水稻SIDP301基因的克隆與功能分析

羅茂春,陳艷菲,羅成科,陳　亮*

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建龍巖364012;2.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廈門市植物遺傳重點實驗室,福建廈門361102;3.寧夏大學(xué)環(huán)境工程研究院,寧夏銀川750021)

?

水稻SIDP301基因的克隆與功能分析

羅茂春1,陳艷菲2,羅成科3,陳亮2*

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建龍巖364012;2.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廈門市植物遺傳重點實驗室,福建廈門361102;3.寧夏大學(xué)環(huán)境工程研究院,寧夏銀川750021)

水稻是一種重要的糧食作物,也是單子葉植物研究的模式植物,其抗逆相關(guān)基因的克隆與功能分析具有重要的理論和現(xiàn)實意義．水稻SIDP301基因編碼的蛋白質(zhì)含有DUF1644家族保守結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域．實時熒光定量PCR(qRT-PCR)數(shù)據(jù)表明SIDP301基因在水稻各個組織中均有表達,其中在根和葉中表達水平較高．SIDP301基因的表達受高鹽、高溫和茉莉酸誘導(dǎo)．與對照相比,超量表達轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性不明顯,而抑制表達轉(zhuǎn)基因植株對高鹽較敏感．進一步用qRT-PCR檢測抗逆相關(guān)標記基因,結(jié)果表明P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1在超量表達轉(zhuǎn)基因植株中的表達量高于野生型植株,而在抑制表達轉(zhuǎn)基因植株中這些基因的表達變化不明顯．上述結(jié)果說明SIDP301是一個抗逆相關(guān)基因,其表達量受抑制時會降低水稻的抗逆性．

水稻;抗逆;SIDP301基因

干旱、高鹽和低溫是影響農(nóng)作物生產(chǎn)最嚴重的三大自然災(zāi)害[1]．水稻作為一種重要的糧食作物,同時也是一種理想的模式植物,其生產(chǎn)狀況直接影響著人類的糧食安全．近年來,隨著世界人口急劇增加,環(huán)境不斷惡化,糧食供需問題日益突出．提高作物對生物和非生物逆境的適應(yīng)能力一直是農(nóng)學(xué)家、生物學(xué)家關(guān)注的問題[2],其中對抗逆相關(guān)基因的挖掘目前正成為作物遺傳育種和品質(zhì)改良的研究熱點．因此,克隆抗逆相關(guān)基因并進一步研究這些基因的抗逆機制,對于有效控制作物病害、災(zāi)害的發(fā)生與發(fā)展,減少經(jīng)濟損失,保證糧食安全具有重要意義．

DUF1644家族是一類植物特有的DUF蛋白家族,公共芯片數(shù)據(jù)表明水稻多數(shù)DUF1644基因受非生物脅迫誘導(dǎo)表達,暗示該家族基因可能與水稻的非生物脅迫耐受性有關(guān)．最近的研究報道證實,DUF1644家族基因SIDP361[3]和SIDP366[4]均屬于抗逆相關(guān)基因,它們參與調(diào)控水稻的抗旱性和耐鹽性．為了進一步了解該家族中另一個基因SIDP301的生物學(xué)功能,本研究利用生物信息學(xué)手段分析了該基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了該基因在不同組織及逆境下的表達模式,進而通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得了超量表達和抑制表達SIDP301基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株,并分析了轉(zhuǎn)基因植物中抗逆相關(guān)標記基因的表達變化,以期為深入研究SIDP301基因的抗逆調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)．

1　材料與方法

1.1材料與處理

本研究以粳稻臺北309(Oryzasativassp.Japonicavar.TP309)為實驗材料,將水稻幼苗水培至四葉期,選擇長勢一致的幼苗分成三部分:1) 一部分提取葉片基因組DNA和總RNA,用于SIDP301基因的克隆. 2) 一部分進行干旱、高鹽、低溫、高溫和H2O2脅迫以及脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和赤霉素(GA3)激素處理,用于逆境表達分析．脅迫處理方法:干旱處理是將正常生長的幼苗斷水暴露在空氣中；高鹽和H2O2處理是分別將幼苗根部浸泡在150 mmol/L NaCl和1%(體積分數(shù)) H2O2溶液中；低溫和高溫處理是分別將幼苗轉(zhuǎn)移至4和42 ℃生長箱,12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng).上述5種非生物脅迫處理均在0，1，3，6，12和24 h分別取樣．植物激素處理方法:分別用100 μmol/L ABA、JA、SA、GA3和20 μmol/L 2,4-D溶液噴灑幼苗葉片,0，0.5,1,3,6和12 h后按不同處理分別取樣. 3) 剩余一部分幼苗直接移栽至盆土中并置于室外自然條件下生長．待水稻生長至開花期,分別剪取根、莖、莖節(jié)、葉、花序和葉鞘用于組織表達模式分析．所有采集樣品立即用液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

表1　本研究所用引物

Tab.1　Primers used in this study

名稱序列(5'→3')用途SIDP301-OE-SSIDP301-OE-ACACCATGGCTAGAGCTCCTTAGTATCTTACACGGGCATTAG超量表達載體構(gòu)建SIDP301-RNAi-SSIDP301-RNAi-ACACCGCTACCAGTGCTGTACCTTCCTCCATCTCCTGTGGCTTCT抑制表達載體構(gòu)建Actin-rq-SActin-rq-ATGTATGCCAGTGGTCGTACCACCAGCAAGGTCGAGACGAAqRT-PCR內(nèi)參SIDP301-rq-SSIDP301-rq-AATGGGTTCAGGAATGGTGCCATCTCCTGTGGCTTCT基因轉(zhuǎn)錄水平檢測DREB2A-rq-SDREB2A-rq-AGGAGGAATAGGAAGAAGGGAGAGCGGGAACAAGAAAGAGA基因轉(zhuǎn)錄水平檢測P5CS-rq-SP5CS-rq-AAGCCACAGATGGAGTTAGATGGTCGGTGACAAGAAGTTGAGAT基因轉(zhuǎn)錄水平檢測Rab16a-rq-SRab16a-rq-AGCTCAAGCTCGGTACAACACCTCCCATTCCATCATCCT基因轉(zhuǎn)錄水平檢測Rab16b-rq-SRab16b-rq-ACATCTTACTGATAGCAACAA-CACTGTCCATCCTCTCAAGCAAAT基因轉(zhuǎn)錄水平檢測Lea3-1-rq-SLea3-1-rq-ACGGCAGCGTCCTCCAACAGGCCTCGTCTTCGGTCATCC基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

本研究所用引物的名稱、序列及用途見表1．

1.2方法

1.2.1qRT-PCR

采用TaKaRa公司的 SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Perfect Real Time)試劑,每個模板樣品3個重復(fù),每個實驗重復(fù)2次．以Actin基因為內(nèi)參．

反應(yīng)體系(10 μL):SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(2×)5 μL,正、反向引物(5 μmol/L)各0.4 μL,ROX 參比染料(50×)0.2 μL,cDNA模板 1 μL;ddH2O 3 μL．反應(yīng)程序:95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)．

1.2.2表達載體的構(gòu)建

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取水稻基因組DNA，并以其為模板PCR擴增用于構(gòu)建抑制表達(RNAi)和超量表達(OE)載體的平末端產(chǎn)物，該產(chǎn)物再與pENTRTM/D-TOPO載體進行TOPO反應(yīng)[5]．載體懸掛序列GTGG配對含有CACC的平末端產(chǎn)物,載體上自帶的拓撲異構(gòu)酶l結(jié)合在CCCTT特異位點切除產(chǎn)物中的GTGG,使PCR產(chǎn)物插入入門載體．PCR檢測目的基因片段是否插入pENTRTM/D-TOPO載體，將含有陽性克隆質(zhì)粒的菌液送Invitrogen公司測序驗證．

1.2.3遺傳轉(zhuǎn)化

參照文獻[5]方法，取TP309的成熟種子進行愈傷組織誘導(dǎo),挑選生長旺盛的胚性愈傷組織用于轉(zhuǎn)化．用農(nóng)桿菌侵染愈傷組織,置于濾紙上晾干后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d；共培養(yǎng)的愈傷組織用無菌水清洗,晾干后置于篩選培養(yǎng)基上進行抗性篩選培養(yǎng)；將新生長的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上繼代,再轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；抗性愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)可長出苗,將分化苗轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；最后煉苗并移栽于土壤中．

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

采用CTAB法提取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株的基因組DNA,分別作為模板,用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的特異引物HYG-f(5′-GGGCGTCGGTTTCCACTATC-3′)和HYG-r(5′-CGGCTCCAACAATGTCCTGA-3′)進行PCR擴增．

采用RNAprep pure 植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟葉片的總RNA;用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄．取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板,以水稻Actin基因為內(nèi)參,qRT-PCR檢測目的基因的表達水平．

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析

將T1代轉(zhuǎn)基因植株(OE9和RNAi4)種子去殼后表面消毒(75%(體積分數(shù))乙醇處理1 min,15%(質(zhì)量分數(shù))次氯酸鈉溶液處理30 min,無菌水洗5～6次),播于含50 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上進行陽性篩選,野生型種子晚1 d消毒處理后播于不含潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)．3～4 d后挑選萌發(fā)好且長勢一致的種子(芽高度4～5 mm)分別轉(zhuǎn)移至不含和含有200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上生長,培養(yǎng)條件為:26 ℃,14 h光照/10 h黑暗．移植14 d后分別小心取出野生型和轉(zhuǎn)基因植株幼苗,觀察表型差異并拍照記錄,統(tǒng)計株高和鮮質(zhì)量．

1.2.6轉(zhuǎn)基因植株中抗逆相關(guān)基因的表達分析

分別對野生型和轉(zhuǎn)基因植株進行高鹽處理,處理方法見1.1,選擇P5CS[6-7]、DREB2A[8]、Rab16a[9-10]和Lea3-1[11]4個逆境相關(guān)標記基因,利用qRT-PCR(參考1.2.1)分析高鹽脅迫下這些基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達變化．

2　結(jié)果與分析

2.1SIDP301基因的生物信息學(xué)分析

SIDP301基因在GenBank中編號為AK108771,在RGAP 6.1(Rice Genome Annotation Project,http:∥rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫中登錄號為LOC_Os04g37530.1,位于水稻第4號染色體上．基因組序列全長2 392 bp,包含1個內(nèi)含子,長1 038 bp(位于第1 145～2 182位核苷酸),開放閱讀框區(qū)域長804 bp,編碼一個由268個氨基酸組成的蛋白,其中包含一段ZnF_C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域(位于第148～172位氨基酸殘基)和一段富含半胱氨酸的未知功能的DUF1644結(jié)構(gòu)域(位于第47～202位氨基酸殘基)．

用PLACE工具(http:∥www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)預(yù)測SIDP301基因上游1 000 bp啟動子區(qū)的順式元件,發(fā)現(xiàn)包括56個組織特異性表達元件、30個ABA響應(yīng)元件、8個GA響應(yīng)元件、11個干旱響應(yīng)元件、12個低溫響應(yīng)元件、4個脫水應(yīng)答元件等．由此預(yù)測該基因可能具有組織表達特異性,并參與多種逆境脅迫和激素的響應(yīng)．

2.2SIDP301基因的組織表達分析

通過qRT-PCR 方法檢測了SIDP301基因在水稻中的組織表達模式，結(jié)果如圖1所示：SIDP301基因在花序、莖節(jié)、莖、根、葉和葉鞘中均有表達,葉鞘中的表達量顯著高于其他組織(p<0.05),根和葉中的表達量次之,而在花序中表達量最低,其中在葉鞘中的表達量是花序的10倍以上,這些結(jié)果表明SIDP301基因的表達具有組織差異性．

不同小寫字母表示差異顯著(t-檢驗,p<0.05)．圖1　SIDP301基因的組織表達模式Fig.1The tissue expression pattern of SIDP301 gene in O. sativa

2.3SIDP301基因的逆境表達分析

圖2　SIDP301基因在非生物脅迫處理下的表達Fig.2The expression patterns of SIDP301 gene under abiotic stresses

圖3　逆境相關(guān)激素處理下的SIDP301基因表達Fig.3The expression patterns of SIDP301 gene after the treatments with stress related phytohormones

利用qRT-PCR方法分析了高鹽、干旱、高溫、低溫和H2O25種非生物脅迫條件下水稻幼苗葉片中SIDP301基因的表達模式，結(jié)果如圖2所示：SIDP301基因明顯受H2O2、高鹽和高溫誘導(dǎo)表達,表達量分別在H2O2處理12～24 h、高鹽處理6 h和高溫處理12 h達到最大值．相比于上述3種處理,干旱和低溫幾乎不影響SIDP301基因的表達．

用同樣的方法分析了ABA、SA、JA、2,4-D和GA35種逆境相關(guān)激素處理對水稻幼苗葉片中SIDP301基因表達變化的影響，結(jié)果如圖3所示：SIDP301基因明顯受JA、SA和2,4-D誘導(dǎo)表達,且表達量均在處理6 h時達到最大值;ABA處理對SIDP301基因的表達也有誘導(dǎo)作用,但效果不是很明顯;GA3處理基本不影響SIDP301基因的表達．

2.4轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，分別將構(gòu)建好的超量表達和抑制表達SIDP301基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入水稻TP309中,獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株．對陽性轉(zhuǎn)基因水稻進行qRT-PCR分析,結(jié)果顯示：目的基因SIDP301在超量表達轉(zhuǎn)基因植株(OE1～10)中的表達均高于野生型(WT)植株,在抑制表達轉(zhuǎn)基因植株(RNAi1～7)中均明顯低于WT植株,說明SIDP301基因相應(yīng)地超量表達或抑制表達(圖4)．

(a)超量表達轉(zhuǎn)基因植株;(b)抑制表達轉(zhuǎn)基因植株．圖4　T0代轉(zhuǎn)基因植株中SIDP301基因的相對表達水平Fig.4Relative expression levels of SIDP301 gene in T0 transgenic plants

2.5轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性實驗

通過對轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析,進一步了解SIDP301基因的生物學(xué)功能．挑選萌發(fā)一致的WT和轉(zhuǎn)基因水稻種子,分別轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基和200 mmol/L NaCl的高鹽培養(yǎng)基上生長．結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在正常培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因植株與WT植株的表型無明顯變化,說明SIDP301基因的超量表達或抑制表達不影響植株的正常生長發(fā)育；在200 mmol/L NaCl的高鹽培養(yǎng)基上,OE植株和WT植株的表型沒有明顯差異,但RNAi植株的長勢明顯弱于WT植株(圖5)．對轉(zhuǎn)基因植株和WT植株相應(yīng)的生長指標進行統(tǒng)計分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OE植株的株高和鮮質(zhì)量與WT植株無顯著差異,但RNAi植株的株高和鮮質(zhì)量與WT植株存在顯著差異(圖6)．這些結(jié)果說明SIDP301基因抑制表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出對高鹽脅迫耐受性的降低．

圖5　高鹽(200 mmol/L NaCl)脅迫下生長14 d的野生型和轉(zhuǎn)基因植株的表型Fig.5Growth performance of transgenic seedlings under 200 mmol/L NaCl stress after transplanting for 14 d

2.6轉(zhuǎn)基因植株中抗逆相關(guān)基因的表達分析

為了進一步說明轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高鹽脅迫下存在的表型差異,利用qRT-PCR分析4個已經(jīng)鑒定為逆境相關(guān)的標記基因(P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1)在轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中的表達情況．結(jié)果表明：P5CS、Rab16a和Lea3-1的表達量在OE植株中顯著高于WT植株,DREB2A的表達量在OE植株中略高于WT植株；然而,在RNAi植株中P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1的表達量均略低于WT植株．

3　討　論

3.1SIDP301基因的表達模式

基因表達調(diào)控是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要課題之一．了解基因表達的時空表達變化及其表達調(diào)控機制,可以更好地理解生物的生長發(fā)育規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能．DUF1644基因家族是植物中一個高度保守且功能未知的基因家族,其蛋白保守結(jié)構(gòu)域包括160個氨基酸殘基,其中含有9個高度保守的半胱氨酸殘基[12],推測為一個轉(zhuǎn)錄因子家族,該家族蛋白含有低復(fù)雜度(low complexity)區(qū)域、DUF1644結(jié)構(gòu)域、ZnF_C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(RING)．DUF1644結(jié)構(gòu)域的功能仍然未知,可能與鋅離子的結(jié)合有關(guān)．ZnF_C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域是最多也是研究最為清楚的一類鋅指蛋白,主要涉及植物的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[13]．

每個實驗重復(fù)3次,每次重復(fù)10個樣品;*表示轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株之間呈顯著差異(t-檢驗,p<0.05)．圖6　轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在高鹽(200 mmol/L NaCl)脅迫下的株高(a)和鮮質(zhì)量(b)Fig.6Plant height (a) and fresh mass (b) of transgenic plants and WT plants under 200 mmol/L NaCl stress

*表示轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株之間呈顯著差異(t-檢驗,p<0.05)．圖7　非生物脅迫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植株中的相對表達水平Fig.7Relative expression levels of the abiotic stress-related genes in transgenic plants

Li等[3]對DUF1644家族的SIDP361基因研究表明,該基因在水稻的根和葉中的表達水平較高,受高鹽、干旱和ABA誘導(dǎo)表達,但對高溫、低溫和H2O2、JA以及SA處理不敏感．Guo等[4]對同家族基因SIDP366的研究結(jié)果顯示,該基因主要在水稻的根、莖、葉、花藥中表達,并且參與了種子的成熟過程,同時該基因還受鹽、干旱、高溫、H2O2、ABA和SA脅迫的誘導(dǎo)表達．SIDP301基因與SIDP361和SIDP366同屬于DUF1644家族,它們的表達模式可能相似．為了驗證這個假設(shè),本研究對SIDP301基因的表達模式進行了分析,結(jié)果表明該基因在水稻的根和葉中的表達量高于其他組織,且其表達受高鹽、高溫、H2O2、SA、JA和2,4-D的誘導(dǎo),但不受干旱、低溫和GA3脅迫處理的影響．尤其是在受到高鹽脅迫處理后,SIDP301基因的表達量在短期內(nèi)迅速上升,最高可以達到處理前的10倍以上,可見其表達對高鹽脅迫的響應(yīng)迅速,說明該基因可能作為脅迫信號通路中較為早期的組分．結(jié)合基因上游1 kb啟動子區(qū)順式作用元件的分析,可知SIDP301基因在非生物脅迫尤其是在高鹽脅迫中發(fā)揮重要作用．

3.2SIDP301與植株的耐鹽性

SIDP301基因有一個ZnF_C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域主要涉及植物的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[14]．逆境表達模式結(jié)果顯示SIDP301的表達明顯受鹽脅迫誘導(dǎo),同時該基因啟動子上存在多個脅迫相關(guān)的順式作用元件.為確定SIDP301是否參與調(diào)控水稻的耐鹽性，對SIDP301轉(zhuǎn)基因植株幼苗進行了耐鹽性分析,發(fā)現(xiàn)超量表達SIDP301的轉(zhuǎn)基因T1代水稻的株高、鮮質(zhì)量與WT植株相比并沒有顯著變化(t-檢驗,p>0.05)，但抑制表達SIDP301的轉(zhuǎn)基因植株與WT植株相比,株高和鮮質(zhì)量均顯著降低(t-檢驗,p<0.05),表現(xiàn)出對高鹽脅迫更加敏感．有所不同的是,同一家族的SIDP361[3]和SIDP366[4]基因的超量表達轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出對高鹽脅迫的耐性增強,抑制表達植株均表現(xiàn)出對高鹽脅迫的耐性降低．

為了解釋SIDP301轉(zhuǎn)基因植株與WT植株在高鹽脅迫下存在的表型差異,本研究分析了一些逆境相關(guān)標記基因的表達變化,如:P5CS、DREB2A、Lea3-1和Rab16a．SIDP301基因的超量表達上調(diào)了P5CS基因及信號通路下游Lea3-1基因的表達,且Rab16a的表達上調(diào)尤其強烈．這些基因的表達促進了水稻體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及保護水稻細胞免受水分脅迫傷害的功能蛋白的積累,可以提高水稻對高鹽的耐受性．而SIDP301抑制表達轉(zhuǎn)基因植株中,P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1的表達量與WT植株中相比沒有顯著差異．這些結(jié)果說明SIDP301是一個抗逆相關(guān)基因，在高鹽條件下主要通過上調(diào)下游信號通路基因的表達發(fā)揮功能．

[1]曾洪學(xué),王俊.鹽害生理與植物抗鹽性[J].生物學(xué)通報,2005,40(9):1-3.

[2]MAHAJAN S,TUTEJA N.Cold,salinity and drought stresses:an overview[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2005,444:139-158.

[3]LI M,GUO L J,GUO C M,et al.Over-expression of a DUF1644 protein geneSIDP361 enhances tolerance to salt stress in transgenic rice[J].Journal of Plant Biology,2016,59:62-73.

[4]GUO C M,LUO C K,GUO L J,et al.OsSIDP366,a DUF1644 gene,positively regulates responses to drought and salt stresses in rice[J].Journal of Integrative Plant Biology,2016,58(5):492-502.

[5]王艷杰.DUF1644家族基因OsSIDP409在水稻鹽脅迫應(yīng)答中的功能分析[D].廈門:廈門大學(xué),2014：14-39.

[6]VERBRUGGEN N,VILLARROEL R,VAN MONTAGU M.Osmoregulation of a pyrroline-5-carboxy-late reductase gene inArabidopsisthaliana[J].Plant Physiology,1993,103(3):771-781.

[7]IGARASHI Y,YOSHIBA Y,SANADA Y,et al.Characterization of the gene forΔ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and correlation between the expression of the gene and salt tolerance inOryzasativaL.[J].Plant Molecular Biology,1997,33(5):857-865.

[8]MATSUKURA S,MIZOI J,YOSHIDA T,et al.Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes[J].Molecular Genetics and Genomics,2010,283(2):185-196.

[9]XIAO B,HUANG Y,TANG N,et al.Over-expression of aLEAgene in rice improves drought resistance under the field conditions[J].Theoretical and Applied Genetics,2007,115(1):35-46.

[10]GANGULY M,DATTA K,ROYCHOUDHURY A,et al.Overexpression ofRab16Agene in indica rice variety for generating enhanced salt tolerance[J].Plant Signaling & Behavior,2012,7(4):502-509.

[11]MUNDY J,CHUA N H.Abscisic acid and water-stress induce the expression of a novel rice gene[J].The EMBO Journal,1988,7(8):2279.

[12]BATEMAN A,COGGILL P,FINN R D.DUFs:families in search of function[J].Acta Crystallographica Section F:Structural Biology and Crystallization Communications,2010,66(10):1148-1152.

[13]黃驥,王建飛,張紅生.植物C2H2 型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J].遺傳,2004,26(3):414-418.

[14]黃驥,張紅生,曹雅君,等.一個新的水稻C2H2 型鋅指蛋白cDNA的克隆與序列分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,25(2):110-112.

Cloning and Functional Analysis of SIDP301 Gene in Oryza sativa

LUO Maochun1,CHEN Yanfei2,LUO Chengke3,CHEN Liang2*

(1.College of Life Sciences,Longyan University,Longyan 364012,China;2.Xiamen Key Laboratory for Plant Genetics,School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China;3.Institute of Environmental Engineering,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

Rice is an important food crop,and it is also a model plant for the study of monocotyledon.It is of important theoretical and practical significance to clone the resistance genes in rice.SIDP301 gene is cloned from rice,which encodes a protein containing a DUF1644 conservative domain and zinc finger domain.Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) data showed thatSIDP301 was expressed in all tissues and organs of rice and with higher level in roots and leaves.Its expression was induced by stresses including salt,heat and jasmonate.The salt tolerance ofSIDP301-overexpressing transgenic plants had no significant difference compared to the wild-type plants.However,SIDP301-suppressing transgenic plants exhibited hyposensitivity to salt stress compared to the wild-type plants.Through expression profiling analysis using qRT-PCR,all of the examined stress-responsive genes (eg.P5CS,DREB2A,Rab16aandLea3-1) were found to be up-regulated inSIDP301-overexpressing transgenic plants compared to the wild-type plants under salt stress,but the levels of gene expression had no significant difference in theSIDP301-suppressing transgenic plants compared to the wild-type plants.These results indicate thatSIDP301 is a stress-related gene,and the suppression of its expression was able to decrease the resistance of rice.

Oryzasativa;stress tolerance;SIDP301 gene

10.6043/j.issn.0438-0479.201604105農(nóng)業(yè)生產(chǎn)專題

2016-04-13錄用日期：2016-06-17

國家重大科技專項(2014ZX08001-008)；國家自然科學(xué)基金(31560297)

chenlg@xmu.edu.cn

羅茂春,陳艷菲,羅成科，等.水稻SIDP301基因的克隆與功能分析[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016,55(5)：672-678.

LUO M C,CHEN Y F,LUO C K,et al．Cloning and functional analysis ofSIDP301 gene inoryzasativa[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(5)：672-678．(in Chinese)

Q 356.1

A

0438-0479(2016)05-0672-07