金匱腎氣丸對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征孕鼠子代行為遺傳及多巴胺的影響

彭思涵，劉祥敏，蔣曉靜，曹 俊，龍芋君，張先庚

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·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究 ·

金匱腎氣丸對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征孕鼠子代行為遺傳及多巴胺的影響

彭思涵，劉祥敏，蔣曉靜，曹 俊，龍芋君，張先庚

背景近年來，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征(PTSD)的發(fā)生率呈上升趨勢。采用西醫(yī)對PTSD進行治療存在藥物不良反應(yīng)、療效及療程不確定性等諸多問題，對孕婦危害更大。目的觀察金匱腎氣丸對PTSD孕鼠子代生長發(fā)育、行為能力及血清多巴胺(DA)水平的影響。方法2014年7月—2015年3月，采用隨機數(shù)字表法將初次受孕的36只SD孕鼠分為空白組、PTSD組、中藥組，每組各12只。妊娠中期，PTSD組和中藥組孕鼠采用單程長時應(yīng)激法進行創(chuàng)傷應(yīng)激造模，造模后中藥組給予金匱腎氣丸飼料至分娩。子鼠出生后第5、15、25天測量身長、尾長以反映生長發(fā)育狀況；第15天進行亮盒排便測試，第26天進行糖水消耗試驗，以觀察其行為能力；第30天抽取股動脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清DA水平。結(jié)果不同處理方法、時間在子鼠身長和尾長上主效應(yīng)顯著(P<0.05)，不同處理方法和時間在子鼠身長和尾長上存在交互作用(P<0.05)。PTSD組亮盒排便測試陽性率高于空白組和中藥組，糖水偏嗜度低于空白組和中藥組(P<0.05)，中藥組和空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PTSD組血清DA水平低于空白組和中藥組(P<0.05)，中藥組和空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論金匱腎氣丸可糾正孕鼠PTSD導(dǎo)致的子代生長發(fā)育遲緩、行為異常、血清DA紊亂，其作用機制可能與先天補腎溫陽、髓海充盈、腦神充養(yǎng)有關(guān)。

腎氣丸；應(yīng)激障礙,創(chuàng)傷后；動物行為學(xué)；多巴胺

彭思涵，劉祥敏，蔣曉靜，等.金匱腎氣丸對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征孕鼠子代行為遺傳及多巴胺的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(27)：3322-3325.[www.chinagp.net] PENG S H,LIU X M,JIANG X J,et al.Impact of Jinkui Shenqi pills on behavioral genetics and dopamine of offspring from pregnant rats with post-traumatic stress disorder syndrome[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3322-3325.

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征(posttraumatic stress disorder，PTSD)的臨床核心癥狀是創(chuàng)傷性記憶的不斷闖入，導(dǎo)致患者出現(xiàn)恐懼、抑郁、逃避行為和過度喚醒的生理反應(yīng)[1]。多數(shù)文獻報道，PTSD的基本病變?yōu)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)紊亂[2-3]，主要涉及海馬、杏仁核與內(nèi)側(cè)前額葉皮層神經(jīng)環(huán)路在PTSD恐懼記憶發(fā)生和消退中的重要作用[4]。祖國醫(yī)學(xué)認為，PTSD的發(fā)病機制為驚恐傷腎、腦神失調(diào)、肝失疏泄[5]。筆者導(dǎo)師前期研究表明，補腎中藥金匱腎氣丸可糾正孕鼠恐懼致子代腎虛的生理和行為紊亂[6-7]，故本實驗采用國際PTSD科學(xué)會議確定的大鼠PTSD造模方式——單程長時應(yīng)激(single prolonged stress paradigm,SPS)法[8]對孕鼠進行造模，傷其腎氣，予以金匱腎氣丸溫補腎陽，通過對子代生長發(fā)育、行為能力及血清多巴胺(dopamine，DA)水平進行觀測，以探究金匱腎氣丸對PTSD孕鼠的調(diào)護效果。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物成都達碩生物科技有限公司提供SPF級SD大鼠雌性36只、雄性18只〔生產(chǎn)合格證號：SCXK(川)2013-24〕。90日齡左右，均無生育史，體質(zhì)量270～310 g。

1.1.2實驗藥物金匱腎氣丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)(批號Z11020147)，成分：地黃、山藥、山茱萸(酒炙)、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂枝、附子(炙)、牛膝(去頭)、車前子(鹽炙)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組2014年7月—2015年3月，將大鼠按雌∶雄=2∶1 的比例隨機合籠交配，以發(fā)現(xiàn)陰栓視為妊娠。將初次交配成功的36只孕鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組、PTSD組、中藥組，每組12只，并分別編號。體質(zhì)量：空白組(294.6±15.1)g，PTSD組(295.8±12.6)g，中藥組(297.0±11.5)g，各組體質(zhì)量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.100，P>0.05)。

1.2.2造模妊娠中期(妊娠第7～13天)：PTSD組和中藥組采用SPS法進行創(chuàng)傷應(yīng)激造模，即大鼠禁錮2 h后，立即強迫游泳20 min(水深40 cm，水溫25 ℃)。該模型與PTSD患者在行為、病理及生理學(xué)等方面相似，具良好的表面效度、結(jié)構(gòu)效度及可預(yù)測效度[9]。

1.2.3干預(yù)措施造模后至分娩：中藥組予以金匱腎氣丸飼料，按成人每公斤體質(zhì)量用量的10倍換算(體質(zhì)量 50～60 kg 的成人10 g/d，折算出體質(zhì)量 250～300 g 的大鼠為0.5～0.6 g/d)[10]，將金匱腎氣丸研碎后按上述比例加入常規(guī)飼料?？瞻捉M和PTSD組常規(guī)飼料喂養(yǎng)。3組孕鼠在預(yù)產(chǎn)期前2 d(妊娠第17天)進行分籠單獨飼養(yǎng)，以便觀測和記錄。

本文創(chuàng)新點：

(1)思路創(chuàng)新：關(guān)于創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征(PTSD)親子遺傳的研究大多為回顧性研究，本實驗開創(chuàng)性地將PTSD造模方式應(yīng)用于孕鼠實驗，并且從中醫(yī)胎教與胎損角度進行觀察和研究。

(2)方法創(chuàng)新：本實驗給予PTSD孕鼠補腎中藥，闡釋“恐傷腎”、“腎陽虛”是PTSD“胎損”基本病機。為中醫(yī)治療PTSD提供臨床思路和方法。

(3)內(nèi)容創(chuàng)新：本實驗融合了行為學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、遺傳學(xué)、創(chuàng)傷學(xué)、神經(jīng)精神病學(xué)等多學(xué)科，更深入細致地全面闡明了孕鼠恐懼應(yīng)激對子代的危害以及補腎中藥干預(yù)效果。

1.2.4觀察指標及測定分娩后，空白組子鼠162只，PTSD組子鼠156只，中藥組子鼠158只。每次檢測某指標時，每組均采用隨機數(shù)字表法單獨選取子鼠進行檢測。(1)身長和尾長測定：子鼠出生第5天，每組選取30只測其身長、尾長，于出生第15、25天重復(fù)測量。(2)亮盒排便測試[5]：子鼠出生第15天，每組選取子鼠(空白組14只，PTSD組24只，中藥組22只)進行亮盒排便測試。(3)糖水消耗試驗[11]：子鼠出生第26天，每組選取18只進行糖水消耗試驗，檢測糖水偏嗜度。(4)血清DA水平檢測：子鼠出生第30天，每組選取10只，抽取股動脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清DA水平，按說明書操作，采用DENLEY DRAGON Wellscan MK 3型酶標儀檢測吸光度，吸光度的檢測波長為450 nm。

2　結(jié)果

2.13組子鼠不同時間點身長、尾長比較對子鼠第5、15、25天身長、尾長測量數(shù)據(jù)中Mauchly球形度檢驗W值分別為0.891、0.879，P<0.05，不符合F-H條件，選取多元方差分析并參考Greenhouse-Geisser校正[12]，結(jié)果顯示：不同處理方法、時間在子鼠身長和尾長上主效應(yīng)顯著(P<0.05),不同處理方法與時間在子鼠身長和尾長上存在交互作用(P<0.05,見表1)。

表1　3組子鼠不同時間點身長和尾長比較±s，cm)

注：PTSD=創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征；與空白組比較，aP<0.05；與PTSD組比較，bP<0.05

2.23組子鼠行為能力比較

2.2.1亮盒排便測試結(jié)果3組子鼠亮盒排便測試結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PTSD組亮盒排便測試陽性率高于空白組和中藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥組和空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.2.2糖水消耗試驗結(jié)果3組子鼠糖水偏嗜度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PTSD組糖水偏嗜度低于空白組和中藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥組和空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表2　3組子鼠亮盒排便測試結(jié)果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與PTSD組比較，bP<0.05

表3　3組子鼠糖水偏嗜度比較±s，%)

注：與空白組比較，aP<0.05；與PTSD組比較，bP<0.05

2.3血清DA水平比較3組子鼠血清DA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PTSD組血清DA水平低于空白組和中藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥組和空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

3　討論

3.1孕鼠恐懼應(yīng)激對子代生長發(fā)育的影響中醫(yī)認為，先天腎精(包括父母天癸) 是胚胎發(fā)育的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，可以促進機體生長發(fā)育。孕鼠腎氣虧虛，子代肌骨筋肉生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，加上后天脾失健運，水谷精微不能濡養(yǎng)五臟，故本實驗PTSD組子鼠身長、尾長等生長發(fā)育明顯差于空白組。

表4　3組子鼠血清DA水平比較

注：DA=多巴胺；與空白組比較，aP<0.05；與PTSD組比較，bP<0.05

3.2孕鼠恐懼應(yīng)激對子代行為能力的影響腎與膀胱相表里且二者相通，膀胱的氣化賴腎氣之蒸騰，所以腎的病變可導(dǎo)致膀胱氣化失司，引起尿量、排尿次數(shù)、排尿時間的改變。大便之秘或泄與腎也密切相關(guān)：腎為水臟，火衰則水盛，反侮脾土，土不能制水，而為大便泄瀉。另外，脾運化水液，腎陽不足，火不暖土，脾陽不振，脾氣下陷，運化失職，為便為溺。

亮盒排便測試用二便粒次衡量動物情緒遺傳力大小，可作為中醫(yī)“恐傷腎”、“恐則氣下”的客觀指標之一[10,13]。本實驗中，PTSD組子鼠亮盒排便測試陽性率高于空白組，說明子代腎封藏失職，二陰失約。糖水消耗試驗常被用來測定子鼠抑郁程度以及快感降低程度[11]，本實驗PTSD組子鼠出生第26天糖水偏嗜度低于空白組，表現(xiàn)出對糖水刺激的低敏性，說明該組子鼠獎賞系統(tǒng)快感缺乏。國內(nèi)邢志強[14]對孕鼠進行21 d慢性不可預(yù)知應(yīng)激后，發(fā)現(xiàn)孕鼠糖水偏嗜度下降，本研究結(jié)果與之一致。本實驗中孕鼠PTSD造模后子代行為表現(xiàn)變差，說明子鼠高級中樞受到影響。

3.3孕鼠恐懼應(yīng)激對子代血清DA水平的影響DA與記憶密切相關(guān)，通過相應(yīng)的膜受體參與錐體外系的運動、認知、精神情緒、神經(jīng)內(nèi)分泌等生理、病理的調(diào)控過程，影響機體一般行為和精神活動[15]。RASHEED等[16]在對大鼠進行不可預(yù)見的急性或慢性應(yīng)激后，大鼠處于抑郁狀態(tài)，并且海馬、杏仁核等腦區(qū)的DA水平降低。動物和人類研究均證實，PTSD的發(fā)生與杏仁核-內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)-海馬通路DA能系統(tǒng)有關(guān)[17-18]，包括相關(guān)受體[19]、轉(zhuǎn)運體[20]和DA β-羥化酶[21]等。ENMAN等[22]采用SPS法對大鼠進行PTSD造模實驗中指出，DA系統(tǒng)病理改變和獎賞回路功能低下可導(dǎo)致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相關(guān)癥狀，并可以預(yù)測藥物濫用或者抑郁等精神障礙的出現(xiàn)。本實驗中，PTSD組子鼠血清DA水平低于空白組，DA水平的降低可引發(fā)抑郁、恐懼等情志障礙。

有研究報道，相比非PTSD患者的后代，PTSD患者后代更易患PTSD[23]，單卵雙生子經(jīng)歷創(chuàng)傷事件后PTSD發(fā)生率比異卵雙生者高[24]，提示遺傳因素在PTSD疾病發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。金匱腎氣丸為治療腎虛證的經(jīng)典方劑，其組方及藥物配伍為六味地黃丸(地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮)滋補肝腎之陰，(附子、桂枝)壯腎中之陽，二者相互為用，以陰生陽長，陽得陰助而生化無窮，從而和調(diào)氣血，通利經(jīng)脈，助脾之運化與胃之受納腐熟，聚血以養(yǎng)胎。本實驗中，中藥組予以金匱腎氣丸飼料，改善孕鼠創(chuàng)傷應(yīng)激致子代生長發(fā)育遲緩，降低子鼠亮盒排便測試陽性率并提高其糖水偏嗜度，糾正血清DA異常，表明金匱腎氣丸調(diào)護PTSD孕鼠子代腎陽虛具有較好效果，亦為臨床治療PTSD提供新思路和新方法。

作者貢獻：彭思涵、劉祥敏、張先庚進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責(zé)；蔣曉靜、曹俊、龍芋君進行實驗實施、評估、資料收集；張先庚進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Impact of Jinkui Shenqi Pills on Behavioral Genetics and Dopamine of Offspring from Pregnant Rats with Post-traumatic Stress Disorder Syndrome

PENGSi-han,LIUXiang-min,JIANGXiao-jing,CAOJun,LONGYu-jun，ZHANGXian-geng.

ChengduUniversityofTCM，Chengdu610075，ChinaCorrespondingauthor:ZHANGXian-geng,SichuanNursingVocationalCollege,Chengdu610100，China;E-mail：xiangengzhang666@sina.com

BackgroundThe incidence rate of post-traumatic stress disorder (PTSD) syndrome has increased in recent years.Western medicine treatment of PTSD leads to adverse drug reactions,uncertainties of curative effect and treatment,and other problems that are especially harmful for pregnant women.ObjectiveTo observed the effect of Jinkui Shenqi pills on growth and development,behavior capacity,and serum dopamine (DA) level of offspring from pregnant rats with post-traumatic stress disorder (PTSD).MethodsFrom July 2014 to March 2015,36 pregnant rats were divided into:control group (CG),PTSD group (PG),and herbal group(HG) by random number table method.There were 12 rats in each group.The pregnant metaphase rats in PG and HG were transformed to PTSD models via single-prolonged stress (SPS),which has been extensively applied in PTSD research.After the models were established,the rats in HG were given Jinkui Shenqi pills.The body and tail lengths of rats were measured 5,15,and 25 days after birth to observe growth and development status.Behavioral ability was evaluated by different behavioral tests at different times,including light box defecation test (15 days after birth) and saccharose consumption test (26 days after birth).Femoral arterial blood of the offspring was sampled on the 30 days after birth,and serum dopamine level was detected by enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA).ResultsThere was significant effect on body length and tail length among different treatment ways and time (P<0.05),there was interaction on body length and tail length between treatment ways and time (P<0.05). The positive rate in light box defecation test of PG was higher than that of CG and HG (P<0.05),whereas the sucrose preference rate in PG was significantly lower than that of CG and HG(P<0.05).However,no statistically significant differences were observed between CG and HG (P>0.05).The serum level of dopamine in PG was lower than that in CG and HG (P<0.05),but no statistically significant differences were observed between CG and HG (P>0.05).ConclusionJinkui Shenqi pills could alleviate growth retardation,abnormal behavior,and serum dopamine level disturbance of the offspring caused by PTSD-induced fetal injury.The regulation of offspring neurobiology disorder can be achieved by supplying kidney essence,thereby warming and invigorating the kidney yang,filling the marrow,and nourishing the cerebral spirit.

Shenqi pill;Stress disorders,post-traumatic;Ethology；Dopamine

國家自然科學(xué)基金資助項目(81373710)；四川省教育項目基金(13ZA0273)

610075 四川省成都市，成都中醫(yī)藥大學(xué)(彭思涵，劉祥敏，蔣曉靜，曹俊，龍芋君)；四川護理職業(yè)學(xué)院(張先庚)

張先庚，610100 四川省成都市，四川護理職業(yè)學(xué)院；E-mail：xiangengzhang666@sina.com

R 749.72

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.013

2016-02-10；

2016-07-15)