龍須菜果孢子的X射線誘變及優(yōu)勢突變體的篩選*

魏惠惠， 隋正紅， 王津果， 杜青偉， 商二磊，米　萍， 闕　州

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

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龍須菜果孢子的X射線誘變及優(yōu)勢突變體的篩選*

魏惠惠， 隋正紅??， 王津果， 杜青偉， 商二磊，米萍， 闕州

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

采用X射線作為誘變源，對龍須菜進行輻照誘變，驗證了果孢子作為誘變材料相對于龍須菜藻尖的優(yōu)越性，并確定了最佳誘變劑量-90 Gy。約107～108個野生型龍須菜果孢子經(jīng)過90 Gy的X射線輻照，獲得了約106～107株成活的龍須菜幼苗。將誘變存活幼苗平均分成2組，分別對其進行耐高溫和低磷速生品系的篩選。經(jīng)過幼苗期和成熟期的雙重篩選，初步獲得了1株耐高溫突變株和3株低磷速生突變株。分別命名為WT-3和WLP-1、WLP-9、WLP-22。其中，WT-3為經(jīng)歷了41和35 ℃高溫脅迫后仍存活并保持良好生長的藻株；WLP-1、WLP-9、WLP-22在10-2mg/L的磷濃度水平下相對野生藻株具有顯著的生長優(yōu)勢。本研究提供了一套可行有效的龍須菜誘變篩選技術(shù)，同時，篩選出的優(yōu)良藻株為下一步遺傳研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供了材料。

X射線誘變；耐高溫；低磷；速生；龍須菜

引用格式：魏惠惠， 隋正紅， 王津果, 等. 龍須菜果孢子的X射線誘變及優(yōu)勢突變體的篩選[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 46(9): 50-58.

WEI Hui-Hui, SUI Zheng-Hong, WANG Jin-Guo, et al. X-ray-irradiation mutation on carpospores ofGracilariopsislemaneiformisand screening of mutants with superior traits[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(9): 50-58.

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)是一種具有重要經(jīng)濟價值的大型海洋紅藻，其瓊膠含量高，所產(chǎn)瓊膠被廣泛應(yīng)用于各個生產(chǎn)領(lǐng)域；龍須菜還是鮑魚養(yǎng)殖的重要餌料，富含牛磺酸和谷氨酸[1]，能夠有效誘食并且有提高鮑魚肉質(zhì)的作用；對龍須菜的多糖及藻膽蛋白的諸多研究表明，龍須菜還具有抗氧化、抗病毒等多種生物學(xué)作用；龍須菜養(yǎng)殖可以有效降低海水中N、P含量[2]，防止赤潮的發(fā)生，具有重要的生態(tài)價值。龍須菜自1980年代以來，被人工栽培的規(guī)模逐漸擴大，其經(jīng)濟價值和生態(tài)效益得到了有效的發(fā)揮，促進了我國海水養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展[3]。

野生龍須菜的最適生長溫度是12～23 ℃，主要分布在我國山東半島潮間帶。1998年，張學(xué)成等[3]通過化學(xué)誘變的方法，選育出耐高溫品系981，使得龍須菜的耐受溫度提高到26 ℃，在南方海域得到廣泛推廣。但是，品系981的耐受溫度雖然相對野生型有顯著提高，但在南方海域仍然不能成功渡夏。因此，更加耐高溫的龍須菜品系亟待被選育出來。

磷是植物生長過程中不可或缺的元素之一，磷缺乏會導(dǎo)致龍須菜產(chǎn)量降低、質(zhì)量下降。Atkinson和 Smith[4]報道，海洋大型紅藻生長環(huán)境中磷元素含量相對較低，碳、氮、磷的比例一般保持在550∶30∶1這樣1個平均比值左右。并且，我們通過栽培實踐以及不同海區(qū)海水氮磷含量的累計測量，發(fā)現(xiàn)很多海區(qū)磷含量明顯偏低，甚至?xí)椭?.01 mg/L以下。研究表明，龍須菜生長所需的飽和磷濃度約為0.62 mg/L[5]，而為了防止赤潮等海水富營養(yǎng)化現(xiàn)象的發(fā)生，根據(jù)我國海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，海水的磷含量范圍應(yīng)為≤0.045 mg/L[6]，這個磷濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于龍須菜生長所需。并且，通過添加磷肥的方式來提高其產(chǎn)量，必然會對海域的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面的影響。因此，提高藻體本身的低磷耐受能力，是解決龍須菜因低磷而產(chǎn)量下降問題的重要途徑。

本實驗首次使用X射線輻照的方法，對龍須菜果孢子進行誘變，進一步篩選獲得具有耐高溫和低磷速生特性的龍須菜抗逆突變體。本文目的在于為龍須菜的優(yōu)良品系選育提供一條新的途徑，探索出合適的誘變條件和篩選方法，同時也為了選育出高抗逆性的龍須菜品系，將其應(yīng)用于生產(chǎn)，解決龍須菜栽培領(lǐng)域遇到的問題。

1　材料與方法

1.1 實驗材料

實驗中所用的龍須菜為采自青島湛山灣的野生四分孢子體和成熟的雌配子體。

1.2 材料的培養(yǎng)和誘變材料的獲得

將采集的新鮮材料先用滅菌水沖洗并用毛刷刷去藻體表面的雜藻。然后置于500 mL錐形瓶中培養(yǎng)，采用Pro培養(yǎng)基[7]，培養(yǎng)條件為(20±1) ℃，光強30 μmol/(m2·s)，光暗周期12 L∶12 D，每周更換一次培養(yǎng)基。該培養(yǎng)條件為龍須菜的正常培養(yǎng)條件，用于之后果孢子幼苗的培養(yǎng)。

一方面，選取一株長勢良好且分支較多的四分孢子體藻株，切取1 cm長的藻尖，用于之后X射線誘變。另一方面，將成熟的雌配子體切成2 cm的藻段，置于六孔板中培養(yǎng)，每個孔中加入10 mL含有Pro培養(yǎng)基的滅菌海水，且保證每個六孔板中藻體的囊果數(shù)相同。采用果孢子放散最佳培養(yǎng)條件[8]：溫度(20±1) ℃，光強15 μmol/(m2·s)，光暗周期12 L∶12 D，每周更換1次培養(yǎng)基。定期在顯微鏡下觀察，待果孢子大量放散。

1.3 藻尖和果孢子的X射線誘變

分別用1 cm的藻尖和放散剛附著的果孢子進行X射線誘變，使用的儀器為青島四零一醫(yī)院的VARIAN 21EX醫(yī)用直線加速器(Varian Medical，美國)，采用能量為6 MV的X射線，劑量率設(shè)定為6 Gy/min。Gray(Gy)為輻射劑量的絕對單位，1Gy=1 J/kg，即每1千克受照物質(zhì)吸收1焦耳核輻射能時的輻射劑量。輻射總劑量設(shè)置7個梯度，分別為0、15、30、45、60、75、90 Gy。每個劑量設(shè)置3個平行。材料經(jīng)過X射線輻照后暗培養(yǎng)24 h，之后恢復(fù)至正常條件培養(yǎng)。對于藻尖，每周更換1次培養(yǎng)基，2周后統(tǒng)計致死率；對于果孢子，誘變1周后在倒置顯微鏡下統(tǒng)計果孢子的存活數(shù)目，進而計算出各個X射線劑量梯度對龍須菜果孢子的致死率。致死率的計算方法如下：致死率/%=(1-存活孢子數(shù)目/總孢子數(shù)目)×100%[9]。統(tǒng)計方法：采用10倍物鏡(×200)，總致死率為隨機20個視野的平均值。

1.4 耐高溫藻株的篩選

1.4.1 耐高溫篩選溫度的確定參照付峰等[9]，略加修改。將未經(jīng)誘變的野生果孢子培養(yǎng)在(20±1) ℃的培養(yǎng)箱中，光強15 μmol/(m2·s)，光暗周期12 L∶12 D，每周更換1次培養(yǎng)基。待其長成2～3 mm長的小苗后，置于38、39、40、41、42 ℃5個溫度梯度的水浴鍋中熱脅迫30 min。之后在正常培養(yǎng)溫度下暗培養(yǎng)12 h，再恢復(fù)光照培養(yǎng)。1周后統(tǒng)計存活率，得到致使野生型小苗全部死亡的最低溫度，用于之后誘變小苗的耐高溫篩選。

1.4.2 突變體高溫脅迫篩選將誘變后的果孢子培養(yǎng)至2～3 mm長的幼苗期，培養(yǎng)條件同1.4.1，置于上述實驗確定的篩選溫度，高溫水浴脅迫30 min。存活下來的小苗在海上掛養(yǎng)成熟后，進行第二次篩選，每株藻稱取0.1 g藻段，每株設(shè)置3個平行，置于35 ℃的光照培養(yǎng)箱中脅迫培養(yǎng)72 h[9]。幼苗期和成熟期兩次熱脅迫后均得以存活的藻株被挑選出來。

1.5 低磷速生藻株的篩選

1.5.1 低磷篩選濃度的確定選取120株未經(jīng)誘變并長至1 cm長的野生型幼苗，均分為4組，培養(yǎng)于添加了去磷Pro培養(yǎng)基的海水中，不同組添加磷的終濃度分別為0、0.01、0.1和1 mg/L。每周測量1次幼苗長度，連續(xù)測量6周。觀察小苗生長狀態(tài)和生長速率，從而獲得最佳的低磷篩選濃度。

1.5.2 突變體低磷脅迫篩選待誘變后的果孢子的存活率穩(wěn)定后，將其與同時期的野生果孢子共同在上述實驗得到的低磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)。正常Pro培養(yǎng)基培養(yǎng)的小苗為對照組，海水中磷的終濃度約為1 mg/L。待小苗的平均長度長至2 cm左右，統(tǒng)計測量幼苗長度，得到野生型最大苗長，挑選出大于該苗長的誘變組小苗，同野生小苗一同掛至海上培養(yǎng)成熟后，進行第二次篩選。每株稱取0.5 g藻體，設(shè)置3個平行，野生小苗為對照組。在低磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(20±1) ℃，光強30 μmol/(m2·s)，光暗周期12 L∶12 D，每周更換一次培養(yǎng)基。30 d后稱量藻體的質(zhì)量，進而計算出日平均生長速率(Specific Growth Rate，SGR)，先獲得野生型最大日平均生長速率，誘變組中大于該速率的藻株被認(rèn)定為低磷速生藻株。日平均生長速率的計算公式[9]如下:

SGR=100×(lnWt-lnW0)/t，

式中：SGR為日平均生長速率/%·d-1，Wt為第t天的藻體濕重/g；W0為藻體初始濕重/g。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以上實驗均設(shè)置3個平行，結(jié)果為3個平行的平均值。采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，差異顯著性水平:P=0.05。

2　實驗結(jié)果

2.1 X射線誘變材料和誘變劑量的確定

X射線誘變預(yù)實驗分別用2種誘變材料——藻尖和果孢子，在0、15、30、45、60、75、90Gy7個劑量梯度下進行。7個劑量梯度的X射線對龍須菜藻尖均沒有表現(xiàn)出明顯的致死效應(yīng)，僅個別藻尖端部變白，但90Gy組藻尖存活率仍為100%(見圖1)。而果孢子則對X射線輻照比較敏感，45Gy時致死率為42%，90Gy時致死率為91%。根據(jù)2種材料的X射線誘變預(yù)實驗結(jié)果，選用果孢子作為誘變材料。

(A.輻照后第1天；B.輻照后第7天；C.輻照后第21天(標(biāo)尺：2cm)。A.1stdayafterirradiation；B.7thdayafterirradiation；C.21stdayafterirradiation(scalebars=2cm).)

圖1X射線(90Gy)輻照后龍須菜藻尖的形態(tài)變化

Fig.1ThemorphologicalchangeofstemtipsofGp. lemaneiformisafterX-ray(90Gy)irradiation

根據(jù)不同劑量水平對果孢子的致死率，得到誘變劑量與致死率的線性關(guān)系(見圖2)。通過計算得出，X射線輻照的半致死劑量約為48Gy，致死率為90%時輻照劑量約為90Gy。為了得到更高的正突變率，本實驗選定90Gy作為后續(xù)誘變的輻照劑量。

圖2　不同X射線輻照劑量對龍須菜果孢子的致死率

2.2 誘變后小苗耐高溫篩選溫度的確定

野生的四分孢子體幼苗在高溫水浴中脅迫30min后，結(jié)果顯示，在41 ℃時，小苗存活率為0(見圖3)。以導(dǎo)致野生型小苗全部死亡的最低處理溫度，即41 ℃，作為突變藻株的耐高溫篩選溫度。

2.3 龍須菜果孢子的X射線誘變及誘變后的形態(tài)變化

將放散后剛附著的果孢子(每個六孔板中約有105個孢子，共200個六孔板)按照90Gy的劑量進行X射線輻照。與未作處理的果孢子相比，輻照后的果孢子分裂速度變慢，發(fā)育明顯滯后(見圖4)。并且分裂過程中形狀不規(guī)則，出現(xiàn)非正常發(fā)育時期——三細(xì)胞期(見圖B1)。

圖3　不同溫度下野生型龍須菜果孢子幼苗的存活率

(A.1～3分別為正常果孢子發(fā)育第3、6、9天;B.1～3分別為誘變后果孢子發(fā)育第3、6、9天(標(biāo)尺：20μm)。A.1～3is3rd, 6th, 9thdaywithouttreatment,respectively;B.1～3is3rd, 6th, 9thdayaftertreatment,respectively(Scalebars=20μm).)

圖4X射線誘變和未經(jīng)處理的龍須菜果孢子發(fā)育情況對比(×400)

Fig.4ThedevelopmentalcomparisonofthecarposporesofGp. lemaneiformistreatedwithandwithout(×400)X-rayirradiation,respectively

2.4 耐高溫藻株的篩選

將長至2～3mm(約4周后)的小苗置于41 ℃水浴中高溫脅迫30min，脅迫后初期并沒有明顯的形態(tài)變化，隨著時間的推移，小苗顏色逐漸變淺。在熱脅迫后第3天，小苗呈現(xiàn)出明顯的淺紫紅色，在第7天大部分小苗全部變?yōu)榘咨?見圖5)，而有些小苗則維持或部分維持紅褐色從而存活下來，這些存活下來的小苗被初步認(rèn)定為耐高溫小苗。

耐高溫小苗掛養(yǎng)成熟后，采用在35 ℃培養(yǎng)箱中脅迫培養(yǎng)72h的方法進行2次篩選，熱脅迫后一些藻株從局部開始逐漸變綠，進而整株藻體死亡，而另一些藻株則僅尖端或小部分變綠，剩余藻體很快形成了新的分支，存活下來。經(jīng)過2次篩選后存活下來的藻株，被認(rèn)定為耐高溫藻株，其中一株分支較多，且有顯著生長優(yōu)勢，命名為WT-3。

圖5　經(jīng)41 ℃熱脅迫30 min后第1、3、7天的龍須菜果孢子幼苗(標(biāo)尺：1 cm)

2.5 低磷速生藻株的篩選

4個磷濃度組的幼苗連續(xù)6周的長度測量結(jié)果(見圖6)顯示，添加正常Pro培養(yǎng)基(1mg/L)的小苗，生長速度顯著高于其他3組(P<0.05)；0.1mg/L組居中，顯著高于0.01、0mg/L組(P<0.05)。后2組長勢相似，差異不顯著(P>0.05)。由于用于幼苗培養(yǎng)的海水中本身磷濃度約為0.02～0.04mg/L，因此后2組培養(yǎng)液的磷終濃度均為10-2mg/L水平，實驗結(jié)果與其一致。由圖可知，海水磷濃度在10-2mg/L水平時，龍須菜生長速度緩慢，生長明顯受到抑制，因此該水平的磷濃度可用于低磷篩選。另外，為了避免天然海水中磷濃度的不穩(wěn)定性對藻體生長帶來的影響，實驗選擇添加磷終濃度0.01mg/L作為后續(xù)低磷速生藻株篩選濃度。

圖6　4個磷濃度組龍須菜幼苗的生長

將同時放散的等量的(100個六孔板)經(jīng)誘變和未經(jīng)誘變的果孢子采用低磷培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)。約16周后，果孢子長成了2cm左右的幼苗，測量統(tǒng)計幼苗長度，統(tǒng)計結(jié)果(見圖7)顯示：誘變組相對于未誘變組小苗，平均長度較小，標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。另外，測得野生小苗的最大長度約為2.4cm，將誘變組中長于2.4cm的小苗挑出，共27株，其中最大長度達到3.6cm。

將初篩得到耐低磷小苗掛至海上培養(yǎng)成熟后。每株取0.5g，設(shè)置3個平行，另外30株野生小苗為對照組，在實驗室中進行低磷培養(yǎng)，30d后計算日平均生長速率。結(jié)果顯示(見圖8)，野生組最大生長速率為2.21%，誘變藻株中，有3株日平均生長速率分別為2.79%、2.72%、3.01%，顯著高于野生組的最大速率(P<0.05)，被分別命名為WLP-1、WLP-9、WLP-22。

圖7　誘變和未經(jīng)誘變龍須菜小苗16周時長度比較

圖8　龍須菜藻株在實驗室的日平均生長速率比較

3　討論

3.1 誘變材料

江蘺的輻照誘變大多采用Co60-γ射線或者紫外線，用于輻照誘變的材料也根據(jù)誘變源的不同而有所差異。針對特定的誘變源，選擇合適的誘變材料，能夠有效提高誘變效率。Shen等[10]用紫外線輻照細(xì)基江蘺(Gracilaria tenuistipitata)2mm厚的藻段，對其進行誘變育種。而龍須菜中常用的誘變材料有2種，藻尖和放散的孢子。張學(xué)成等[11]報道幼嫩的藻尖常被用作龍須菜紫外誘變的材料。而孟琳[12]在利用Co60-γ射線誘變龍須菜時，選用的材料也為20～30mm長的藻尖。付峰[13]則選用了龍須菜的果孢子和四分孢子對其進行紫外誘變。

本實驗選取了2種材料進行X射線輻照，即龍須菜藻尖和剛附著的果孢子，從而獲得更適合于X射線誘變的材料。預(yù)實驗的結(jié)果表明，果孢子相對于藻尖而言對X射線具有更高的靈敏度，在誘變劑量為90Gy時致死率已達到90%，而藻尖在90Gy時，只有部分尖端變白，并無藻尖完全死亡的情況。放散后剛附著的果孢子作為誘變材料有其特有的優(yōu)點，由于孢子只有在接觸六孔板底部時才能附著，所以用于輻照的果孢子均平鋪在六孔板底面，不存在孢子重疊的現(xiàn)象，能保證所有孢子均勻接受輻照，且輻照距離相等；放散后剛附著的果孢子沒有厚實的多糖細(xì)胞壁，X射線更容易穿透，進而發(fā)揮效應(yīng)；其為單細(xì)胞，突變發(fā)生后能夠隨著細(xì)胞分裂分化在完整藻株中表現(xiàn)出來，而藻尖則可能會由于射線輻照的不均勻性而形成嵌合體。另外，孢子制備方便，可以大量獲得，且成活率高，能夠為X射線誘變提供大量的材料，提高了正突變株產(chǎn)生的幾率。

3.2 誘變方法

輻射誘變被普遍應(yīng)用于高等植物、藻類和微生物的育種研究，其具有突變譜較廣、突變率高等優(yōu)勢。不同的物理射線會對生物體產(chǎn)生不同的輻射生物效應(yīng)[14]。X射線是一種電離輻射，具有強的穿透能力，照射在分子上能夠?qū)⒎肿又械碾娮訐舫?，產(chǎn)生離子，即產(chǎn)生電離作用，其發(fā)生在DNA分子上能夠誘發(fā)基因突變。

X射線在高等植物和微生物誘變育種中應(yīng)用廣泛，而在藻類尤其是大型藻類中應(yīng)用較少。黃海水產(chǎn)研究所和中科院海洋研究所[15-16]用X射線進行輻照誘變，再經(jīng)篩選和自交，得到了干物質(zhì)含量高且耐高溫的海帶品種“1170”。蔣霞敏等[17]以雨生紅球藻作為誘變材料，從超微結(jié)構(gòu)變化的角度研究了X射線的致突變效應(yīng)，推測X射線輻照引起的細(xì)胞核、線粒體、葉綠體等細(xì)胞器的損傷，可能是造成突變的原因。

誘變育種被廣泛應(yīng)用于龍須菜優(yōu)良品系的選育。包括物理和化學(xué)誘變2種手段，常用的化學(xué)誘變劑有N-甲基-N′-亞硝基胍(MNNG)和甲基磺酸乙酯(EMS)等。張學(xué)成等[3, 18]用MNNG對龍須菜進行誘變，先是獲得了多種色素突變體，為龍須菜的色素組成研究提供了材料；后又結(jié)合羥脯氨酸以及高溫脅迫篩選，選育出了耐高溫良種—品系981。Zhang等[19]利用EMS對龍須菜進行誘變，獲得了色素突變體，為龍須菜遺傳研究提供了基礎(chǔ)。孟琳等[12]利用MNNG對品系981的藻尖進行誘變，再對其進行高溫篩選，獲得了耐高溫品系07-2，與品系981相比，具有更好的耐高溫性、更快的生長速率和更高的瓊膠含量。常用的物理方法主要是紫外線輻照誘變，付峰等[13]用紫外線誘變龍須菜，通過高溫篩選獲得了兩株耐高溫藻株，生長速率明顯高于品系981和野生型，且通過對其熱脅迫下耐高溫指標(biāo)的測定，證明其相對于品系981和野生型具有顯著的耐高溫優(yōu)勢。

X射線具有比紫外線更強的穿透力，其致突變效應(yīng)也在多種植物的育種研究中得到證實。但其在龍須菜的誘變育種中一直未被采用。在本實驗中，利用醫(yī)用電子直線加速器產(chǎn)生的X射線對龍須菜釋放剛附著的果孢子進行輻照誘變，更加安全高效，果孢子相對傳統(tǒng)的誘變材料而言，具有其特有的優(yōu)點。且實驗結(jié)合高溫和低磷篩選獲得了具有耐高溫和低磷速生優(yōu)良性狀的藻株，結(jié)果顯示了X射線輻照方法誘變果孢子的可行性。

3.3 誘變后果孢子的形態(tài)變化

孢子的正常發(fā)育過程一般為單細(xì)胞期→二細(xì)胞期→四細(xì)胞期→多細(xì)胞盤狀體→直立體→小苗。誘變后的果孢子在發(fā)育過程中出現(xiàn)了為數(shù)不少的三細(xì)胞期，發(fā)育到多細(xì)胞階段，大多呈現(xiàn)為形狀不規(guī)則的細(xì)胞團塊。推測X射線對細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生了損傷或改變，以致細(xì)胞分裂和發(fā)育出現(xiàn)異常。對不規(guī)則分裂的果孢子進行跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)部分不規(guī)則細(xì)胞團塊發(fā)育遲緩，漸而凋亡，而另一部分則通過細(xì)胞的分裂修整，形成了基部為同心圓或接近圓形的盤狀體。有關(guān)誘變對細(xì)胞形態(tài)及發(fā)育進程的影響及其調(diào)控過程是有待于深入研究的課題。

3.4 耐高溫突變體的篩選

建立起一套有效的突變體篩選的方法和技術(shù)，是植物誘變育種中的關(guān)鍵步驟。對于耐高溫突變株的篩選，一般分為一步法和多步法。由于多步法需要長期逐步地篩選，耗時長、勞動強度大，許多研究者比較傾向于一步篩選法，將植株或藻株培養(yǎng)于大于其最適生長溫度的高溫中，挑選出在該溫度下能夠存活或者生長快速的藻株。黃瑞芳等[20]利用連續(xù)7d的夏季強光高溫(42～52 ℃)篩選經(jīng)紫外誘變的巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，獲得了一株耐高溫的突變株。Ong等[21]通過在40 ℃高溫培養(yǎng)篩選誘變后的小球藻，獲得了兩株耐高溫突變體。

另外，植株在不同發(fā)育階段可能會顯示出不同的耐受性[22-23]。樊恭炬[24]等通過實驗和調(diào)查研究，推測龍須菜幼株比成熟藻體更耐高溫。于是，本實驗在龍須菜幼苗期和成熟期均設(shè)置了耐高溫篩選，來獲得耐熱性能夠穩(wěn)定表達的藻株。

Burke等[25]采用遠(yuǎn)高于擬南芥最適生長溫度的48～50 ℃溫浴30min來分離缺少獲得性耐熱成分的擬南芥。Mullarkey等[22]在篩選EMS誘變的小麥耐高溫突變體時，采用的方法是將M2代幼苗置于47 ℃的高溫中熱脅迫90min。本實驗采用高溫水浴脅迫的方法對幼苗期的誘變藻株進行首次篩選。首先通過預(yù)實驗得到致使野生小苗全部死亡的最低溫度-41 ℃，然后將2～3mm長的經(jīng)誘變的果孢子幼苗置于該溫度下脅迫30min。成熟期藻體的耐高溫篩選為35 ℃熱脅迫72h。結(jié)果顯示，該篩選方法耗費時間較短，降低了篩選的勞動強度；在成熟期時進行2次篩選，其結(jié)果能夠反映突變體的性狀穩(wěn)定性，有利于篩選出真正具有耐高溫特性的突變藻株。

在幼苗期時經(jīng)高溫水浴脅迫有大量的果孢子幼苗存活下來，這些小苗在成熟期熱脅迫后卻仍有大批藻株死亡，在一定程度上驗證了龍須菜在幼苗期具有更高的抗高溫性的觀點。篩選出的耐高溫藻株還需要后續(xù)的遺傳分析和實踐栽培工作來驗證其遺傳穩(wěn)定性。

3.5 低磷速生突變體的篩選

磷是植物必需的營養(yǎng)元素，在其生長發(fā)育、新陳代謝中起著重要的作用。由于土壤中能夠供給作物利用的有效磷濃度非常低[26]，因此，在高等植物尤其是農(nóng)作物中關(guān)于低磷脅迫和耐低磷篩選指標(biāo)的研究非常之深入和廣泛。在低磷脅迫下作物根系會分泌大量的酸性磷酸酶來活化土壤中的有機磷，被認(rèn)為是作物適應(yīng)低磷脅迫的重要生理機制[27]。還有研究表明，在缺磷狀態(tài)下，小麥[28]、油菜[29]等作物的根冠比會增加，這是因為更多的碳水化合物被迫使向根部運輸。武志遠(yuǎn)等[30]利用根際顯色反應(yīng)作為耐低磷品種的篩選方法，篩選耐低磷的粗山羊草品系，根際顯色試驗?zāi)苷f明不同材料根際分泌的酸類物質(zhì)的數(shù)量差異。高親和性磷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被認(rèn)為低磷脅迫狀態(tài)下有效磷的主要轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，其在環(huán)境中低磷或者缺磷時被誘導(dǎo)表達，而在正常供磷情況下表達被抑制[31]。另外，分蘗能力、根軸長度、相對葉齡等也經(jīng)常被用作高等植物耐低磷篩選的指標(biāo)。

但在藻類尤其是大型海藻中，耐低磷篩選指標(biāo)的研究相對缺乏。有研究表明，鈍頂節(jié)旋藻細(xì)胞內(nèi)P含量受限時，會引起碳水化合物、脂質(zhì)和C/N比的升高以及蛋白質(zhì)含量的降低[32]。另外，N、P濃度的變化，會影響龍須菜葉綠素a、藻紅蛋白、丙二醛含量以及硝酸還原酶和過氧化物酶活性[33]。但這些指標(biāo)能否反映藻株對低磷脅迫的耐受力還缺乏足夠的證據(jù)。但生長速率作為最直觀的性狀表征，是高等植物和藻類耐低磷篩選最基本的指標(biāo)。

本實驗以低磷培養(yǎng)條件下的生長速率為指標(biāo)，進行低磷速生品系的選育。首先，幼苗期通過測量各株幼苗的長度，初步篩選出相對野生型有著明顯生長優(yōu)勢的藻株。誘變組平均長度明顯低于野生組，說明X射線輻照使大多數(shù)藻株產(chǎn)生了負(fù)突變。測量得到野生型最大長度，以該長度為篩選標(biāo)準(zhǔn)，大于該長度的誘變組藻株，被初步認(rèn)定為耐低磷藻株。一方面，野生型藻株樣本與誘變組數(shù)量一致，均為106～107，樣本數(shù)目足夠大，并且藻株培養(yǎng)條件均一致，因此，以野生型最大長度為篩選標(biāo)準(zhǔn)具有可信性。大于該長度的誘變組小苗相對野生型具有顯著的生長優(yōu)勢，因此，極有可能是耐低磷的突變株。

在第一輪篩選的基礎(chǔ)上，待其成熟后，設(shè)計實驗再次驗證耐低磷小苗的生長優(yōu)勢，每株藻設(shè)計3個平行，日平均生長速率顯著大于野生型的藻株被確定為低磷速生藻株，但其遺傳變異的穩(wěn)定性，還需進一步分析鑒定。

實驗驗證了用X射線輻照果孢子是一種有效的龍須菜誘變育種方法。篩選出的WT-3經(jīng)過幼苗期的高溫水浴脅迫和成熟期的高溫培養(yǎng)脅迫后存活下來，說明其可能具有較高的耐熱性。WLP-1、WLP-9、WLP-22以生長速率為指標(biāo)，經(jīng)過幼苗期和成熟期的雙重篩選，顯示了在低磷條件下顯著的生長優(yōu)勢。篩選出的耐高溫和低磷速生藻株有望作為優(yōu)良品系應(yīng)用于生產(chǎn)栽培，4株突變體的性狀優(yōu)越性和遺傳穩(wěn)定性的確定還需大量的后續(xù)研究和實踐栽培工作。

本實驗將X射線誘變與耐高溫和低磷速生篩選相結(jié)合，建立了一套可行的龍須菜優(yōu)良品系篩選方法，為龍須菜的優(yōu)良品系選育提供了研究基礎(chǔ)，同時，篩選出的優(yōu)良藻株為下一步遺傳研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供了材料。

[1]余杰, 王欣, 陳美珍, 等. 潮汕沿海龍須菜的營養(yǎng)成分和多糖組成分析[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(1): 93-97.

YuJ,WangX,ChenMZ,etal.AnalysisonnutritionalcomponentsandpolysaccharidecompositionofGracilaria lemaneiformisfromChaoshanCoast[J].FoodScience, 2006, 27(1): 93-97.

[2]FeiXG.Solvingthecoastaleutrophicationproblembylargescaleseaweedcultivation[J].Hydrobiologia, 2004, 512(1-3): 145-151.

[3]張學(xué)成, 費修綆, 王廣策, 等. 江蘺屬海藻龍須菜的基礎(chǔ)研究與大規(guī)模栽培[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2009, 39(5): 947-954.

ZhangXC,FeiXG,WangGC,etal.GeneticstudiesandlargescalecultivationofGracilaria lemaneiformis[J].PeriodicalofOceanUniversityofChina, 2009, 39(5): 947-954.

[4]AtkinsonMJ,SmithSV.C:N:Pratiosofbenthicmarinealgae[J].LimnolOceanogr. 1983, 28: 568-574.

[5]徐永健. 養(yǎng)殖富營養(yǎng)化修復(fù)藻類的營養(yǎng)生態(tài)學(xué)研究[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2004.

XuYJ.StudyonNutrientEcologyofSeaweedsUsedforRemediatingMariculturalEutrophication[D].Xiamen:XiamenUniversity, 2004.

[6]國家環(huán)境保護局.GB3097-1997 海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：環(huán)境科學(xué)出版社, 2004.

MinistryofEnvironmentalProtectionofthePeople'sRepublicofChina.GB3097-1997SeaWaterQualityStandard[S].Beijing:ChinaEnvironmentalSciencePress, 2004.

[7]ZhouW,SuiZH,WangJG,etal.AnorthogonaldesignforoptimizationofgrowthconditionsforalllifehistorystagesofGracilariopsis lemaneiformis (Rhodophyta)[J].Aquaculture, 2013, 392: 98-105.

[8]PflugmacherS,SteinbergC.ActivityofphaseⅠandphaseⅡdetoxificationenzymesinaquaticmacrophytes[J].AngewandteBotanik, 1997, 71(5-6): 144-146.

[9]付峰, 隋正紅, 常連鵬, 等. 龍須菜果孢子的紫外誘變及優(yōu)勢突變體的篩選[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版), 2014, 44(3): 50-56.

FuF,SuiZH,ChangLP,etal.UV-irradiationmutationoncarposporesofGracilariopsis lemaneiformisandscreeningofthermo-tolerantstrains[J].PeriodicalofOceanUniversityofChina, 2014, 44(3): 50-56.

[10]ShenD,WuM.Chromosomalandmutagenicstudyofthemarinemacroalga, Gracilaria tenuistipitata[J].JournalofAppliedPhycology, 1995, 7(1): 25-31.

[11]張學(xué)成, 秦松, 馬家海, 等. 海藻遺傳學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005.

ZhangXC,QinS,MaJH,etal.TheGeneticsofMarineAlgae[M].Beijing:ChinaAgriculturePress, 2005.

[12]孟琳. 龍須菜耐高溫新品系的選育及其相關(guān)性狀分析[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2009.

MengL.SelectionandCharacteristicAnalysisonNewStrainofGracilaria lemaneiformis[D].Qingdao:OceanUniversityofChina, 2009.

[13]付峰. 龍須菜紫外誘變育種及抗逆速生優(yōu)良品系的選育[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2013.

FuF.TheUltravioletMutagenesisBreedingandSelectionofStressToleranceandFastGrowthStrainsofGracilariopsis lemaneiformis[D].Qingdao:OceanUniversityofChina, 2013.

[14]施巧琴, 吳松剛. 工業(yè)微生物育種學(xué)[M]. 北京： 科學(xué)出版社, 2003.

ShiQQ,WuSG.IndustrialMicrobialBreedingScience[M].Beijing:SciencePress, 2003.

[15]WuCY,LinGH.ProgressinthegeneticsandbreedingofeconomicseaweedsinChina[J].Hydrobiologia, 1987, 151/152: 57-61.

[16]李大鵬, 蘆永紅, 吳超元. 海帶遺傳育種及育苗生物技術(shù)歷史及現(xiàn)狀[J]. 生物學(xué)通報, 2002, 37(8): 1-3.

LiDP,LuYH,WuCY.ThehistoryandpresentsituationofgeneticbreedingbiotechnologyofLaminaria japonica[J].BulletinofBiology, 2002, 37(8): 1-3.

[17]蔣霞敏, 翟興文, 董姣娣, 等.X,γ輻射對雨生紅球藻超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2003, 17(6): 438-441.

JiangXM,ZhaiXW,DongJD,etal.EffectofX-andγ-irradiationontheultrastructureofHaematococcus pluvialis[J].JournalofNuclearAgriculturalScience, 2003, 17(6): 438-441.

[18]張學(xué)成, 張錦東, 隋正紅, 等. 江蘺屬藻膽蛋白的研究:Ⅰ誘變、突變體篩選及藻膽蛋白的光譜特性[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1996, 26(3): 318-326.

ZhangXC,ZhangJD,SuiZH,etal.StudiesonphycobiliproteinsfromGracilaria: Ⅰ.Mutagenesis,mutationselectionandcharacterizationofabsorptionspectraandfluorescentemissionspectra[J].JournalofOceanUniversityofQingdao, 1996, 26(3): 318-326.

[19]ZhangX,MeerJP.AgeneticstudyonGracilaria sjoestedtii[J].CanadianJournalofBotany, 1988, 66(10): 2022-2026.

[20]黃瑞芳, 劉廣發(fā), 周韜, 等. 耐高溫巴氏杜氏藻突變株的誘變和鑒定[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版), 2006, 45(2): 272-275.

HuangRF,LiuGF,ZhouT,etal.MutationandidentificationofthemutantofDunaliella bardawilresistanttohightemperature[J].JournalofXiamenUniversity(NaturalScience), 2006, 45(2): 272-275.

[21]OngSC,KaoCY,ChiuSY,etal.Characterizationofthethermal-tolerantmutantsofChlorellasp.withhighgrowthrateandapplicationinoutdoorphotobioreactorcultivation[J].BioresourceTechnology, 2010, 101(8): 2880-2883.

[22]MullarkeyM,JonesP.Isolationandanalysisofthermotolerantmutantsofwheat[J].JournalofExperimentalBotany, 2000, 51(342): 139-146.

[23]鄧茳明, 熊格生, 袁小玲, 等. 棉花不同耐高溫品系的SOD,POD,CAT活性和MDA含量差異及其對盛花期高溫脅迫的響應(yīng)[J]. 棉花學(xué)報, 2010, 22(3): 242-247.

DengJM,XiongGS,YuanXL,etal.DifferencesinSOD,POD,CATactivitiesandMDAcontentandtheirresponsestohightemperaturestressatpeakfloweringstageincottonlineswithdifferenttolerancetohightemperature[J].CottonScience, 2010, 22(3): 242-247.

[24]樊恭炬, 李偉新, 王永川, 等. 瓊膠海藻的研究:Ⅰ.龍須菜的果孢子萌發(fā)體的生長適溫及其幼苗的季節(jié)生長[J]. 植物學(xué)報, 1974, 16(1): 24-30.

FanGJ,LiWX,WangYC,etal.Studiesontheagarophytes: Ⅰ.Theoptimumgrowthtemperatureofthecarpospores-germlingsofGracilariopsis lemaneiformisandtheseasonalgrowthofthesporelings[J].JournalofIntegrativePlantBiology, 1974, 16(1): 24-30.

[25]BurkeJJ,O'MahonyPJ,OliverMJ.IsolationofArabidopsismutantslackingcomponentsofacquiredthermotolerance[J].PlantPhysiology, 2000, 123(2): 575-588.

[26]BieleskiRL.Phosphatepools,phosphatetransport,andphosphateavailability[J].AnnualReviewofPlantPhysiology, 1973, 24(1): 225-252.

[27]VanceCP,Uhde-StoneC,AllanDL.Phosphorusacquisitionanduse:Criticaladaptationsbyplantsforsecuringanonrenewableresource[J].NewPhytologist, 2003, 157(3): 423-447.

[28]龐欣, 李春儉. 部分根系供磷對小麥幼苗生長及同化物分配的影響[J]. 作物學(xué)報, 2000, 26(6): 719-724.

PangX,LiCJ.Effectofpartial-rootsupplyofPnutrientonthegrowthandassimilatedistributionofwheatseedlings[J].ActaAgronomicaSinica, 2000, 26(6): 719-724.

[29]段海燕, 徐芳森, 王運華. 甘藍(lán)型油菜不同磷效率品種苗期根系生長及磷營養(yǎng)的差異[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2002, 8(1): 65-69.

DuanHY,XuFS,WangYH.ThedifferenceofrootsystemgrowthandPnutritionintheseedlingsofrapecultivarswithdifferentP-efficiency[J].PlantNutritionandFertilizerScience, 2002, 8(1): 65-69.

[30]武志遠(yuǎn). 粗山羊草和小麥耐低磷品種的篩選及Pht1基因的克隆與序列分析[D]. 開封: 河南大學(xué), 2012.

WuZY.PhosphorusEfficientVarietiesSelectionandCloningandSequencesAnalysisofPht1GenefromAegilops tauschiiandWheat[D].Kaifeng:HenanUniversity, 2012.

[31]RaghothamaKG.Phosphateacquisition[J].AnnualReviewofPlantBiology, 1999, 50(1): 665-693.

[32]MarkouG.AlterationofthebiomasscompositionofArthrospira (Spirulina) platensisundervariousamountsoflimitedphosphorus[J].BioresourceTechnology, 2012, 116: 533-535.

[33]YuJ,YangYF.PhysiologicalandbiochemicalresponseofseaweedGracilaria lemaneiformistoconcentrationchangesofNandP[J].JournalofExperimentalMarineBiologyandEcology, 2008, 367(2): 142-148.

Inthispaper,X-raywasusedasthemutagentoconductthemutagenesisofGp. lemaneiformis.Carposporeswereprovedtobethebettermutagenicmaterialcomparedtostem-tipsandtheoptimalirradiationdosewasdeterminedtobe90Gy(Gray, 1Gy=1J/kg,istheabsorptionofonejouleofenergy,intheformofionizingradiation,perkilogramofmatter.).Approximately107～108carposporesweremutatedbyX-rayirradiationoutofwhich106～107seedlingssurvivedandweredividedinto2groupstobescreenedfurtherunderhightemperatureandlowphosphorusstress,respectively.

Thethermo-toleratescreeningmethodwassetupintwophases.Whencarposporesdevelopedinto2～3mmgermlings(4weeksaftermutagenesis),theyweresubjectedtoheatshockat41 ℃for30mininwaterbath.Followingfieldcultivationanddevelopmentofgermlingsintomaturealgae,theywereexposedtoheatshockof35 ℃for72hinincubator.Onemutantwithheattolerancewasobtained,namedWT-3,whichsurvivedafterthetwoscreeningphasesanddisplayedrapidgrowth.Low-phosphorustolerantstrainswerescreenedmainlybygrowthrateatbothseedlingandmaturestages.Thesamequantitiesofwildandmutatedcarposporicgermlingswereculturedunderthesamecondition.Theculturemediumwaswith10-2mg/Lphosphorusconcentrationandreplacedonceaweek.Thewildoneswereusedasthecontrol.Mutatedstrainsdisplayinghighergrowthratethanthemaximumofcontrolwereselected.Threemutantsoflow-phosphorustolerancewereobtained,namedWLP-1,WLP-9andWLP-22.Thespecificgrowthrate(SGR)ofthemwere2.79%, 2.72%and3.01%respectively,significantlyhigherthan2.21%(P<0.05),themaximumSGRofthewildstrains.

ItissafeandeffectivetousetheX-rayemittedfromthemedicalelectronlinearacceleratorasthemutagen.AndthenewlyreleasedcarposporeswithoutcellwallsaremuchmoresensitivetoX-rayirradiationtreatmentthanthestem-tips.TheresultindicatedthatthemutationmethodisappropriateforGp. lemaneiformis.

ThestudyprovidedefficientandfeasiblemutagenesisandscreeningprocedureforGp. lemaneiformis.Meanwhile,theselectedstrainscanbegoodcandidatesforgeneticresearchandcultivationapplicationsinthefuture.

責(zé)任編輯高蓓

X-Ray-Irradiation Mutation on Carpospores of Gracilariopsis lemaneiformisandScreeningofMutantswithSuperiorTraits

WEIHui-Hui,SUIZheng-Hong,WANGJin-Guo,DUQing-Wei,SHANGEr-Lei,MIPing,QUEZhou

(TheKeyLaboratoryofMarineGeneticsandBreeding,MinistryofEducation,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)

Gracilariopsis lemaneiformis(Rhodophyte)isoneofthemostimportanteconomicmacroalgaeinChina.FollowingLaminariaandporphyra,ithasbecomethethirdlargestcultivatedseaweedinChinaandthecultivationscaleisincreasinglyenlarging.However,thesuitabletemperatureforgrowthofthewildpopulationis12～23 ℃.Althoughthethermo-tolerantcultivar981hasbeensuccessfullycultivatedinthesoutharea,it’sstillunabletosurviveinsummer.Inaddition,thephosphorusconcentrationisgenerallylowinmostmariculturearea,sometimesevenisbellow0.01mg/L.TheproductivityandqualityofGp. lemaneiforsisisseriouslyinfluenced.Inordertoenlargethecultivationarea,toextendthecultivationperiodandtoincreasetheproductivityandquality,itisurgentlyneededtoimproveitsheattolerance,low-phosphorustoleranceandgrowthrate.Therefore,itisessentialtoconductmutagenesisbreedingandselectiontoobtainmutantswithsuperiortraits.

X-raymutagenesis;heattolerance;low-phosphorustolerance;fastgrowing; Gracilariopsis lemaneiformis

山東省自主創(chuàng)新計劃課題項目(2013CXC80202)；國家自然科學(xué)基金項目(31372529)資助

2015-12-25；

2016-01-15

魏惠惠(1991-)，女，碩士。E-mail：sydweihui@163.com

??通訊作者：E-mail：suizhengh@ouc.edu.cn

Q949.2

A

1672-5174(2016)09-050-09

10.16441/j.cnki.hdxb/20150428

Supported by Independent Innovation Foundation of Shandong Province(2013CXC80202);National Natural Science Foundation of China (31372529)