子宮內(nèi)膜癌患者血清has-miR-141的表達(dá)及其臨床意義

賈英華　韓瑛　李義　劉芝華　李淑敏#

1清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京　100021

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院2婦瘤科，3分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京　100021

子宮內(nèi)膜癌患者血清has-miR-141的表達(dá)及其臨床意義

賈英華1韓瑛2李義3劉芝華3李淑敏2#

1清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100021

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院2婦瘤科，3分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京100021

目的探討人類微小RNA-141（has-miR-141）在子宮內(nèi)膜癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集55例子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前24 h內(nèi)的血清標(biāo)本，以同期收治的12例子宮肌瘤患者術(shù)前24 h內(nèi)的血清和5例健康志愿者的血清作為對照組，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜癌患者和對照組血清中has-miR-141的表達(dá)水平，并分析has-miR-141表達(dá)水平與55例子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理危險因素的關(guān)系。結(jié)果子宮內(nèi)膜癌患者的血清has-miR-141的表達(dá)水平（2.6295±2.038）高于對照組的（1.561±0.695），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。子宮內(nèi)膜癌患者血清中has-miR-141表達(dá)與組織病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期診斷有關(guān)（P＜0.05），非子宮內(nèi)膜樣癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期+Ⅳ期患者h(yuǎn)as-miR-141的表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜樣癌、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ期+Ⅱ期患者。不同組織病理分級、年齡、CA125值患者血清中has-miR-141的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論子宮內(nèi)膜癌患者血清中has-miR-141呈高表達(dá)水平，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型及臨床分期有關(guān)。has-miR-141有可能成為一種診斷子宮內(nèi)膜癌的新型標(biāo)志物，同時有可能作為進(jìn)展期子宮內(nèi)膜癌的診斷依據(jù)，從而為子宮內(nèi)膜癌的診斷及治療提供有效幫助。

子宮內(nèi)膜癌；has-miR-141；血清標(biāo)志物

Oncol Prog，2016，14（7）

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家其發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首［1］。我國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也僅次于宮頸癌，且發(fā)病率逐年上升，同時呈現(xiàn)年輕化趨勢。盡管多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者因異常陰道出血或排液等癥狀，經(jīng)術(shù)前診刮病理可及早診斷，但仍有15%～25%的患者診斷時已屬晚期。近年晚期患者逐漸增多，預(yù)后較差，即使預(yù)后好的Ⅰa期子宮內(nèi)膜癌患者，也有10%出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［2-4］。目前臨床應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物血清CA125還不能有效地監(jiān)測子宮內(nèi)膜癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)，且不能用于子宮內(nèi)膜癌分子分型診斷［5］。血清或血漿中的miRNA可以作為一種篩查惡性腫瘤或用于腫瘤治療后隨診監(jiān)測的分子標(biāo)志物［6］。miRNA在血清和血漿中十分穩(wěn)定，在健康個體中無明顯差異，而疾病對miRNA的表達(dá)影響顯著，還有研究發(fā)現(xiàn)人類微小RNA-141（homo sapiens microRNA-141，hasmiR-141）在子宮內(nèi)膜癌組織中上調(diào)［7］。因此，本研究擬探討has-miR-141是否在子宮內(nèi)膜癌患者的血清中表達(dá)及其表達(dá)水平，并研究其與患者的臨床病理危險因素間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2011年5月至2012年12月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院收治的55例子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前血清標(biāo)本?；颊咧形荒挲g52歲（39～72歲），手術(shù)病理分期按照2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期30例，Ⅱ期7例，Ⅲ期12例，Ⅳ期6例；病理分化程度：高分化20例，中分化21例，低分化14例；子宮內(nèi)膜樣腺癌47例，非子宮內(nèi)膜樣腺癌8例（其中漿液性乳頭狀腺癌5例，透明細(xì)胞癌3例）；有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例。選取同期病理為正常子宮內(nèi)膜的子宮肌瘤患者的術(shù)前血清標(biāo)本12例，健康志愿者血清標(biāo)本5例作為對照組，中位年齡43歲（31～49歲）。

1.2主要試劑

RNA試劑盒、Quantscript RT試劑盒購自北京天根公司，SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購自Takara公司，PCR儀為美國Bio-rad公司生產(chǎn)。

1.3研究方法

1.3.1血清樣本的收集與處理取全血3.5 ml到血清真空采血管中，靜置30～60 min。常溫下離心，2000 rpm，15 min。將上層血清轉(zhuǎn)移至1.5 ml的無RNA酶的EP管中，置于-80℃冰箱冷凍。

1.3.2血清has-miR-141的提取按RNA試劑盒使用說明書提取血清總RNA。

1.3.3血清has-miR-141的定量分析①反轉(zhuǎn)錄（RT）：將10×RT緩沖液2μl、超純dNTP混合液2μl、miR-141反向引物2μl、RT酶1μl、模板RNA 11μl混合，加無酶水至20μl，徹底混勻，漩渦振蕩時間不超過5 s，簡短離心后，37℃孵育60 min，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆?。②實時熒光定量PCR：取出備用RT產(chǎn)物2μl，與SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10μl、PCR正向引物0.8μl、反向引物0.8μl、ROX Reference DyeⅡ0.4μl混合，加入滅菌蒸餾水7.0μl，經(jīng)過95℃30 s活化extaq酶，然后95℃5 s、60℃30～ 34 s，共40個循環(huán)。has-miR-141特異性PCR引物序列，正向：ACACTCCAGCTGGGCATCTTCCAGTACAGT，反向：CTCAACTGGTGTCGT GGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCAACAC；內(nèi)參照U6引物序列，正向：CTCGCTTCGGCAGCACA，反向：AACGCTTCACGAATTTGCGT；URP引物：URP-TGGTGTCGTGGAGTCG。③has-miR-141表達(dá)水平的計算方法：以U6為內(nèi)參照，測定循環(huán)閾值（CT值），計算△CT值，△CT=hsa-miR-141平均CT值-U6平均CT值，△△CT=△CT子宮內(nèi)膜癌組-△CT對照組，以2-△△CT表示has-miR-141的表達(dá)水平，設(shè)對照組血清has-miR-141的表達(dá)水平為1，以此為對照計算子宮內(nèi)膜癌患者血清has-miR-141的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理均采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行。子宮內(nèi)膜癌患者及對照組中has-miR-141的相對定量為非正態(tài)分布，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后成為-正態(tài)分布。所有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本比較采用雙尾非配對t檢驗，三樣本間比較采用one way ANOVA檢驗方法分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1has-miR-141在子宮內(nèi)膜癌患者血清中的表達(dá)情況

55例子宮內(nèi)膜癌組患者的血清has-miR-141的相對表達(dá)量為（2.6295±2.038），明顯高于17例對照組的（1.1561±0.695），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 2.9165，P＜0.05）。而對照組中的12例良性子宮肌瘤患者與5例健康志愿者的血清has-miR-141的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.9913，P＞0.05）。（表1）

表1　子宮內(nèi)膜癌組及對照組血清標(biāo)本中has-miR-141 的表達(dá)情況（±s）

表1　子宮內(nèi)膜癌組及對照組血清標(biāo)本中has-miR-141 的表達(dá)情況（±s）

注：*與健康志愿者組比較，P＞0.05；#與對照組比較，P＜0.05

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2.2血清has-miR-141的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理危險因素的關(guān)系

本研究將55例子宮內(nèi)膜癌患者按組織病理分型、病理分級、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、臨床分期、年齡（＞50歲和≤50歲）、CA125（＞35 U/ml和≤35 U/ml）進(jìn)行分組，比較各組患者血清中has-miR-141的表達(dá)水平。子宮內(nèi)膜癌患者血清中has-miR-141表達(dá)與組織病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期診斷有關(guān)（P＜0.05），非子宮內(nèi)膜樣癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期+Ⅳ期患者h(yuǎn)as-miR-141的表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜樣癌、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ期+Ⅱ期患者。不同組織病理分級、年齡、CA125值患者血清中has-miR-141的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2　子宮內(nèi)膜癌患者血清中has-miR-141 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

3　討論

CA125被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌最有價值的血清腫瘤標(biāo)志物［8］，雖然其對早期子宮內(nèi)膜癌的診斷價值不大，但是它與腫瘤的分期、組織學(xué)分級、肌層浸潤深度、子宮外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，可作為預(yù)后判斷的重要指標(biāo)之一，也可用于腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測［9-10］。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼小分子RNA，能特異性抑制靶miRNA，在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，且以往在研究腫瘤miRNA時都是對組織及細(xì)胞內(nèi)miRNA進(jìn)行研究。近年研究發(fā)現(xiàn)在血清和血漿中存在等量的miRNA，這些miRNA十分穩(wěn)定，不容易被血液內(nèi)源性和外源性RNases降解，能耐受較酸和較堿環(huán)境。此外，不同健康個體的循環(huán)miRNA表達(dá)水平相當(dāng)一致，沒有明顯個體差異，而疾病可顯著影響循環(huán)中miRNA的表達(dá)［11］。因此，近年miRNA作為潛在的腫瘤分子標(biāo)志物，尤其是血清或血漿中的miRNA在腫瘤診斷中的價值受到越來越多醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注。

miR-141屬于miR-200家族。除miR-141外，miR-200家族還包括miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-429。miR-141作為miR-200家族的成員之一，在結(jié)直腸癌、前列腺癌、膽管癌等的組織及細(xì)胞株中表達(dá)增高，提示miR-141與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［12-14］。miR-141基因在染色體上的位置為12p13.31，研究表明其功能類似于癌基因，BRD3、UBAP1和PTEN是其主要的作用靶點，BRD3、UBAP1主要與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，而PTEN是許多腫瘤的主要抑癌基因［15］，提示miR-141可能通過改變細(xì)胞的增殖和侵襲特征參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。在人類腫瘤疾病中miR-141的高表達(dá)以及針對多種重要抑癌基因的調(diào)節(jié)作用表明miR-141有望成為新的腫瘤標(biāo)志物。

Garzon等［16］采用miRNA基因芯片技術(shù)檢測出has-miR-141在子宮內(nèi)膜癌組織中上調(diào)，同時另有研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞和血清中miRNA的相關(guān)性較高，血清中腫瘤相關(guān)的miRNA來自于腫瘤組織?；谝陨涎芯?，我們猜測子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)的has-miR-141很有可能進(jìn)入到血液中并被檢測，從而有可能成為一個新的子宮內(nèi)膜癌檢測的腫瘤標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)has-miR-141在子宮內(nèi)膜癌患者血清中的表達(dá)高于對照組，提示檢測血清has-miR-141可能對子宮內(nèi)膜癌的診斷具有一定臨床意義。同時研究發(fā)現(xiàn)has-miR-141對子宮內(nèi)膜癌的組織病理分型判斷、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病情程度預(yù)測都有一定價值，尤其與子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有可能作為進(jìn)展期子宮內(nèi)膜癌的診斷依據(jù)，從而為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷及治療提供有效幫助，彌補(bǔ)CA125等其他診斷方法在早期診斷中的不足。研究還提示子宮內(nèi)膜癌患者血清has-miR-141的表達(dá)與其病理分化程度無關(guān)（P＞0.05），但這可能是由于研究中子宮內(nèi)膜癌病例數(shù)較少所致，尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

我們期待子宮內(nèi)膜癌血清miRNA表達(dá)譜的建立，根據(jù)表達(dá)譜篩選出差異明顯的一個或多個miRNA，進(jìn)行大樣本驗證，選擇表達(dá)差異最明顯的miRNA分子最終用于篩選子宮內(nèi)膜癌患者或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者，并按照個體化治療原則進(jìn)行干預(yù)治療，以期降低局部復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，改善預(yù)后。

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Expression of has-miR-141 in serum of patients with endometrial cancer and the clinical significance

JIAYing-hua1HAN Ying2LI Yi3LIU Zhi-hua3LI Shu-min2#>
1Department of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)irst Hospital of Tsinghua University，Beijing 100021，China
2Department of Gynecologic Tumor，3National Key Laboratory，National Cancer Center/Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

ObjectiveTo investigate the expression of the has-miR-141 in the serum of patients with endometrial cancer and the clinical significance.Method55 blood samples from patients with endometrial cancer，and in the same period 12 serum samples from patients with hysteromyoma were collected within 24 h before surgery，while another 5 blood samples were collected from healthy volunteers as control，then real-time quantitative PCR was used to detect the expression of has-miR-141 in those specimens，and the correlation between clinical pathological risk factors and the expression of has-miR-141 in 55 cases of endometrial cancer was analyzed.ResultThe expression of has-miR-141 in endometrial cancer patients（2.6295±2.038）was significant higher than that in control group（1.561±0.695）（P＜0.05）.The expression of has-miR-141 was closely related with pathological types，lymph node metastasis and clinical staging（P＜0.05）.The expressions in patients with non-endometrioid adenocarcinoma，lymph node metastasis and at stage III-IV were higher than those with endometrioid adenocarcinoma，without lymph node metastasis and at stage I-II.The expressions were of no statistically significant difference（P＞0.05）in patients with different histopathological stages，age and CA125 levels.Conclu-sionThe has-miR-141 is highly expressed in the serum of patients with endometrial cancer，and is closely related with lymph node metastasis，pathological types and clinical staging，making it a promising alternative predictor in diagnosis of endometrial cancer，furthermore it may play a role in determining the progression of advanced endometrial cancer，providing evidence for the early diagnosis and treatment of endometrial cancer.

endometrial cancer；has-miR-141；serum marker

R737.33

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.12

2015-10-26）

（corresponding author），郵箱：2230350570@qq.com