D吡喃葡萄糖，與嚴(yán)浪等［20］對(duì)藕渣多糖的分析結(jié)果吻合。

圖2　蓮藕不同部位粗多糖的紅外光譜Fig.2 Infrared spectrograms of crude polysaccharides from different parts of lotus root

圖3　蓮藕不同部位粗多糖的HPSEC-RI色譜Fig.3 HPSEC-RI chromatograms of crude polysaccharides from different parts of lotus root

2.3蓮藕不同部位粗多糖的分子量分布特征

采用分步醇沉法制備蓮藕不同分子量多糖，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，沉淀多糖的分子量越小。應(yīng)用HPSEC-RI法分析不同部位粗多糖的分子量分布情況（圖3），并計(jì)算各信號(hào)峰保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的分子量，匯總于表2。60%乙醇沉淀多糖的分子量分布較其他多糖寬且平均分子量較大，僅EP60、PP60和NP60在保留時(shí)間18 min處出現(xiàn)高分子量組分峰，對(duì)應(yīng)分子量分別為85.56，82.23，81.02 ku。蓮藕不同部位多糖均以介于1.30～1.63 ku的低分子組分為主，導(dǎo)致乙醇分步醇沉的分子量梯度分布不明顯，而不同部位粗多糖在保留時(shí)間28 min附近的弱響應(yīng)可能源于所含還原糖。此外，通過(guò)280 nm紫外吸收分析粗多糖中蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量分布情況，HPSEC-UV色譜圖見(jiàn)圖4。9種粗多糖的UV吸收峰與RI信號(hào)峰均一一對(duì)應(yīng)（因紫外檢測(cè)器置前，UV吸收峰的保留時(shí)間稍短），說(shuō)明其中含有少量結(jié)合蛋白。江筠［6］采用體積分?jǐn)?shù)為50%和67%的乙醇分步醇沉蓮藕粗多糖，確定67%乙醇沉淀多糖的低分子組分分子量為18 ku。嚴(yán)浪等［20］采用離子交換柱層析分離得到一種蓮藕酸性雜多糖，其相對(duì)分子量大于2 000 ku。蓮藕多糖分子量測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道的顯著差異可能與不同原材料和分離制備方法有關(guān)。

表2　蓮藕不同部位粗多糖的分子量分布Tab.2 Molecular weight distributions of crude polysaccharides from different parts of lotus root

圖4　蓮藕不同部位粗多糖的HPSEC-UV色譜圖Fig.4 HPSEC-UV chromatograms of crude polysaccharides from different parts of lotus root

2.4蓮藕不同部位粗多糖的抗氧化活性

多糖的抗氧化機(jī)理涉及還原能力、阻止鏈引發(fā)、結(jié)合過(guò)渡金屬催化劑、清除自由基等多個(gè)方面［21-22］，采用DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)蓮藕多糖的抗氧化活性，結(jié)果如表3。藕食用部位多糖的DPPH自由基清除活性和FRAP總抗氧化能力均弱于藕皮多糖和藕節(jié)多糖（p＜0.05），其中EP60的抗氧化活性相對(duì)較強(qiáng)。藕皮多糖的3種抗氧化活性均為PP60＞PP75＞PP90。藕節(jié)多糖中NP60和NP90的抗氧化活性相當(dāng)，其DPPH自由基清除能力與NP75無(wú)顯著差異（p＞0.05），羥自由基清除能力較NP75強(qiáng)（p＜0.05），但FRAP總抗氧化能力較弱（p＜0.05）。前期研究發(fā)現(xiàn)，蓮藕多糖的超氧陰離子和DPPH自由基的清除能力較弱，但能有效清除羥自由基并抑制H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血［4-5］，其有效成分可能主要為食用部位多糖。

表3　蓮藕不同部位粗多糖的抗氧化活性Tab.3 Antioxidant activities of crude polysaccharides from different parts of lotus root

多糖中蛋白質(zhì)含量對(duì)其自由基清除能力的影響尚存在爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為蛋白質(zhì)含量與多糖的自由基清除能力存在顯著相關(guān)性［10-11］，亦有研究表明兩者無(wú)關(guān)聯(lián)［12-13］。PP60和NP60較強(qiáng)的自由基清除能力可能與其較高的蛋白質(zhì)含量有關(guān)，亦或與較高的分子量相關(guān)。川芎多糖和香菇多糖的抗氧化活性，涉及DPPH自由基清除、超氧陰離子清除、羥自由基清除和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力等，與其分子量大小呈正相關(guān)［14］。多糖抗氧化的構(gòu)效關(guān)系受許多復(fù)雜因素的影響，包括分子量、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、活性羥基數(shù)量、分子構(gòu)象等，蓮藕多糖的結(jié)構(gòu)特征有待于進(jìn)一步深入解析。

3　結(jié) 論

采用乙醇沉淀法制備蓮藕不同部位的多糖，所得粗多糖純度均小于82%，其主要雜質(zhì)為還原糖，而蛋白質(zhì)可能主要以結(jié)合形式存在。蓮藕不同部位中多糖均以1.30～1.63 ku的低分子組分為主，導(dǎo)致不同濃度乙醇分步沉淀所得多糖的分子量梯度分布并不明顯，可結(jié)合離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾柱層析對(duì)蓮藕多糖進(jìn)一步分離純化。藕食用部位多糖的抗氧化能力整體弱于藕皮多糖和藕節(jié)多糖，尤以DPPH自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力較弱，說(shuō)明藕節(jié)和藕皮是蓮藕抗氧化活性多糖開(kāi)發(fā)的重要資源。多糖PP60和NP60的抗氧化活性較強(qiáng)，推測(cè)可能與相對(duì)較高的蛋白質(zhì)含量和分子量相關(guān)，然而，多糖抗氧化的構(gòu)效關(guān)系極為復(fù)雜，蓮藕多糖單糖組成、糖苷鍵鏈接、構(gòu)象等結(jié)構(gòu)特征還需進(jìn)一步系統(tǒng)解析。

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Study on Physicochemical Characteristics and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Different Parts of Lotus Root

LI Zhengyi1，LIAN Chengjie1，SUN Jie1，MIN Ting1，2，YI Yang1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China；2.Hubei Engineering Research Center for Fresh Food，Wuhan 430023，China）

To explore the distribution of polysaccharides with higher antioxidant activities in lotus root，polysaccharides in edible part，peel，and node（i.e.EP60/75/90，PP60/75/90 and NP60/75/90）were respectively isolated using a precipitation method coupled with gradually increased alcohol concentrations.While the basic components，physicochemical characteristics，and antioxidant activities were further analyzed.Polysaccharides from different parts of lotus root showed obvious differences in composition，and edible part polysaccharides（EPs）had lower purities compared with peel polysaccharides（PPs）and node polysaccharides（NPs）.Based on high performance molecular-exclusion chromatography，it was found that lotus root polysaccharides were mainly composed of fractions with low molecular weight（1.30-1.63 ku）and less binding protein.The antioxidant evaluations in vitro confirmed that the antioxidant activities of EPs were weaker than those of PPs and NPs，especially DPPH radical scavenging ability and FRAP total antioxidant capacity（p＜0.05）.The antioxidant activities of PPs could be ordered as PP60＞PP75＞PP90.Meanwhile，the activities of NP60 and NP90 were matched，which exhibited stronger hydroxyl radical scavenging capacities and weaker FRAP total antioxidant capacities than NP75（p＜0.05）.The polysaccharides with higher antioxidant activities mainly exist in the peel and node of lotus root，which might be related to binding protein content and molecular weight.

lotus root；polysaccharide；physicochemical characteristics；antioxidant activity

TS201.4

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.004

2095-6002（2016）04-0018-08

（責(zé)任編輯:葉紅波）

20160702

湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BBA203）。

李正一，男，本科生，研究方向?yàn)楣呋钚猿煞址治觯?/p>

*易 陽(yáng)，男，副教授，博士，主要從事功能食品方面的研究。通信作者。