早期宮頸癌前哨淋巴結(jié)中高危型HPV16/18 DNA表達(dá)的檢測(cè)及臨床意義

蔣燕明　楊嵐　弋文娟

柳州市人民醫(yī)院婦科，廣西柳州545006

早期宮頸癌前哨淋巴結(jié)中高危型HPV16/18 DNA表達(dá)的檢測(cè)及臨床意義

蔣燕明#楊嵐弋文娟

柳州市人民醫(yī)院婦科，廣西柳州545006

目的探討早期宮頸癌患者前哨淋巴結(jié)（SLN）中人乳頭狀瘤病毒（HPV）16/18 DNA表達(dá)檢測(cè)對(duì)于微轉(zhuǎn)移的臨床意義。方法選取72例早期宮頸癌患者，予患者均行廣泛性子宮切除加雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中采用染料法識(shí)別SLN的宮頸癌患者有46例，應(yīng)用基因檢測(cè)法（FQ-PCR）檢測(cè)SLN中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)情況，并分析其與各種臨床病理因素的關(guān)系；對(duì)SLN病理陰性的33例患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，分析SLN中HPV16/18 DNA陽(yáng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果46例宮頸癌患者SLN中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)者共22例，其中13例淋巴結(jié)病理陽(yáng)性患者中有10例陽(yáng)性，而33例淋巴結(jié)病理陰性患者中僅12例陽(yáng)性（P=0.013）；46例患者共檢出前哨淋巴結(jié)102枚，均用FQ-PCR法檢測(cè)HPV16/18 DNA，結(jié)果13例淋巴結(jié)病理陽(yáng)性患者檢出的37枚SLN中有29枚HPV16/18 DNA陽(yáng)性，而33例淋巴結(jié)病理陰性患者檢出的65枚SLN中僅有36枚陽(yáng)性（P=0.033）；分析46例成功檢出SLN的早期宮頸癌患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)SLN中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)僅與臨床分期有關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）；長(zhǎng)期隨訪33例SLN病理陰性的患者，發(fā)現(xiàn)HPV16/18 DNA陽(yáng)性的患者復(fù)發(fā)率高于HPV16/18 DNA陰性的患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。結(jié)論檢測(cè)宮頸癌SLN組織中HPV16/18 DNA表達(dá)可能是預(yù)測(cè)早期宮頸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可行方法。

宮頸癌；前哨淋巴結(jié)；人乳頭瘤病毒；微轉(zhuǎn)移

Oncol Prog，2016，14（6）

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響早期宮頸癌患者預(yù)后的重要因素，也是術(shù)后輔助治療的依據(jù)。研究表明，即使常規(guī)病理檢查無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高危因素存在，仍有10%～20%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這可能與腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移有關(guān)。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要致病因子，99%的患者宮頸癌組織中可檢測(cè)出HPV，其中高危型HPV16/18 DNA在宮頸癌中的檢出率約73%［1］。因此，本研究擬對(duì)早期宮頸癌患者行常規(guī)廣泛子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中進(jìn)行前哨淋巴結(jié)（SLN）識(shí)別、定位，術(shù)后對(duì)SLN和其余淋巴結(jié)及子宮附件標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)病理檢查，同時(shí)采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）技術(shù)檢測(cè)宮頸癌前哨淋巴結(jié)中高危型HPV16/18 DNA，協(xié)助發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移病灶，探討早期宮頸癌患者SLN中HPV16/18 DNA的檢測(cè)對(duì)于微轉(zhuǎn)移的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

經(jīng)柳州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2005年5月至2009年10月在柳州市人民醫(yī)院收治的早期宮頸癌患者72例，患者均經(jīng)病理診斷或?qū)m頸環(huán)形電切術(shù)（LEEP）確診后由同一組手術(shù)醫(yī)師行廣泛性子宮切除和盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中行前哨淋巴結(jié)活檢，其中有46例患者檢出前哨淋巴結(jié)。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床分期Ⅰa2～Ⅱa（分期標(biāo)準(zhǔn)參照2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO 2009）宮頸癌分期；術(shù)前檢測(cè)宮頸癌組織中HPV均陽(yáng)性；術(shù)前均未接受放療或化療；臨床病理檢查未發(fā)現(xiàn)盆腔及腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；術(shù)前患者均知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有手術(shù)禁忌證；其他惡性腫瘤史；對(duì)染料過(guò)敏等。46例患者平均年齡為（43.2± 11.6）歲，其中Ⅰ期32例，Ⅱa期14例；鱗癌38例，腺癌5例，腺鱗癌3例。

1.2方法

1.2.1SLN的定位和取材患者于術(shù)前當(dāng)日清晨，取膀胱截石位，暴露及消毒宮頸，用亞甲藍(lán)2～4 ml分4點(diǎn)分別注射到宮頸癌病灶四周，注射深度為0.5～1.0 cm。注射后行廣泛子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。術(shù)中觀察藍(lán)染淋巴結(jié)為前哨淋巴結(jié)。收集前哨淋巴結(jié)組織一半送常規(guī)病理檢查，另一半置于-20℃的生理鹽水中保存用于檢測(cè)HPV16/18 DNA（每例患者的前哨淋巴結(jié)作為一份標(biāo)本）。

1.2.2FQ-PCR測(cè)定HPV16/18 DNA引物和試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，采用美國(guó)Roche公司LightcyclerⅡ型PCR儀檢測(cè)。樣本DNA的提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增條件為93℃2 min預(yù)變性，93℃45 s，55℃60 s，共10個(gè)循環(huán)，93℃30 s，55℃45 s預(yù)變性，30個(gè)循環(huán)后直接在PCR儀上分析，由電腦自動(dòng)分析計(jì)算定量結(jié)果。每次試驗(yàn)按試劑盒提供的定量陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)設(shè)置陰性、空白對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出數(shù)據(jù)。

1.3微轉(zhuǎn)移的判定

檢測(cè)HPV16/18 DNA陽(yáng)性即判定為前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。

1.4隨訪內(nèi)容

對(duì)檢出前哨淋巴結(jié)的患者全部進(jìn)行隨訪。手術(shù)結(jié)束后，第1年每3個(gè)月隨訪1次，第2年每半年隨訪1次，第3年起每年1次或患者復(fù)發(fā)時(shí)隨訪。生存時(shí)間為手術(shù)當(dāng)日至復(fù)發(fā)或截尾日期，以年為計(jì)算單位，隨訪截止日期為2015年10月30日，將至今未復(fù)發(fā)的患者和失訪的患者統(tǒng)稱為截尾患者。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)。生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1前哨淋巴結(jié)的檢出率

72例早期宮頸癌患者有46例患者檢出藍(lán)染的前哨淋巴結(jié)，每例患者分別檢出前哨淋巴結(jié)標(biāo)本1～4枚不等，共檢出102枚，檢出率63.9%。

2.2前哨淋巴結(jié)組織中HPV16/18 DNA的檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)46例早期宮頸癌患者的前哨淋巴結(jié)中HPV16/18 DNA，結(jié)果顯示22例患者HPV16/18 DNA陽(yáng)性，其中13例淋巴結(jié)病理陽(yáng)性患者有10例HPV16/18 DNA陽(yáng)性，而33例淋巴結(jié)病理陰性患者僅有12例HPV16/18DNA陽(yáng)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。采用FQ-PCR檢測(cè)102枚前哨淋巴結(jié)標(biāo)本HPV16/18 DNA，13例淋巴結(jié)病理陽(yáng)性病例中檢出的37枚前哨淋巴結(jié)有29枚陽(yáng)性，而33例淋巴結(jié)病理陰性病例中檢出的65枚前哨淋巴結(jié)僅有36枚陽(yáng)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。

2.3前哨淋巴結(jié)組織中HPV16/18 DNA陽(yáng)性與臨床病理因素的關(guān)系

分析46例成功檢出前哨淋巴結(jié)的早期宮頸癌患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陽(yáng)性與年齡、組織類型和腫瘤直徑無(wú)關(guān)，但與臨床分期有關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034），詳見(jiàn)表1。

2.4前哨淋巴結(jié)組織中HPV16/18 DNA陽(yáng)性對(duì)早期宮頸癌患者預(yù)后及生存情況的影響

對(duì)SLB病理結(jié)果陰性的33例患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，隨訪時(shí)間6～10年，其中12例檢測(cè)前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陽(yáng)性的患者6例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率50%；而21例前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陰性的患者僅3例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率14%；復(fù)發(fā)最常見(jiàn)的部位是陰道殘端及盆腔淋巴結(jié)，其中5例患者復(fù)發(fā)于陰道殘端，3例復(fù)發(fā)于盆腔淋巴結(jié)，1例復(fù)發(fā)于直腸。前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陽(yáng)性與陰性患者的預(yù)后及生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.059，P= 0.02）。（圖1）

表1　宮頸癌前哨淋巴結(jié)中HPV16/18陽(yáng)性率與臨床病理因素的關(guān)系

圖1　前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陽(yáng)性對(duì)早期宮頸癌患者預(yù)后及生存情況的影響

對(duì)SLB病理結(jié)果陽(yáng)性的13例患者均予術(shù)后補(bǔ)充放療，隨訪時(shí)間5年，其中10例檢測(cè)前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陽(yáng)性的患者6例復(fù)發(fā)，4例在5年內(nèi)死亡；3例前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA陰性的患者僅1例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時(shí)間為術(shù)后73個(gè)月，復(fù)發(fā)率33%。

3　討論

宮頸癌是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的常見(jiàn)惡性腫瘤，每年大約有53萬(wàn)宮頸癌新發(fā)和27.5萬(wàn)死亡患者［2］，該病在中國(guó)女性中發(fā)病率居第一位。宮頸癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者愈后的重要因素。研究表明Ⅰb～Ⅱa期的宮頸癌患者若無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率可達(dá)85%～90%，而一旦有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率則降為30%～60%［3］。然而臨床中發(fā)現(xiàn)部分臨床分期較早、組織病理學(xué)檢查陰性的淋巴結(jié)患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率約20%［4］，提示可能有病理檢查未能發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移。組織病理學(xué)檢查陰性的淋巴結(jié)中HPV16/18 DNA檢出陽(yáng)性可能與未能發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移，由免疫活性細(xì)胞吞噬消化的微轉(zhuǎn)移灶及經(jīng)淋巴管運(yùn)輸擴(kuò)散的游離HPV病毒顆粒有關(guān)［5］。

1869年，Ashworth首次在外周血中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，至此微轉(zhuǎn)移的概念獲得了人們的重視，并成為研究熱點(diǎn)。目前廣泛接納的是美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）最新分期中定義的，微轉(zhuǎn)移灶直徑＜2 mm，且＞0.2 mm［6］，而轉(zhuǎn)移灶直徑≤0.2 mm則稱為孤立腫瘤細(xì)胞［7］。臨床轉(zhuǎn)移一般都由微轉(zhuǎn)移發(fā)展而來(lái)，而微轉(zhuǎn)移中只有少數(shù)患者能夠發(fā)展為臨床轉(zhuǎn)移。特異性標(biāo)志物的選擇是微轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確檢出的關(guān)鍵，宮頸癌微轉(zhuǎn)移的診斷主要在于檢測(cè)技術(shù)的敏感度和特異度。目前對(duì)宮頸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的診斷技術(shù)仍然停留在傳統(tǒng)組織病理學(xué)檢查水平，但是常規(guī)的HE染色病理檢查對(duì)于淋巴結(jié)微小的轉(zhuǎn)移病灶（＜2 mm）易漏診，而淋巴系統(tǒng)中微轉(zhuǎn)移病灶的存在，提示腫瘤已不再局限于原發(fā)病灶，而有發(fā)展為遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的可能，因此檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移比檢測(cè)外周血、骨髓中早期浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞更具有意義。雖然對(duì)所有的淋巴結(jié)均進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，可提高宮頸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移診斷的準(zhǔn)確性，但是因工作程序復(fù)雜而難以在臨床上常規(guī)開(kāi)展。有學(xué)者認(rèn)為，在80%的早期宮頸癌患者中，前哨淋巴結(jié)是唯一包含隱匿性轉(zhuǎn)移灶的淋巴結(jié)，由此這也促使人們對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究越來(lái)越集中在SLN的檢測(cè)［8］。

前哨淋巴結(jié)是原發(fā)腫瘤引流區(qū)域發(fā)生轉(zhuǎn)移必經(jīng)的第一站淋巴結(jié)，如果SLN未發(fā)生轉(zhuǎn)移，則其他淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性小于1%。理論上對(duì)于SLN無(wú)轉(zhuǎn)移的患者可免行淋巴結(jié)清掃術(shù)，從而避免了手術(shù)并發(fā)癥。宮頸癌SLN識(shí)別技術(shù)目前正處于探索階段，以SLN活檢取代淋巴結(jié)清掃術(shù)可能為今后的發(fā)展方向。用于檢測(cè)SLN微轉(zhuǎn)移的方法有免疫組織化學(xué)法、病理連續(xù)切片法、基因檢測(cè)法、基因芯片技術(shù)及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)等?；驒z測(cè)法優(yōu)點(diǎn)在于其敏感度高，而且不需要大量的切片、染色工作，故本研究采用FQ-PCR基因檢測(cè)法檢測(cè)SLN微轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于宮頸癌SLN的微轉(zhuǎn)移研究報(bào)道較少，本研究從分子水平檢測(cè)宮頸癌前哨淋巴結(jié)HPV16/18 DNA，有助于發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)不易檢出的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，從而彌補(bǔ)了病理診斷的不足。

已有研究證實(shí)HPV感染中，尤其是HPV16/18是已知的宮頸癌致病因素［9-10］，鱗狀上皮細(xì)胞一般較易感染HPV，盆腔淋巴結(jié)組織則不易感染。因此，淋巴結(jié)組織檢測(cè)HPV陽(yáng)性提示宮頸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移［11］。Coutant等［12］采用PCR法檢測(cè)了59例患者的腫瘤組織及SLN中HPV DNA表達(dá)，研究表明檢測(cè)宮頸癌患者SLN中HPV DNA可能有助于識(shí)別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果表明，早期宮頸癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)率增高，提示HPV16/18可作為淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，且FQ-PCR技術(shù)能檢測(cè)出常規(guī)病理檢查未發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移病灶，從而提高了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率，也可提高對(duì)SLN轉(zhuǎn)移診斷的敏感度及準(zhǔn)確率，降低假陰性的發(fā)生率，使SLN活檢技術(shù)在臨床廣泛應(yīng)用。因此，在對(duì)早期宮頸癌患者進(jìn)行根治術(shù)治療前，通過(guò)檢測(cè)SLN中HPV16/18 DNA或許有助于對(duì)手術(shù)方法的選擇。而常規(guī)病理檢測(cè)陰性的淋巴結(jié)患者若檢測(cè)為HPV16/18 DNA表達(dá)陽(yáng)性，應(yīng)考慮患者有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可能，術(shù)后需予輔助治療并密切隨訪。Rolla等［13］研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)中HPV DNA可能為宮頸癌早期轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，故可能用于預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)，該研究還認(rèn)為通常未經(jīng)治療的患者有這種標(biāo)志可以接受輔助治療。

本研究通過(guò)分析早期宮頸癌患者前哨淋巴結(jié)中HPV16/18 DNA檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與年齡、組織類型和腫瘤直徑無(wú)關(guān)，但與臨床分期有關(guān)，考慮可能因?yàn)榕R床分期高則腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率增加所致，進(jìn)一步提示SLN中HPV16/18 DNA陽(yáng)性與微轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系。經(jīng)對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，還發(fā)現(xiàn)SLN中HPV16/18 DNA陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)例數(shù)多于HPV16/18 DNA陰性患者，該結(jié)果與Dürst等［14］研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)SLN中HPV16/18 DNA的檢測(cè)可能有助于更準(zhǔn)確地診斷淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，并予以適當(dāng)?shù)妮o助治療，對(duì)宮頸癌的預(yù)后指導(dǎo)具有極其重要的意義。然而Lukaszuk等［15］采用PCR法檢測(cè)宮頸癌盆腔淋巴結(jié)HPV，并對(duì)患者隨訪7～8年，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)HPV陽(yáng)性與病理檢查陽(yáng)性患者的預(yù)后無(wú)明顯差別。該結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，考慮可能因?yàn)榛颊卟皇乔吧诹馨徒Y(jié)所致。對(duì)于本研究今后還需擴(kuò)大樣本量，并對(duì)所有患者繼續(xù)進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，以便明確早期宮頸癌前哨淋巴結(jié)中HPV16/18 DNA陽(yáng)性與微轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系，為早期宮頸癌患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的防治提供理論依據(jù)。

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Detection of HPV16/18 DNAexpression in sentinel lymph nodes in early stages cervical cancer

JIANG Yan-ming#YANG Lan YI Wen-juan
Department of Gynecology，Liuzhou People’s Hospital，Liuzhou 545006，Guangxi，China

ObjectiveTo investigate the expression and significance of human papillomavirus（HPV）16/18 DNA in pelvic sentinel lymph nodes（SLN）in early stage cervical carcinoma.Method72 patients with early stages cervical cancer were enrolled in the study，and were administered with radical hysterectomy and pelvic lymphadenectomy，46 cases had SLN biopsies with staining，whose HPV16/18 DNA expression were examined by FQ-PCR，besides，the correlation with the clinical pathological factors were also investigated；long-term follow-up was conducted in 33 patients with pathologically negative SLN，and the association between lymph node micrometastasis and HPV16/18 DNA was analyzed.ResultOf the 46 patients，22 patients had positive expression of HPV16/18 DNA in SLN，in which there were 10 patients with positive DNA expression among 13 cases with lymph node metastasis，while in 33 patients with negative lymph node involvement，only 12 had positive expression（P=0.013）；HPV16/18 DNA was detected using FQ-PCR，and a total of 102 SLNs were identified from the 46 patients，in the 37 SLNs of 13 cases with lymph node metastasis，there were 29 SLNs with positive HPV16/18，while in the 65 SLNs found in 33 cases of negative lymph involvement，only 36 SLNs were identified as positive（P=0.033）；after reviewing the clinical profile of 46 cases with identified SLN，it was found that，the HPV16/18 DNA positive expression was associated with the clinical stage only，which was of statistical significance（P=0.034）；in the long-term follow-up for 33 cases of negative SLN，a higher recurrence rate was observed in patients with positive HPV16/18 DNA than that in those with negative HPV16/18 DNA，which was of statistical significance（P=0.02）.ConclusionDetecting the expression of HPV16/18 DNA of SLN tissues maybe an available option for identifying SLN micrometastasis examination in early stages cervical carcinoma.

cervical cancer；sentinel lymph node；HPV；micrometastasis

R737.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.30

2016-01-08）

（corresponding author），郵箱：yanmingj@126.com