水分脅迫下小麥TaWSI18基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析

樊　磊，陳　娟，張艷娥，張林生，朱維寧，張大鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100)

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水分脅迫下小麥TaWSI18基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析

樊磊，陳娟，張艷娥，張林生，朱維寧，張大鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100)

小麥；水分脅迫；TaWSI18基因；電子克隆；生物信息學(xué)

小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物，非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞缺水，影響植物的生長發(fā)育，誘導(dǎo)多種基因表達(dá)[1]，產(chǎn)生一系列重要的功能蛋白和調(diào)控蛋白，減輕水分脅迫對(duì)作物的損害。調(diào)控蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝、轉(zhuǎn)錄并對(duì)各種刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[2-3]。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(Late embryogenesis abundant protein，LEA)自1981年首次在棉花中發(fā)現(xiàn)以來[4-5]，人們?cè)谠S多植物中都發(fā)現(xiàn)了此類蛋白的存在，尤其是在干旱等逆境脅迫下，發(fā)現(xiàn)LEA蛋白表達(dá)量升高[6-8]。在水分脅迫條件下，LEA蛋白對(duì)酶(如乳酸脫氫酶，蘋果酸脫氫酶等)[9-10]和膜結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，增強(qiáng)植物的抗性。張瑞越[11]等從小麥中克隆的水分脅迫誘導(dǎo)基因W89受干旱、低溫和ABA的誘導(dǎo)表達(dá)。從水稻中分離到水分脅迫誘導(dǎo)基因wsi18,wsi76，wsi724，其中wsi18在水分脅迫時(shí)表達(dá)量增加[12-13]。植物的水分脅迫應(yīng)答涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，脅迫機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究運(yùn)用電子克隆的方法對(duì)小麥EST序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，拼接克隆得到WSI18的cDNA序列，利用生物信息學(xué)分析其結(jié)構(gòu)與功能，并進(jìn)行同源性比對(duì)，為深入研究小麥水分脅迫誘導(dǎo)基因的功能具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

供試小麥品種為陜合6號(hào)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑：大腸桿菌JM109，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存；PrimeSTARHS DNA，pMD18-T載體，DNA Marker均購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒，均購自天根公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司。序列測定由華大基因完成。

1.2引物的設(shè)計(jì)合成

以電子克隆序列為基礎(chǔ)，采用OLIGO7軟件設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增的1對(duì)引物，上游引物F：5 ‘ACTTTTCGAGCCCTATCCAGT 3’，下游引物R：5‘AAGATACATCAGGGTCGCCTT 3’。由華大基因合成。

1.3電子克隆的技術(shù)路線和方法

目前電子克隆最常用的方法是利用EST信息進(jìn)行同源性檢索、聚類、序列拼裝等獲得部分乃至全長cDNA序列。本研究參考張德禮等的方法[14]，略有改動(dòng)。在NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索小麥或與小麥親緣關(guān)系較近的cDNA序列，以該序列作為種子序列，對(duì)小麥EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast檢索，提取高同源性WSI18基因的EST序列，利用CExpress軟件進(jìn)行拼接。再以拼接后的EST作為新的查詢探針，重復(fù)以上步驟，繼續(xù)搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫，直到?jīng)]有新的WSI18基因的EST序列可供拼接為止。對(duì)拼接后的EST進(jìn)行ORF預(yù)測、Blast及完整性分析。

1.4RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增

使用Trizol試劑盒提取干旱處理24 h的小麥幼苗的總RNA，置于-80℃冰箱中備用。按照TaKaRa公司PrimeScriptRT reagent Kit Perfect Real Time的操作，將2 μl總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。利用PrimeSTARHS DNA高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系為20 μl，程序?yàn)?8℃ 3 min，98℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。最后1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.5RT-PCR產(chǎn)物膠回收、基因克隆及測序分析

按照膠回收和基因克隆試劑盒說明，進(jìn)行RT-PCR產(chǎn)物膠回收和基因克隆，獲得的目的片段，通過加“A”反應(yīng)與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含有氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB平板上篩選陽性克隆，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定的陽性菌在37℃ 220 r/min 培養(yǎng)過夜，收菌提取質(zhì)粒，PCR鑒定，然后進(jìn)行基因測序，將測序結(jié)果與電子克隆序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6小麥TaWSI18基因的生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder軟件對(duì)基因ORF進(jìn)行預(yù)測；使用ExPASy在線程序ProtParam對(duì)蛋白序列的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等基本性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；ProtScale進(jìn)行親/疏水性預(yù)測；NetPhos 2.0在線軟件對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析；應(yīng)用SignalP 3.0 Server工具進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測；TargetP和PSORT在線分析亞細(xì)胞定位；TMHMM工具預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；并利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)HNN進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。使用ClustalX軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并結(jié)合MEGA 5.0軟件，基于ML方法及500次bootstrap檢測構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥TaWSI18基因的電子克隆

以無芒雀麥WSI18基因(登錄號(hào)AB813835)為探針，從NCBI的小麥EST庫中，篩選到兩條序列，其登錄號(hào)分別為BQ166490和GH727079。利用CExpress軟件拼接，再以該EST為探針，在小麥EST數(shù)據(jù)庫中Blast檢索，重復(fù)以上過程，直至沒有更多的重疊EST檢出。通過ORF Finder軟件預(yù)測，被篩選而拼接的序列具有完整的ORF(90-767 bp)，編碼225個(gè)氨基酸。以起始密碼子的堿基為第1位(標(biāo)記為+1)，在+4位核苷酸為G，-3和-6位核苷酸為G，符合kozak原則(ATG附近的核苷酸序列以ANNATGG和GNNATGG利用率較高)。在3’UTR區(qū)有典型的poly A，表明拼接獲得了1條完整的cDNA序列，命名為TaWSI18-EST(圖1)。

圖1電子克隆序列TaWSI18-EST及預(yù)測的氨基酸序列

Fig.1Electronic cloning sequence ofTaWSI18-ESTand the prediction of its amino acid sequence

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物序列與電子克隆序列比對(duì)分析

以干旱處理的小麥葉片的cDNA為模板，采用基因特異性引物F和R擴(kuò)增目的片段，此目的片段長度為764 bp(圖2)，測序獲得4條高度同源的TaWSI18基因，分別命名為TaWSI18-1、TaWSI18-2、TaWSI18-3和TaWSI18-4，Blast分析表明，克隆的4條序列與TaWSI-EST序列相似性分別為99%、99%、99%和98%。ClutalX比對(duì)分析與TaWSI18-EST序列的差異，以克隆序列的第一個(gè)堿基為第一位，TaWSI18-1基因在539、599、647和699位點(diǎn)與其存在堿基差異，752和753位存在兩個(gè)堿基缺失差異。TaWSI18-2基因在289、290、291、293、539、599、647和699位點(diǎn)存在堿基差異，752和753位點(diǎn)兩個(gè)堿基缺失差異。TaWSI18-3基因堿基差異位點(diǎn)與TaWSI-like2基因的差異位點(diǎn)相同，但752和753位點(diǎn)與TaWSI18-EST序列相同。TaWSI18-4基因與TaWSI18-EST序列的差異較其他3個(gè)基因的大，在25～39、209、288～296、346、362、365、370、499、536和566位點(diǎn)存在差異，40～57位點(diǎn)缺失差異(表1)。利用ORF Finder軟件分析，結(jié)果表明TaWSI18-1、TaWSI18-2、TaWSI18-3和TaWSI18-4基因ORF框均為678 bp,編碼225個(gè)氨基酸。Blast分析表明，克隆的基因與TaWSI18-EST蛋白序列相似性分別為99%，99%，99%及97%。ClustalX比對(duì)分析，TaWSI18-2和TaWSI18-3基因ORF框一致，編碼相同的蛋白。小麥中的WSI18蛋白與TaWSI18-EST氨基酸序列的差異性如表2所示。

注 Note: M—Marker; I—PT-PCR產(chǎn)物 PT-PCR product

圖2干旱條件下小麥葉片中TsWS118基因的RT-PCR電泳結(jié)果

Fig.2The RT-PCR ofTsWS118 from wheat

leaves under drought conditions

在NCBI網(wǎng)站通過Blast分析，本文克隆的基因與已公布的無芒雀麥的BiWSI18基因(AB813835)、二穗短柄草的lea3基因(XM_003569593.1)、野生水稻(Oryzabrachyacha)的lea3基因(XM_006644519)和日本水稻(OryzasativaJaponica)的WSI18基因(D26536)相似性分別約為94%、90%、90%、90%和90%。并與其他植物的水分脅迫相關(guān)的基因具有一定的相似性，證實(shí)所得到的基因?yàn)樗置{迫誘導(dǎo)基因。

表1小麥的TaWSI18-1、TaWSI18-2、TaWSI18-3、TaWSI18-4基因與電子克隆序列TaWSI18-EST的差異堿基

Table 1　The sequence differences between TaWSI18-1, TaWSI18-2, TaWSI18-3,TaWSI18-4 and TaWSI18-EST in wheat

表2　小麥的TaWSI18-1, TaWSI18-2/TaWSI18-3, TaWSI18-4蛋白與電子克隆序列TaWSI18-EST的編碼蛋白的氨基酸差異

2.3小麥TaWSI18蛋白特性分析

利用ProtParam在線分析，結(jié)果表明TaWSI18-1、TaWSI18-2/TaWSI18-3和TaWSI18-4蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為22.75 kD、22.90 kD和22.67 kD，等電點(diǎn)均為6.64。正(Arg+Lys)、負(fù)(Asp+Glu)電荷氨基酸殘基數(shù)目均為31個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)分別為4.45、4.37和13.3，表明蛋白均具有穩(wěn)定性；用Prot Scale預(yù)測親疏水性，結(jié)果顯示4個(gè)蛋白多肽鏈的第35位表現(xiàn)為最低值-2.522，親水性最強(qiáng)，第179位表現(xiàn)為最高值1.078，疏水性最強(qiáng)，多肽鏈的多數(shù)位點(diǎn)值均小于0，表現(xiàn)為親水性(圖3)；GRAVY值分別為-0.771、-0.786和-0.741，表明蛋白為親水性。這些性質(zhì)與水分脅迫誘導(dǎo)性蛋白的穩(wěn)定性、親水性的特點(diǎn)相一致，有利于植物在受到脅迫時(shí)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.4小麥TaWSI18蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)及信號(hào)肽預(yù)測分析

運(yùn)用NetPhos對(duì)該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析，結(jié)果表明，TaWSI18-1、TaWSI18-2和TaWSI18-3具有5個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、10個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖4a)。TaWSI18-4存在4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖4b)。同時(shí)利用SignalP預(yù)測蛋白信號(hào)肽結(jié)果顯示，克隆的這4個(gè)蛋白均無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域及剪切位點(diǎn)。

2.5小麥TaWSI18蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析

利用TargetP 1.1 Server和PSORT在線分析小麥TaWSI18蛋白，結(jié)果表明這4個(gè)蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，通過TMHMM工具預(yù)測結(jié)果表明，這4個(gè)蛋白均無跨膜螺旋區(qū)，為非膜蛋白。

2.6小麥TaWSI18蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)HNN對(duì)TaWSI18-1、TaWSI18-2/TaWSI18-3和TaWSI18-4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明，TaWSI18-1和TaWSI18-2/TaWSI18-3蛋白的α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲的比例均為56%、7.11%及36.89%(圖5a)，TaWSI18-4蛋白α螺旋的比例為50.67%，延伸鏈為6.67%，無規(guī)則卷曲為42.67%(圖5b)。

圖3小麥TaWSI18蛋白的親水/疏水性預(yù)測

Fig.3Hydrophilic/hydrophobicity analysis of TaWSI18 protein inTriticumaestivum

2.7TaWSI18蛋白序列比對(duì)及聚類分析

利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行聚類分析表明(圖7)，小麥中的WSI18蛋白同源性最高，在不同物種間，與禾本科植物的相似性也頗高，其結(jié)果與小麥和這些物種同屬于禾木科植物的傳統(tǒng)分類相一致。其中與無芒雀麥相似性最高，與二穗短柄草次之。蕪菁與擬南芥這兩個(gè)雙子葉十字花科則形成了另外的獨(dú)立分支。聚類分析基本上代表了它們?cè)诮?jīng)典分類上的地位。

圖4小麥TaWSI18蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

Fig.4Phosphorylation sites prediction of TaWSI18 protein inTriticumaestivum

3　討　論

小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物，含有42條染色體，其DNA含有大量的核苷酸重復(fù)，本實(shí)驗(yàn)以1條電子克隆序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，克隆得到4條高度同源的WSI18基因，這與小麥龐大的基因組及其異源六倍體有很多相關(guān)性。

圖5小麥TaWSI18蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Fig.5Secondary structure of TaWSI18 protein inTriticumaestivum

通過生物信息學(xué)分析，小麥TaWSI18蛋白相對(duì)分子量較小，蛋白序列缺少Cys、Trp和Phe,富含Ala、Gly、Lys和Thr，具有穩(wěn)定性和親水性，與已證實(shí)的LEA蛋白的序列特征極為相似[6,15]。Dure L對(duì)LEA3蛋白的11個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行生物信息學(xué)分析認(rèn)為，該肽段以α螺旋形式存在[16]，圓二色譜和紅外光譜對(duì)LEA3蛋白的結(jié)構(gòu)分析表明，該類蛋白在水溶液中以無序化結(jié)構(gòu)存在，而在具有甲醇、蔗糖、甘油、乙烯、乙二醇或者脫水狀態(tài)時(shí)，則形成α螺旋結(jié)構(gòu)[17-20]，TFE和SDS也能夠促使LEA3蛋白螺旋化[20]。許多研究還發(fā)現(xiàn)，缺水和復(fù)水條件下，LEA3蛋白結(jié)構(gòu)的螺旋化與無序化之間的轉(zhuǎn)化有利于其在細(xì)胞中行使多種功能[21]。HNN和GOR對(duì)TaWSI18蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明該類蛋白主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲形式存在。TaWSI18蛋白的基本特點(diǎn)和二級(jí)結(jié)構(gòu)與LEA3蛋白類似，推測其在細(xì)胞當(dāng)中與LEA3蛋白具有相同或相似的功能。

Takahashi R等[12]發(fā)現(xiàn)，水稻的WSI18基因其蛋白序列的N端區(qū)域與LEA3蛋白高度同源。對(duì)該基因的啟動(dòng)子分析表明，其含有ABA響應(yīng)元件，利用瞬時(shí)表達(dá)研究WSI18啟動(dòng)子和缺失功能元件啟動(dòng)子，結(jié)果表明，水稻的WSI18基因受干旱和ABA脅迫響應(yīng)[13,22]。推測小麥TaWSI18基因的表達(dá)可能受到干旱和ABA等非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，目前對(duì)小麥的TaWSI18基因的功能研究甚少，小麥基因組的龐大與復(fù)雜使重要功能基因的克隆存在困難。但隨著測序技術(shù)的發(fā)展，新型大容量基因組cDNA文庫的構(gòu)建以及各種分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，基因組文庫和EST庫的建立，為基因的克隆及其重要功能研究提供便利。EST序列電子克隆基因?yàn)檫M(jìn)一步深入研究WSI18基因提供參考和奠定基礎(chǔ)。

圖6ClustalX比對(duì)分析小麥TaWSI18蛋白與LEA蛋白氨基酸序列(黑色框內(nèi)為N端保守區(qū))

Fig.6Protein sequence multi-alignment of TaWSI18 proteins and LEA protein ofTriticumaestivum

using ClustalX (The black box for N-terminal conservative region)

[1]楊獻(xiàn)光,梁衛(wèi)紅,齊志廣,等.植物非生物脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制[J].麥類作物學(xué)報(bào),2006,26(6):158-161.

[2]Kaur N, Gupta A K. Signal transduction pathways under abiotic stresses in plants[J]. Current Science, 2005,88(11):1771-1780.

[3]Shinozaki K, Yamaguchi Shinozaki K. Gene expression and signal transduction in water-stress response[J]. Plant Physiology, 1997,115(2):327-334.

[4]Dure L, Chlan C. Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination: XII. Purification and properties of principal storage proteins[J]. Plant physiology, 1981,68(1):180-186.

[5]Dure L, Galau G A. Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination: XIII. Regulation of biosynthesis of principal storage proteins[J]. Plant physiology, 1981,68(1):187-194.

[6]Battaglia M, Olvera-Carrillo Y, Garciarrubio A, et al. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins[J]. Plant Physiology, 2008,148(1):6-24.

[7]Dalal M, Kumar G S, Mayandi K. Identification and expression analysis of group 3 LEA family genes inSorghumbicolor(L.)[J]. Moench Acta Physiologiae Plantarum, 2013,35(3):979-984.

圖7系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.7Phylogenetic tree of TaWSI18 and other homologous sequences

[8]Vaseva I I, Anders I, Feller U. Identification and expression of different dehydrin subclasses involved in the drought response of Trifolium repens[J]. Journal of Plant Physiology, 2014,171(3-4):213-224.

[9]Amara I, Odena A, Oliveira E, et al. Insights into maize LEA proteins: from proteomics to functional approaches[J]. Plant and Cell Physiology, 2012,53(2):312-329.

[10]Hatanaka R, Hagiwara-Komoda Y, Furuki T, et al. An abundant LEA protein in the anhydrobiotic midge, PvLEA4, acts as a molecular shield by limiting growth of aggregating protein particles[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2013,43(11):1055-1067.

[11]張瑞越,徐兆師,李連城,等.一個(gè)新的小麥非生物脅迫誘導(dǎo)基因的克隆及表達(dá)特性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(5):875-881.

[12]Takahashi R, Joshee N, Kitagawa Y. Induction of chilling resistance bywater-stress, and cdna sequence-analysis and expression of water stress-regulated genes in rice[J]. Plant Molecular Biology, 1994,26(1):339-352.

[13]Joshee N, Kisaka H, Kitagawa Y. Isolation and characterization of a water stress-specific genomic gene, pwsi 18, from rice[J]. Plant and Cell Physiology, 1998,39(1):64-72.

[14]張德禮,孫曉靜,凌倫獎(jiǎng),等.人類SR蛋白超家族新成員—SFRS12(SRrp508)的基因克隆和特性分析[J].遺傳學(xué)報(bào),2002,29(5):377-383.

[15]Garay-Arroyo A, Colmenero-Flores J. M, Garciarrubio A, et al. Highly hydrophilic proteins in prokaryotes and eukaryotes are common during conditions of water deficit[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000,275(8):5668-5674.

[16]Dure L. A repeating 11-MER Amino-acid motif and plant desiccation[J]. Plant Journal, 1993,3(3):363-369.

[17]Dure L. Occurrence of a repeating 11-mer amino acid sequence motif in diverse organisms[J]. Protein and Peptide Letters, 2001,8(2):115-122.

[18]Goyal K, Tisi L, Basran A, et al. Transition from natively unfolded to folded state induced by desiccation in an anhydrobiotic nematode protein[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003,278(15):12977-12984.

[19]Tolleter D, Jaquinod M, Mangavel C, et al. Structure and function of a mitochondrial late embryogenesis abundant protein are revealed by desiccation[J]. Plant Cell, 2007,19(5):1580-1589.

[20]Wolkers W F, McCready S, Brandt W F, et al. Isolation and characterization of a D-7 LEA protein from pollen that stabilizes glasses in vitro[J]. Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 2001,1544(1-2):196-206.

[21]Sun X, Rikkerink E H A, Jones W T. Multifarious roles of intrinsic disorder in proteins illustrate its broad impact on plant biology[J]. Plant Cell, 2013,25(1):38-55.

[22]Zhu W N, Zhang L S, Lv H, et al. The dehydrin wzy2 promoter from wheat defines its contribution to stress tolerance[J]. Functional & Integrative Genomics, 2014,14(1):111-125.

Identification and characterization of water stress-induced TaWSI18 gene in silico cloning fromTriticumaestivumand its bioinformatic analysis

FAN Lei, CHEN Juan, ZHANG Yan-e, ZHANG Lin-sheng, ZHU Wei-ning, ZHANG Da-peng

(StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyinAridArea,CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

WSI18, a water stress-induced genes, plays an important role in plants under water deficit. Silico cloning and RT-PCR were taken to isolate four new highly homologousWSI18 genes:TaWSI18-1,TaWSI18-2,TaWSI18-3 andTaWSI18-4 (GenBank accession number: KP226849, KP226850, KP226851and KP226852) in wheat, ORFs of which are all 678 bp encoding 225 amino acids. Bioinformatic analysis showed that they are highly hydrophilic and have multiple phosphorylation sites. They are located to cytoplasm and have no transmembrane domain signal peptides, as well as no splicing sites. The proportion ofαhelix and random coil are over 90% by a secondary structure prediction. Homology comparison and phylogenetic analysis showed that TaWSI18 proteins are highly homologous to WSI18 ofBromusinermisand LEA3Brachypodiumdistachyon, sharing 94% and 70% similarities respectively. In addition, TaWSI18 proteins have conserved amino acid sequences common to LEA protein in the N-terminal region. They also have a similar character to LEA3 protein by bioinformatic analysis that TaWSI18 proteins may have the same or similar function to LEA3 protein, which lies a foundation for the future study on its function under water-stress.

Triticumaestivum; water stress;TaWSI18; silico cloning; bioinformatics

1000-7601(2016)04-0069-08

10.7606/j.issn.1000-7601.2016.04.11

2015-05-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071349)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金(20120204110033)

樊磊(1989—)，女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，研究方向?yàn)樾←溈购迪嚓P(guān)基因的研究。 E-mail: echo18735439872@163.com。

張林生(1958—)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事小麥抗旱方面的研究。 E-mail: linszhang@nwsuaf.edu.cn。

S512.1

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