順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體的制備及MR靶向成像研究

陳維翠， 劉淑儀， 林愛華， 劉波， 劉峴

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·實驗研究·

順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體的制備及MR靶向成像研究

陳維翠， 劉淑儀， 林愛華， 劉波， 劉峴

目的：制備順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體，探討其對荷人乳腺癌裸鼠模型的MR特異成像作用。方法：制備順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體，評價其理化特性及體外細胞結(jié)合特性。動物試驗選擇12只荷人乳腺癌裸鼠，分為2組進行磁共振掃描。實驗組為順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體組，對照組為釓布醇組。測量平掃及靜脈注射對比劑后第10分鐘、1小時、6小時后，腫瘤組織在T1WI的信號強度，計算并比較不同實驗組內(nèi)腫瘤組織的強化率和對比度噪聲比。結(jié)果：順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體的平均粒徑為134.2 nm，多分散系數(shù)為0.29，Zeta電位為-32.49 mV，r1弛豫率為4.67/mM·s；與HER2高表達的SK-BR-3乳腺癌細胞表現(xiàn)為特異性結(jié)合，胞漿出現(xiàn)羅丹明紅染。注射順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體后，腫瘤組織表現(xiàn)為顯著持久的強化；增強10 min后腫瘤強化率為121%，1 h后腫瘤強化率為185%，6 h后腫瘤強化率為224%。對照組在靜脈注射釓布醇10 min后，腫瘤組織表現(xiàn)為顯著強化，強化率為153%，1 h后的信號強度與平掃相近。兩組實驗動物在注射對比劑后第1、6 h后，腫瘤組織的強化率、CNR差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體具有長循環(huán)時間，高r1弛豫率，對乳腺癌具有特異性靶向作用。

順磁性； 免疫脂質(zhì)體； 磁共振成像； 對比劑

免疫脂質(zhì)體作為新型藥物運輸載體，具有降低藥物毒性、改善藥物穩(wěn)定性和組織學分布等優(yōu)點，在抗腫瘤藥物的靶向治療、基因、疫苗制備等方面顯示出巨大的優(yōu)勢[1-2]。免疫脂質(zhì)體也可作為對比劑的運輸載體[3]，通過對熒光材料、順磁性、超順磁性物質(zhì)進行封裝，實現(xiàn)對生物組織的特異靶向顯像。本文嘗試制備裝載順磁性Gd對比劑的抗HER2免疫脂質(zhì)體，以實現(xiàn)對HER2高表達乳腺癌靶向MR成像的目的。

材料與方法

1．實驗材料

1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(poly(ethylene glycol))-2000，PEG2000-DSPE]、羅丹明-磷脂酰乙醇胺(rhodamine-PE)、馬來酰胺-聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及?[ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(poly(ethylene glycol))2000，Mal-PEG2000-DSPE]，購自美國Avanti Polar Lipids 公司；Gd-DTPA-硬脂酰胺 [Gd-DTPA-bis(stearylamide), Gd-BSA]購自美國Gateway Chemical Technology公司；N-琥珀酸亞胺S-硫代乙酸鹽(酯)(N-Succinimidyl S- acetylthioacetate, SATA)、膽固醇(cholesterol，Chol)購自美國Sigma公司。

人源性重組抗HER2單克隆抗體購自Genentech Inc.(South San Francisco，CA)?？笻ER2單抗片段按照Carter文獻報道方法制備[4]。人乳腺癌細胞株SK-BR-3、MCF-7購自上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，腫瘤細胞擴增按照標準程序完成。

2．順磁性長循環(huán)脂質(zhì)體的制備

順磁性長循環(huán)脂質(zhì)體的制備采用薄膜水合法，將Gd-BSA,DSPC,chol和PEG2000-DSPE按照0.75：1.10：1：0.15的摩爾比例，溶于氯仿/乙醚混合液(體積比1:1)，脂質(zhì)總量為120 μmol，在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干形成薄膜。此外，加入0.001 mol/L的rhodamine-PE用于熒光成像。

3．順磁性抗HER2單克隆抗體免疫脂質(zhì)體的制備

采用巰基-順丁烯二酰亞胺偶聯(lián)法(sulfhydryl-maleimide coupling method)，將抗HER2單抗片段結(jié)合至Mal- PEG2000- DSPE鏈的遠端。具體步驟為首先使用SATA對抗HER2單抗片段(1 mg/mL)進行修飾(抗體與SATA的摩爾比為8:1)，室溫下孵育45 min，HBS緩沖液洗脫4次后，采用旋轉(zhuǎn)離心方法(50kD分子量截留)去除游離的SATA。SATA衍生的抗體片段與羥胺溶液在室溫下混合孵育1 h以去乙?；?。形成的活性抗體加入含有Mal-PEG2000-DSPE的順磁性長循環(huán)脂質(zhì)體(蛋白/脂質(zhì)比例為50 μg/μmol)，高速離心去除未結(jié)合的抗體(65000 rpm，45 min)，移去上清液后，脂質(zhì)體懸液在氮氣4℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

4．順磁性脂質(zhì)體理化特性測定

①粒徑及Zeta電位測定：取純化脂質(zhì)體混懸液適量，加適量雙蒸水稀釋后，采用Malvern 3000HS激光粒度分析儀測定其粒徑及zeta電位。

②r1弛豫率測定：順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體使用生理鹽水稀釋為不同濃度，Gd濃度采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜測定(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES) (Optima 3000 DV,Perkin Elmer,MA,USA)。r1弛豫率測量采用400 mHz MR光譜儀(DRX-400 9.4T,Bruker，中科院廣州化學研究所)，反轉(zhuǎn)恢復脈沖序列(inversion recovery，IR)，35 mm射頻發(fā)射接收線圈，成像參數(shù)為TE 30 ms，TR分別選擇15,30,60,100,150,200,300,450,600,900,1500,3000,6000及12000 ms，視野40 mm×40 mm，矩陣128×128，在40℃測定順磁性對比劑的體外T1弛豫時間，計算r1弛豫率。r1弛豫率定義為T1弛豫速率(1/T1)與Gd濃度比值斜率。

5．細胞結(jié)合實驗

選擇人乳腺癌細胞SK-BR-3(HER2高表達)、MCF-7(HER2低表達)與羅丹明標記的免疫脂質(zhì)體在37℃下孵育2 h，采用共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞懸液。羅丹明-PE的激勵、發(fā)射波長分別選擇560 nm、590 nm。

6．MR動物實驗

①荷瘤裸鼠模型的制作：選擇HER2高表達SK-BR-3人乳腺癌細胞進行培養(yǎng)，當活細胞比率>90%，細胞濃度為2×106/mL時，按0.2 mL/只裸鼠注射于實驗動物右側(cè)肩背部皮下。腫瘤生長8～10周，直徑約1 cm時，進行MR掃描。

②MR掃描方案及數(shù)據(jù)分析：12只荷人乳腺癌裸鼠，分為兩組，其中順磁性抗 HER2免疫脂質(zhì)體組6只，釓布醇對照組6只。實驗動物經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定后進行MR掃描。對比劑靜脈注射劑量為0.05 μmol/g體重。

MR掃描選擇GE Signal HDX 3.0T超導型MR掃描儀，50 mm自制鳥籠線圈bird cage coil。掃描參數(shù)為橫軸面自旋回波T1WI，TR 500 ms，TE 14 ms，視野40 mm×40 mm,，層厚2 mm，矩陣256×256。測量平掃及增強掃描后10 min、1 h、6 h的腫瘤、肌肉組織的信號強度、背景噪聲信號強度及標準差，計算腫瘤組織的強化率、對比度噪聲比(contrast-to-noise ratio，CNR)。

7．病理學檢查

MR掃描結(jié)束后，處死實驗動物，腫瘤組織固定后行常規(guī)HE染色和免疫組織化學檢查。

注：兩樣本t檢驗，注射順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體、釓布醇后的1h和6h，兩組乳腺癌腫瘤組織的強化率、CNR差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

結(jié)　果

1．順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體的理化特性

順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體的平均粒徑為134.2 nm，電位為-32.49 mV，多分散系數(shù)為0.29(圖1)，r1弛豫率為4.67/mM·s。

2．體外細胞結(jié)合實驗

激光共聚焦熒光顯微鏡顯示免疫脂質(zhì)體在細胞內(nèi)的分布情況：HER2高表達SK-BR-3乳腺癌細胞內(nèi)，羅丹明標記抗HER2免疫脂質(zhì)體發(fā)生內(nèi)化，胞漿出現(xiàn)羅丹明紅染；而在HER2低表達MCF-7乳腺癌細胞內(nèi)，由于免疫脂質(zhì)體不發(fā)生特異性結(jié)合，故無明顯染色(圖2)。

3．腫瘤組織MR強化表現(xiàn)

注射順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體后，乳腺癌組織表現(xiàn)為顯著持久的強化；注射10 min后，腫瘤組織即表現(xiàn)為不均勻顯著強化，平均強化率為121%，在隨后的1 h及6 h后，腫瘤仍保持較高的信號強度，1 h腫瘤強化率為185%，6 h后腫瘤強化率為224%，此時心腔內(nèi)仍可見高信號對比劑存在。對照組在靜脈注射釓布醇10 min后，腫瘤組織表現(xiàn)為不均勻顯著強化，強化率約為153%；隨即各個時間點內(nèi)腫瘤組織信號強度下降，1 h后的信號強度與平掃相近(圖3)。注射對比劑第1、6 h后，兩實驗組腫瘤組織的強化率和CNR差異有著統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

4．病理學檢查結(jié)果

HE染色顯示SK-BR-3乳腺癌細胞呈不規(guī)則團狀排列，部分癌團可見壞死灶，伴有脂肪細胞、淋巴細胞浸潤，局部癌細胞間質(zhì)纖維組織增生；免疫組化染色顯示SK-BR-3乳腺癌細胞膜呈HER2強染色(圖4)。

討　論

免疫脂質(zhì)體由脂質(zhì)體與單克隆抗體或基因抗體連接而成。通過抗體與靶細胞表面的抗原/受體特異性結(jié)合，經(jīng)吞噬、吞飲等多種方式，免疫脂質(zhì)體可釋放出包封的藥物或?qū)Ρ葎?，實現(xiàn)靶向治療或特異性顯像的目的[5-6]。

圖3不同實驗組內(nèi)乳腺癌腫瘤組織的平掃及強化圖像。a) 順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體組平掃T1WI圖像； b) 增強掃描后10min T1WI圖像； c) 增強掃描后1h的T1WI圖像； d) 增強掃描6h的T1WI圖像； e) 釓布醇組平掃T1WI圖像； f) 增強掃描后10min的T1WI圖像； g) 增強掃描1h的T1WI圖像； h) 增強掃描6h的T1WI圖像。

理想的免疫脂質(zhì)體應具有簡單快速穩(wěn)定的連接方式、能在血液循環(huán)中保持長時間的空間穩(wěn)定性和良好的抗原識別能力。本次實驗采用SATA耦聯(lián)劑制備順磁性免疫脂質(zhì)體，將抗HER2單克隆抗體片段Fab'活化修飾后，連接于PEG鏈末端。PEG在脂質(zhì)體表面形成親水性空間立體屏障，阻止血清內(nèi)調(diào)理素與脂質(zhì)體結(jié)合，延長脂質(zhì)體的循環(huán)時間[7-8]。本實驗中，單抗片段修飾所使用的SATA為新型硫化劑，其活性NHS?；伺c抗體氨基基團反應后，可形成穩(wěn)定的酰胺鍵?？贵w的巰基基團被修飾保護后，不會發(fā)生降解；且脫保護作用在中性PH環(huán)境中即可進行，無需加入還原劑[9]。修飾后的抗體與PEG遠端通過共價鍵結(jié)合，與其它抗體-脂質(zhì)體交聯(lián)方式(如二硫鍵、氨鍵或Schiff's堿)相比，這種連接方式保持了抗體的二價結(jié)構(gòu)，可避免抗原結(jié)合的空間阻礙效應，保證了抗原結(jié)合位點不受影響，且耦聯(lián)效率高，脂質(zhì)體也能結(jié)合較多數(shù)量的抗體[9]。

弛豫率是考察順磁性免疫脂質(zhì)體系統(tǒng)的另一重要指標。本實驗采用的順磁性標記物Gd-DTPA-硬脂酰胺，為兩性Gd螯合物，可結(jié)合到脂質(zhì)體的磷脂雙分子層內(nèi)。與將順磁性螯合物包裹于脂質(zhì)體內(nèi)層水相的制備方法相比，克服了水分子跨膜運動受限的缺點[10]。脂質(zhì)體內(nèi)外層的水分子交換，可直接使自由水與脂質(zhì)雙分子層內(nèi)的Gd螯合物發(fā)生磁化反應，延長旋轉(zhuǎn)相關時間(rotation correlation time,τR)，增加r1弛豫率[11-12]。體外弛豫率結(jié)果表明，這一順磁性脂質(zhì)體系統(tǒng)具有較高的r1弛豫率。

動物實驗結(jié)果表明，靜脈注射順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體后，腫瘤組織產(chǎn)生了顯著持久的強化，強化時間長達6 h。除順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體具有較高的r1弛豫率外，這主要是通過被動靶向(增強滲透滯留效應，EPR)和主動靶向(抗體介導)兩種機制實現(xiàn)的。前者是由于腫瘤新生血管和缺陷的淋巴引流/清除能力，導致PEG長循環(huán)脂質(zhì)體能在腫瘤間質(zhì)內(nèi)停留較長時間(一般>6 h)[13-14]。后者是通過免疫脂質(zhì)體的抗體-抗原特異性結(jié)合反應實現(xiàn)的，抗HER2免疫脂質(zhì)體經(jīng)Fab'片段，選擇性與HER2高表達乳腺癌腫瘤細胞結(jié)合，并經(jīng)受體介導的內(nèi)吞作用發(fā)生內(nèi)化。細胞結(jié)合熒光電鏡結(jié)果表明，抗HER2免疫脂質(zhì)體經(jīng)受體介導的內(nèi)吞噬作用后，熒光染色主要位于SK-BR-3乳腺癌細胞漿內(nèi)和細胞核周圍。而對照組HER2低表達MCF-7乳腺癌細胞則無明顯累積。除此以外，抗體的Fab'片段無FC部分，免疫源性低，可減少單核吞噬細胞系統(tǒng)的攝取，表現(xiàn)為半衰期延長，更易被動轉(zhuǎn)運通過滲漏的腫瘤血管內(nèi)皮層，從而進一步提高靶向成像效果[15-16]。

綜上，本次實驗所制備的順磁性抗HER2免疫脂質(zhì)體具有長循環(huán)時間，高r1弛豫率和特異性靶向作用?？贵w與脂質(zhì)體為共價結(jié)合方式，形成的免疫脂質(zhì)體更加有效。所使用的Fab'抗體片段具有較低的免疫源性。這一系統(tǒng)可作為MR對比劑的靶向載體，進一步加載抗腫瘤藥物，實現(xiàn)對抗腫瘤藥物的療效的實時監(jiān)測。值得指出的是，由于順磁性脂質(zhì)體的制備及成像效果受多種因素影響，如脂質(zhì)材料、粒徑大小、表面電荷等脂質(zhì)體理化特性及裝載順磁性螯合物的鏈長度等[17]，需要在進一步的研究中加以注意。

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Preparation of paramagnetic anti-HER2 immunoliposome and MR targeted imaging

CHEN Wei-cui,LIU Shu-yi,LIN Ai-hua,et al.

Radiology of Department,the second Affiliated Hospital,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510120,China

Objective:To prepare paramagnetic anti-HER2 immunoliposome,and to study its specific character in MR imaging using nude mice bearing human breast cancer model.Methods:Paramagnetic anti-HER2 immunoliposome was prepared,its physic-chemical characteristics as well as intracellular distribution were evaluated.Twelve nude mice bearing SK-BR-3 tumor were chosen as experiment animal,which were divided into two groups.Plain and contrast enhanced MR imaging were performed.Paramagnetic anti-HER2 immunoliposome was used as contrast agent for the experimental group and Gadobutrol was used for the control group.The signal intensities on T1WI in plain MRI and at 10min,1h,and 6h after contrast injection were measured respectively.The enhanced rate and contrast-to-noise ratio (CNR) of tumor in the two groups were calculated and compared.Results:The mean diameter,polydisperisity index,zeta potential and r1relexivity of paramagnetic anti HER2 immunoliposome were 134.2nm,0.29,-32.49mV and 4.67/mM·s respectively,showing specific binding with high-expressed SK-BR-3 breast cancer cells,rhodamine fluorescence was detected intensively in cytoplasm.After paramagnetic anti-HER2 immunoliposome was injected,marked and long-lasted enhancement in tumor tissue could be assessed,the enhanced rate was 121% after 10min,185% after 1h and 224% after 2h of enhancement.However,in the contrast group,after Gadobutrol as contrast agent was injected,tumor tissue enhanced obviously after 10min,the enhanced rate was 185%,yet the signal intensity decreased 1h after,which was closed to that as plain MRI.The enhanced rate,CNR of tumor 1h and 6h after injection of contrast agent in these two groups showed significant statistic difference.Conclusion:Paramagnetic anti-HER2 immunoliposomes show long circulation time,high r1relaxivity,could be served as a specific target agent for breast cancer.

Paramagnetic; Immunoliposomes; Magnetic resonance imaging; Contrast agent

510120廣州，廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院影像科(陳維翠、劉淑儀、劉波、劉峴)，藥學部(林愛華)

陳維翠(1986-)，女，廣西賀州人，碩士，住院醫(yī)師，主要從事影像診斷工作及分子影像學研究。

劉峴，E-mail：liuxian74@hotmail.com

國家自然科學基金(30700184)；廣東省科技計劃項目 (2013B021800247)

R445.2 ；

A

1000-0313(2016)07-0586-05

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.07.003

2015-12-28)