苯扎貝特促進小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的研究

駱楊平，鄭昭芬，傅慶華，胡勇軍，謝 瓊

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院 ，湖南省人民醫(yī)院，長沙 410002）

苯扎貝特促進小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的研究

駱楊平，鄭昭芬，傅慶華，胡勇軍，謝 瓊

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院 ，湖南省人民醫(yī)院，長沙 410002）

目的 檢測苯扎貝特干預(yù)后小鼠血脂濃度，以及血清、肝臟及糞便中3H-膽固醇占經(jīng)腹腔注射3H-膽固醇總量的百分比，探討苯扎貝特對小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的影響。方法 35只C57BL/6小鼠隨機分為5組，分別給予普通飼料、不同劑量的苯扎貝特（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）添加普通飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射經(jīng)ac-LDL及3H-膽固醇處理過的小鼠巨噬細胞懸液（0.5 mL/鼠，細胞數(shù)達5.0×106），單獨籠養(yǎng)24h后取血，酶法測定血脂；測定血清、肝臟和糞便中的3H-膽固醇含量（占注射總量的百分比）。結(jié)果 不同劑量苯扎貝特（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）干預(yù)小鼠后，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）升高并呈劑量相關(guān)性趨勢。0.75%苯扎貝特組HDL-C水平較對照組明顯增高，增幅為30.3%；血清甘油三酯（TG）水平較對照組明顯降低，降幅為40.3%。苯扎貝特干預(yù)各組（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）小鼠血清、肝臟、糞便3H的總含量顯著增多，苯扎貝特干預(yù)組（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）小鼠糞便3H-膽固醇含量較對照組增幅分別為+1.11，+1.40，+1.60，+1.70倍。結(jié)論 苯扎貝特劑量依賴性增加HDL-C和降低TG，能加速膽固醇由糞便清除，促進體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運，利于動脈粥樣硬化的防治。

苯扎貝特；膽固醇逆轉(zhuǎn)運；動脈粥樣硬化

大量臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血漿中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平與心血管疾病的發(fā)病率呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平與其呈負相關(guān)［1］。研究證實升高HDL-C水平和/或改善HDL功能能降低心血管病發(fā)病率和死亡率。膽固醇逆轉(zhuǎn)運（RCT）是是HDL抗動脈粥樣硬化的重要機制之一。苯扎貝特（Benzafibrate）是目前臨床上常用的調(diào)血脂藥物，可以明顯降低甘油三酯（TG）和升高HDL-C。苯扎貝特能有效延緩動脈斑塊的形成，降低冠心病患者的臨床終點事件，提示苯扎貝特具有抗動脈粥樣的作用［2］。苯扎貝特抗動脈粥樣硬化的機制除了與其調(diào)節(jié)血脂作用外，還具有調(diào)脂外的作用。本研究采用一種替代方法測定膽固醇的逆轉(zhuǎn)運效率，即給苯扎貝特干預(yù)的小鼠腹腔注射3H-膽固醇標記的巨噬細胞，24小時后檢測血清及糞便中氚（3H）的放射活性。測定苯扎貝特作用后小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的效率，從而了解苯扎貝特對小鼠血脂和在體膽固醇逆轉(zhuǎn)運的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與試劑 35只10周齡健康雄性C57BL/6小鼠購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，（體重22～25 g），SPF級動物，飼養(yǎng)在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)房中。RAW264.7巨噬細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。苯扎貝特藥粉由天津天士力藥業(yè)集團提供。胎牛血清購自美國HyClone公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma 公司，Ac-LDL購自中國科學(xué)院協(xié)和生化研究所，其余試劑為國產(chǎn)。

1.2 動物干預(yù) 10周齡C57BL/6小鼠35只（毛細管眶內(nèi)取血75 μL，酶法測定血脂均相似），隨機分為5組即：（1）對照組： 普通飼料飼養(yǎng)；（2）0.1%苯扎貝特組： 普通飼料添加0.1%苯扎貝特飼養(yǎng)；（3）0.25%苯扎貝特組：普通飼料添加0.25%苯扎貝特飼養(yǎng)；（4）0.5%苯扎貝特組： 普通飼料添加0.5%苯扎貝特飼養(yǎng)；（5）0.75%苯扎貝特組： 普通飼料添加0.75%苯扎貝特飼養(yǎng)。均給予飼料飼養(yǎng)，小鼠平均攝食量為4.2～4.5g/只/天，自由飲水。4周后，給小鼠腹腔注射制備好的巨噬細胞懸液（0.5 mL/鼠），之后單獨籠養(yǎng)24h。用1%戊巴比妥0.1 mL腹腔注射麻醉后摘取眼球取血于EP管中，12 000 r· min-1離心5 min，取20 μL血清進行液閃記數(shù)，計算血液總的放射活性，及占注射總量的百分比。另外，取200 μL血清行血脂檢測。

1.3 細胞培養(yǎng)及干預(yù) RAW264.7小鼠巨噬細胞培養(yǎng)條件： 37℃，5% CO2，100%濕度培養(yǎng)箱，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。制備干預(yù)液： 取所需 Ac-LDL（終濃度Ac-LDL50 μg/ mL）于15 mL離心管，加入所需H3-膽固醇（干預(yù)濃度5 μ Ci/ mL），37℃孵育30 min，再加入所需量的DMEM培養(yǎng)液，混勻，將制備好的干預(yù)液加至培養(yǎng)瓶，細胞放于37℃培養(yǎng)箱培育48 h。收獲干預(yù)好的細胞，并預(yù)備給小鼠腹腔注射： 胰酶消化細胞，細胞吹散離心后加入預(yù)冷的DMEM沖洗2遍，1000 r/m離心2 min，將細胞懸浮于不含F(xiàn)BS的DMEM，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/ mL后，細胞懸液轉(zhuǎn)移至1 mL注射器（置于冰上）；吸取剩余的細胞懸液80 μL 3次，分別放置于3個EP管中，離心后，各吸取10 μL上清，用液閃計數(shù)儀進行計數(shù)，吸除剩余上清，加入200 μL正己烷/異丙醇（3∶2），混勻，離心，吸取有機相于液閃瓶內(nèi)，真空干燥，加入液閃液進行計數(shù)（計算出細胞內(nèi)和上清液計數(shù)的比例，細胞內(nèi)應(yīng)＞95%）0.5 mL/鼠，剩余的細胞懸液分別測定細胞及上清的放射活性，保證上清所占比例少于5%，注射懸液的放射活性為6.2×106cpm。

1.4 糞便處理 收集單獨籠養(yǎng)小鼠所有糞便，用鑷子揀取小鼠糞便至EP管中并稱重，將其轉(zhuǎn)移至研缽中（理想的糞便濃度為1.6g·14 mL-1溶劑，即相當于114g·L-1），加入50%乙醇溶液溶解糞便使其濃度為114g·L-1，充分混勻1～2 min，取200 μL混勻液至20 mL液閃瓶內(nèi)，加入10 mL液閃液，振蕩混勻，過夜；第二天再振蕩液閃瓶，進行液閃記數(shù)。計算糞便總的放射活性，并計算其占注射活性的百分比。

1.5 肝臟脂質(zhì)抽提 處死小鼠，取肝臟組織用冷生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干，稱重，-20℃保存。準確稱取10mg冰凍肝組織放入勻漿器，，加入200 μL提取劑正己烷/異丙醇（3∶2），充分振搖10 min，收集上清夜，再重復(fù)抽提2遍，真空干燥，將干燥脂質(zhì)溶于2 mL閃爍液，振蕩混勻，即可作為分析樣品進行液閃記數(shù)，計算肝臟總的放射活性，及占注射總量的百分比。

1.6 血脂測定 采用常規(guī)方法測定血脂全套，包括血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密脂蛋白膽固醇（HDL-C）。按Friedewald公式計算血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）濃度LDL-C（mmol/L）=TC-HDL-CTG/2.2（當TG＜4.5 mmol/L時）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，對主要指標進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的統(tǒng)計指標均以均數(shù)±標準差表示。采用one-way ANOVA分析來進行組間比較。 P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 苯扎貝特干預(yù)后小鼠的血脂情況 不同劑量苯扎貝特干預(yù)后TC、LDL-C無明顯變化，隨著苯扎貝特劑量的增加HDL-C呈上升趨勢。0.5%、0.75%苯扎貝特組HDL-C水平較對照組明顯增高（P＜0.01），增幅分別為26.4%、30.3%，同時TG水平較對照組明顯降低（P＜0.01），降幅分別為34%、40.3%。見表1。

2.2 苯扎貝特干預(yù)后小鼠的3H -膽固醇分布情況分別測定腹腔注射同位素標記細胞24 h后血清、肝臟和糞便中的3H-膽固醇含量（占注射總量的百分比）。不同劑量苯扎貝特（0.1%，0.25%，0.5%，0.75%）干預(yù)組小鼠血清3H-膽固醇含量較對照組顯著增加，增幅分別為100%，131%，110%，115%。不同劑量苯扎貝特（0.1%，0.25%，0.5%，0.75%）干預(yù)組小鼠肝臟3H-膽固醇含量較對照組顯著增加，增幅分別為86.4%，52.3%，51.6%，52.6%，不同劑量苯扎貝特（0.1%，0.25%，0.5%，0.75%）干預(yù)組小鼠糞便3H -膽固醇含量較對照組顯著增加，增幅分別為110%，140%，160%，170%。見表2。

表1 苯扎貝特干預(yù)后小鼠的血脂變化

表2 苯扎貝特干預(yù)后小鼠的3H -膽固醇分布變化

3 討論

膽固醇逆轉(zhuǎn)運（RCT）是機體排出過多膽固醇的唯一途徑，也是高密度脂蛋白（HDL）抗動脈粥樣硬化的重要機制之一［1］。HDL能促進過多的膽固醇從外周組織轉(zhuǎn)運到肝臟，以膽汁酸的形式分泌到小腸，由糞便排出，此過程稱為膽固醇逆轉(zhuǎn)運［3］。但測定血液膽固醇至糞便的凈排除非常困難。Zhang［4］等應(yīng)用同位素3H-膽固醇標記巨噬細胞注射小鼠腹腔，通過測定血清、糞便相應(yīng)的同位素活性反映膽固醇的逆轉(zhuǎn)運效率。本研究在其方法基礎(chǔ)上建立一種替代方法測定膽固醇的逆轉(zhuǎn)運效率，即給苯扎貝特干預(yù)的小鼠腹腔注射3H-膽固醇標記的巨噬細胞，24小時后檢測小鼠血清及糞便中氚（3H）的放射活性。通過測定苯扎貝特作用后小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的效率，評估苯扎貝特對小鼠血脂和在體膽固醇逆轉(zhuǎn)運的影響。

苯扎貝特是目前常用的調(diào)脂藥物，能顯著降低甘油三酯（TG），中度降低總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），并能升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），能有效地延緩動脈粥樣硬化病變發(fā)展的進程，降低冠心病患者的臨床終點事件發(fā)生的危險性［5］。苯扎貝特的抗動脈粥樣硬化機制除了與其調(diào)節(jié)血脂如降低甘油三酯和升高HDL-C外，還具有調(diào)脂外的作用。

巨噬細胞RCT對動脈粥樣硬化的發(fā)展起著最為關(guān)鍵的作用［6］。巨噬細胞吞噬LDL后，大量膽固醇的過度堆積形成泡沫細胞，沉積于血管壁形成早期的粥樣硬化病變。因此，巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運構(gòu)是體內(nèi)過多膽固醇清除的有效途徑。通過減少巨噬細胞膽固醇的堆積，促進巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運，可抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。本實驗測定了小鼠血清、肝臟和糞便中的3H-膽固醇活性。標記的3H-膽固醇從巨噬細胞流出至血液，再由HDL轉(zhuǎn)運至肝臟，以膽汁酸鹽形式分泌，之后隨糞便排出。通過此研究方法，證實了體內(nèi)多余膽固醇的逆轉(zhuǎn)運過程。我們觀察到苯扎貝特干預(yù)后，小鼠血清中3H-膽固醇含量增加，肝臟及糞便中3H膽固醇含量增多。結(jié)果表明苯扎貝特不僅能促進巨噬細胞膽固醇流出，而且可促進體內(nèi)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運。

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血漿中HDL-C水平與心血管病事件發(fā)生率呈獨立的負相關(guān)。HDL不僅接受從巨噬細胞流出的膽固醇，而且能將膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟，因此能促進巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運［7］。苯扎貝特能使TC降低10%～20%，TG降低20%～60%，HDL-C升高10%～30%［8］。在BIP研究中，苯扎貝特使心臟病死亡、非致死性心肌梗死減少17%，這種臨床獲益可能與升高HDL-C有關(guān)［9］。本研究觀察到苯扎貝特干預(yù)小鼠4周后，小鼠血清脂質(zhì)譜發(fā)生明顯變化： 苯扎貝特劑量依賴性增加HDL-C、降低TG。結(jié)合本研究苯扎貝特促進了巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運，我們認為苯扎貝特升高HDL-C水平對促進巨噬細胞RCT有積極意義，對于延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展亦有重要意義。

通過增加HDL-C濃度、促進巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運是目前動脈粥樣硬化心血管疾病最具發(fā)展前景的治療靶點，也是評價動脈粥樣硬化治療措施的依據(jù)［1］。苯扎貝特升高HDL-C水平，促進巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

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Benzafibrate promotes reverse cholesterol transport from macrophage to feces in mice in vivo

Luo Yang-ping， Zheng Zhao-fin， Fu Qing-hua， Hu Yong-jun， Xie Qiong
（Hunan Provincial People Hospital， Changsha， 410002， China）

［Abtract］ Objective This study is to observe affect of benzafibrate on serum paraoxonase-1 activity in mice during the acute phase response and to investigate the mechanism by which it has anti-oxidized effect. Serum lipid profiles of mice were tested after bezafibrate ad ministration. The3H-cholesterol contents in serum， liver and feces in mice were measured to explore the effect of bezafibrate on reverse cholesterol transport from macrophage to feces in vivo. Methods 35 male C57BL/6 mice were rando mLy divided into four groups and treated with ordinary diet or plus different dosage （0.1%、0.25%、0.5%、0.75% W/W） of bezafibrate for 4 weeks， then these mice were injected intraperitoneally with 3H-cholesterol-labeled and cholesterolloaded raw264.7 macrophages （0.5 mL/mice， the amount of cells achieve 5.0×106）. Serum lipid profiles were deter mined by enzymatic method. Serum and liver tissues were harvested at 24h， feces were collected. And all samples were analyzed for the appearance of 3H-tracer （as the percentage of the total injected counts）. Results 1.Bezafibrate （0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）dose-dependently reduced the levels of triglyceride （TG） and increased the level of HDL-C. In contrast to the control， the level of HDL-C was increased by 30.3% while the level of TG was decreased by 40.3% in 0.75% bezafibrate groups. 2. After 24 hours intrapentoneally injected， the3H-cholesterol levels of serum and liver in the mice treated with different dosage of bezafibrate （0.1%、0.25%、0.50%、75%） were significantly higher comparing with those in the control. the feces 3H-cholesterol levels in the mice treated with different dosage of bezafibrate （0.1%、0.25%、0.5%、75%） were significantly higher by 110%，140%，160%，170% comparing with those in the control. Conclusion Bezafibrate significantly and dose-dependently reduces the levels of triglyceride （TG） and increases the level of HDL-C； Bezafibrate promotes cholesterol reverse transport in vivo， accelerates clearance of cholesterol via feces， so it will be in favor of the prevention of atherosclerosis.

Benzafibrate； Reverse cholesterol transport； atherosclerosis.

R96

A

1673-016X（2016）02-0019-04

2015-08-20

湖南省自然科學(xué)基金（13jj5020）

駱楊平，E-mail： betterluoyp@sina.com