綿羊卵泡液高豐度白蛋白去除方法的比較

陳 瑩,李曉林,林嘉鵬,吳陽升*,黃俊成*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.農(nóng)業(yè)部 草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所,新疆 烏魯木齊 830000)

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綿羊卵泡液高豐度白蛋白去除方法的比較

陳 瑩1,李曉林2,林嘉鵬2,吳陽升2*,黃俊成2*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.農(nóng)業(yè)部 草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所,新疆 烏魯木齊 830000)

比較了2種試劑盒去除綿羊卵泡液中高豐度白蛋白的效果。結(jié)果表明： PierceTMAlbumin Depletion Kit去除高豐度白蛋白的效率高,但特異性不好; ProteoExtract? Albumin/IgG Removal Kit對(duì)高豐度白蛋白的去除效率不如前者,且不能有效去除綿羊的IgG，但其去除ALB的特異性要好于前者；經(jīng)兩種試劑盒處理樣品的2-DE電泳分離圖譜顯示白蛋白區(qū)域顯色程度和面積均比綿羊卵泡液原液樣品的小,但PierceTM試劑盒對(duì)大分子低豐度蛋白質(zhì)的回收效率低，而ProteoExtract?對(duì)小分子低豐度蛋白質(zhì)的回收率低；經(jīng)PierceTM試劑盒處理后樣品的蛋白質(zhì)圖譜中可檢出點(diǎn)的數(shù)量更多。

綿羊;卵泡液;白蛋白；去除方法

卵泡液是在卵泡形成過程中生成的,是血漿組分跨過血-卵泡屏障轉(zhuǎn)移和卵泡細(xì)胞新陳代謝共同的產(chǎn)物。卵泡液和顆粒細(xì)胞共同為卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供微環(huán)境。卵巢的顆粒細(xì)胞、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞均可產(chǎn)生調(diào)節(jié)因子,通過自分泌和(或)旁分泌作用,參與卵巢內(nèi)局部調(diào)控。這些物質(zhì)的含量變化和蛋白或肽的修飾都能夠精確反映卵泡發(fā)育成熟的生理過程[1]。卵泡液的成分特征直接影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量和發(fā)育潛能[2]。因此研究卵泡液中蛋白質(zhì)的組分及功能對(duì)研究卵泡發(fā)育進(jìn)程及卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。

雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。利用該技術(shù)對(duì)人的成熟和未成熟卵泡液間差異蛋白進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的卵泡表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)還可作為卵泡液成熟的標(biāo)志物[3]。卵泡液的成分與血漿的成分類似,其血清白蛋白(Albumin, ALB)和免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)等高豐度蛋白質(zhì)含量占總蛋白含量的60%～70%,嚴(yán)重干擾低豐度蛋白質(zhì)的檢出率。因此,去除卵泡液中高豐度蛋白質(zhì)將有利于分離和鑒定具有重要生物學(xué)功能的低豐度蛋白質(zhì)。學(xué)者們對(duì)綿羊[4]、豬[5]、水牛[6]、牦牛[7]、雙峰駝[8]、馬[9]和狗[10]等動(dòng)物均開展了卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。雖然前期有人對(duì)綿羊的卵泡液進(jìn)行了雙向電泳分析,但并沒有去除高豐度蛋白[4]。因此篩選和建立適于綿羊的白蛋白去除方法在綿羊卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中顯得尤為重要。

本研究采用ProteoExtract?Albumin/IgG Removal Kit和PierceTMAlbumin Depletion Kit對(duì)綿羊卵泡液中高豐度蛋白的去除效果進(jìn)行了比較,以期篩選出適合綿羊卵泡液高豐度蛋白去除的方法,為綿羊卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1綿羊卵泡液的采集

綿羊卵巢采自烏魯木齊市華凌屠宰場(chǎng),在母羊被屠宰后立即剪取其卵巢并置于37 ℃生理鹽水中(含青霉素、鏈霉素雙抗),在1～2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。用2 mL注射器抽取卵巢上直徑為3～5 mm、光澤度和透明度好、表面毛細(xì)血管豐富的健康卵泡中的卵泡液。以12000 r/min離心10 min,取上清，以50 μL/管分裝,于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2卵泡液蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

使用Pierce? BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc. U. S. A)分別測(cè)定卵泡液及兩種去除高豐度蛋白試劑盒處理后樣品的蛋白質(zhì)含量及濃度。根據(jù)試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，簡(jiǎn)單地講,就是利用試劑盒中的試劑配制標(biāo)準(zhǔn)品,使用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋一定倍數(shù)后的待測(cè)樣品在562 nm波長(zhǎng)下的OD值。以O(shè)D值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。

1.3PierceTMAlbumin Depletion Kit對(duì)白蛋白的去除

按照試劑盒說明書進(jìn)行去除高豐度蛋白的操作。重懸瓊脂糖樹脂(Cibacron Blue dye agarose resin),取400 μL懸浮液(包含200 μL樹脂顆粒)于離心柱中,瞬時(shí)離心，棄濾出液,加200 μL Wash buffer于離心柱中,瞬時(shí)離心,棄流出液。將離心柱置于新的離心管中;取1管分裝凍存的綿羊卵泡液樣品,用WB/BB進(jìn)行10倍稀釋,取200 μL加入離心柱中,使其與樹脂顆粒完全混勻,在室溫下孵育3 min;以12000 r/min離心1 min,將流出液重新加入離心柱中,在室溫下孵育3 min;以12000 r/min離心1 min,收集流出液,將離心柱放于新的離心管中;加入50 μL WB/BB洗滌離心柱，以釋放未結(jié)合的蛋白;以12000 r/min離心1 min,收集流出液,將離心柱置于一個(gè)新的離心管中;重復(fù)前兩步4～5次,分別收集每次的流出液,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;用洗脫液洗脫收集結(jié)合在樹脂顆粒上的蛋白,測(cè)定其濃度。

1.4ProteoExtract? Albumin/IgG Removal Kit對(duì)高豐度蛋白的去除

按照試劑盒說明書進(jìn)行去除高豐度蛋白的操作，簡(jiǎn)單地講,取制備的綿羊卵泡液，用結(jié)合緩沖液對(duì)其進(jìn)行10倍稀釋。用結(jié)合緩沖液對(duì)吸附柱預(yù)處理兩次,然后將稀釋后的卵泡液樣品300 μL上柱,利用重力流收集穿流液。然后再取600 μL結(jié)合緩沖液上柱,收集穿流液；重復(fù)1次。共收集過柱穿流液1500 μL。測(cè)定穿流液的蛋白質(zhì)濃度。用0.5 mol/L NaCl洗脫親和柱上的結(jié)合蛋白質(zhì),收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中蛋白質(zhì)濃度。

1.5電泳

1.5.1單向電泳配制10 cm×7 cm、厚0.75 mm的分離膠(12%)和濃縮膠(5%)。每孔上樣量20 μL,以90 V電泳20 min,以120 V電泳2 h。

1.5.2雙向電泳蛋白沉淀:根據(jù)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定結(jié)果,向經(jīng)兩種試劑盒處理后的300 μg蛋白樣品各自加入3倍體積的預(yù)冷丙酮,混勻,-20 ℃靜置2 h以上(或過夜),離心(12000 r/min,10 min,4 ℃),棄上清。再加200 μL預(yù)冷丙酮漂洗沉淀,離心(12000 r/min,10 min,4 ℃),棄丙酮。室溫靜置2～3 min,使殘留丙酮揮發(fā)干凈。蛋白水化:在水化開始前,按每2.5 mL水化儲(chǔ)備液(8 mol/L尿素、2%CHAPS、2%IPG緩沖液、0.002%溴酚藍(lán))添加7 mg DTT的比例準(zhǔn)備水化液,向每個(gè)沉淀的蛋白質(zhì)樣品中加入340 μL水化液溶解沉淀。取規(guī)格為18 cm、pH 3～10的IPG干膠條(GE Healthcare,美國(guó))，將其置于水化盤中,將經(jīng)水化液溶解的蛋白質(zhì)樣品加注在干膠條槽內(nèi),蓋好水化盤蓋,過夜。等電聚焦:設(shè)置運(yùn)行參數(shù),其中溫度20 ℃,電流50 μA/膠條,升壓方式、時(shí)間及電壓見表1。膠條平衡:將平衡緩沖液I [6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、29.3%甘油、2%SDS、0.002%溴酚藍(lán)、1%DTT]在室溫下平衡15 min；然后將膠條置于平衡緩沖液Ⅱ[6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、29.3%甘油、2%SDS、0.002%溴酚藍(lán)、2.5%碘乙酰胺]中平衡15 min；最后將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至第二向，以12.5%聚丙烯酰胺進(jìn)行凝膠電泳(120 V,14 h,12 ℃)。

表1　等電聚焦的運(yùn)行參數(shù)

1.6凝膠染色

對(duì)1-D PAGE和2-D PAGE凝膠均采用銀染的方法。銀染方法:用固定液(50%甲醇、12%乙酸、0.05%甲醛)固定2 h以上或過夜;用沖洗液(35%乙醇)沖洗20 min;用敏化液(0.025% Na2S2O3)敏化2～3 min;用去離子水沖洗3次,每次4～5 min;用銀染液(0.2%AgNO3、0.072%甲醛)染色20 min;用去離子水沖洗2次,每次5～10 s;用顯影液(6%Na2CO3、0.05%甲醛、2%敏化液)顯影1～3 min；根據(jù)顯色效果換終止液(50%甲醇、12%冰乙酸)終止反應(yīng)。拍照凝膠圖像并分析。

2　結(jié)果與分析

2.1兩種試劑盒去除綿羊卵泡液中白蛋白后蛋白質(zhì)濃度的變化

所采集卵泡液樣品經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定,其蛋白質(zhì)濃度為56.6 μg/μL。

在使用PierceTMAlbumin Depletion Kit去除ALB時(shí),需將卵泡液蛋白質(zhì)樣品用Washing buffer進(jìn)行10倍稀釋。稀釋后蛋白樣品200 μL，經(jīng)過柱吸附后穿流液蛋白濃度為2.09 μg/μL (200 μL)。經(jīng)Washing buffer洗柱4次(50 μL/次),洗柱液蛋白濃度分別是0.96、0.64、0.48、0.55 μg/μL。穿流液總蛋白含量為549.5 μg。高豐度白蛋白去除效率為51.5%(582.5 μg/1132 μg)。

在使用ProteoExtract? Albumin/IgG Removal Kit去除高豐度蛋白質(zhì)時(shí),用結(jié)合緩沖液將卵泡液樣品進(jìn)行10倍稀釋。取300 μL稀釋的卵泡液樣品上柱(1698 μg),收集穿流液,合并4次洗柱液,共1500 μL,其蛋白質(zhì)濃度為0.82 μg/μL,蛋白質(zhì)總量為1230 μg。高豐度蛋白質(zhì)去除效率為27.5%(468 μg/1698 μg)。

結(jié)果表明,PierceTMAlbumin Depletion Kit去除綿羊卵泡液高豐度蛋白的效率高。

2.2去除綿羊卵泡液樣品ALB的單向電泳結(jié)果

用兩種試劑盒去除綿羊卵泡液樣品高豐度ALB后對(duì)其進(jìn)行單向(1-D)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析。在1-D PAGE中,綿羊卵泡液中ALB和IgG的蛋白質(zhì)含量超過總蛋白含量的70%(圖1中的oFF)。綿羊ALB由607個(gè)氨基酸組成 (Genbank ID: NP_001009376.1),分子量預(yù)測(cè)為69.2 kDa。電泳圖中含量最高的ALB蛋白質(zhì)分子量約70 kDa,其含量超過總蛋白的50%(圖1中的E1和E2)。IgG分子電泳顯示為50 kDa和25 kDa的兩條帶(圖1)。

用PierceTM試劑盒處理卵泡液樣品后,其ALB含量顯著下降,同時(shí)多個(gè)低豐度蛋白的條帶濃度增加(圖1中的D1)。將結(jié)合在樹脂上的ALB洗脫后發(fā)現(xiàn),還有多個(gè)非ALB被結(jié)合(圖1中的E1)。而用ProteoExtract?處理卵泡液后,其對(duì)ALB的去除效率不如前者,但去除ALB的特異性要好于前者(圖1中的E2)。雖然該試劑盒可有效去除人的IgG,但在本實(shí)驗(yàn)中不能有效去除綿羊的IgG(圖1中的D2)。

M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記; oFF:綿羊卵泡液; D1: PierceTM白蛋白去除試劑盒處理后樣品; E1: PierceTM試劑盒實(shí)驗(yàn)組洗脫結(jié)合在樹脂上的蛋白質(zhì)組分; D2: ProteoExtract?試劑盒處理后樣品; E2: ProteoExtract?試劑盒洗脫結(jié)合柱上蛋白質(zhì)組分。

圖1兩種試劑盒去除綿羊卵泡液高豐度蛋白效果比較(SDS-PAGE圖)

2.3去除綿羊卵泡液樣品白蛋白的雙向電泳結(jié)果

用兩種試劑盒處理綿羊卵泡液后,分別用雙向電泳分離蛋白質(zhì)樣品,所得圖譜如圖2所示。綿羊卵泡液中的高豐度白蛋白和IgG占總蛋白的比例高,顏色深(圖2A)。經(jīng)過兩種試劑盒處理后,部分白蛋白被除去,部分蛋白點(diǎn)含量提高,其中PierceTM試劑盒的去除效率稍高于ProteoExtract?的(圖2B、圖2C)。但是這兩種試劑盒在大分子和小分子回收效率上有差異,其中PierceTM試劑盒似乎對(duì)大分子有親和性,對(duì)大分子的回收效率低(圖2C);而ProteoExtract?似乎對(duì)小分子有親和性,對(duì)小分子的回收率低(圖2B)。雖然兩種試劑盒均能去除部分高豐度白蛋白,但兩者對(duì)大分子或小分子低豐度蛋白質(zhì)的回收存在一定程度的差異。

3　討論

隨著后基因組時(shí)代的到來,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也受到越來越廣泛的關(guān)注。近年來蛋白質(zhì)的分離和鑒定技術(shù)發(fā)展迅速,其中雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最為普遍的技術(shù),其具有包含信息量大、分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、高效靈敏準(zhǔn)確的特點(diǎn),但在具體實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)于樣品制備的要求較為嚴(yán)格,除應(yīng)注意增加樣品中總蛋白 (尤其是疏水性蛋白)的溶解度和減少制備過程中對(duì)蛋白的人為修飾外,還應(yīng)該注意盡可能去除高豐度蛋白和無關(guān)蛋白,保證研究蛋白的可檢出性不受干擾。卵泡液中含量較高的蛋白質(zhì)組分包括ALB和IgG。去除高豐度蛋白是蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)樣品制備過程中的首要任務(wù),是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。

本實(shí)驗(yàn)使用的ProteoExtract? Albumin/IgG Removal Kit是利用免疫親和層析的原理去除體液中的Albumin/IgG的。特異性強(qiáng)是抗體親和層析方法的重要特點(diǎn)。即將抗高豐度蛋白(Albumin、IgG等)的抗體偶聯(lián)到惰性介質(zhì)(樹脂、葡聚糖等)上,樣品在穿流介質(zhì)過程中,高豐度蛋白被吸附在介質(zhì)上；低豐度蛋白穿流而下,再經(jīng)過濃縮,使得低豐度蛋白在總蛋白中的含量增加,提高蛋白質(zhì)的檢出率[11-12]。人和綿羊的ALB在氨基酸序列上并不完全相同。本試驗(yàn)中所用的Albumin/IgG Removal Kit試劑盒所攜帶的抗體識(shí)別人的抗原特異性強(qiáng),而識(shí)別綿羊的ALB能力弱,甚至不識(shí)別綿羊的IgG,故去除效率低。該類試劑盒對(duì)水牛[6]和狗[10]卵泡液高豐度蛋白的去除效果亦不理想,處理后高豐度蛋白含量仍然很高。因此這類基于抗體親和層析人的體液高豐度蛋白去除試劑盒并不適合于家畜的卵泡液樣品的處理。只有首先具有特異于綿羊的高豐度蛋白抗體才可以更加有效地使用該類試劑盒。

A:未處理的綿羊卵泡液樣品; B:使用ProteoExtract?白蛋白/IgG去除試劑盒實(shí)驗(yàn)組處理后樣品;C:使用PierceTM白蛋白去除試劑盒實(shí)驗(yàn)組處理后樣品。

化學(xué)小分子染料卡巴斯蘭(Cibacron Blue, CB)對(duì)人的ALB親和吸附能力最強(qiáng)(90%),同時(shí)對(duì)綿羊和牛的ALB也具有一定的親合性(分別為39%和22%),并且在低pH值下具有較高的吸附能力[13]。將蛋白樣品與固化到惰性介質(zhì)上的CB共孵育時(shí),高豐度蛋白被結(jié)合上而被去除,從而提高低豐度蛋白質(zhì)在總蛋白中的含量[14-15]。本試驗(yàn)使用的PierceTMAlbumin Depletion Kit是利用CB對(duì)ALB的親和性特點(diǎn)去除該蛋白的。雖然其去除效率高于另一種試劑盒,但該方法的特異性不強(qiáng),還有一些其它分子被去除。

綜合比較這兩種去除高豐度蛋白的試劑盒對(duì)綿羊卵泡液樣品處理的結(jié)果,可以看出這兩種方法均能去除綿羊卵泡液樣品中的高豐度蛋白。PierceTM白蛋白去除試劑盒去除高豐度蛋白的效率比較高,可以達(dá)到富集小分子量低豐度蛋白的目的,但也會(huì)造成部分小分子量蛋白的損失。ProteoExtract?白蛋白/IgG去除試劑盒特異性好,但去除高豐度蛋白的效率不高。因此,相對(duì)而言, PierceTM白蛋白去除試劑盒更適用于綿羊卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品處理,所得的雙向電泳圖譜能夠較好地展現(xiàn)綿羊卵泡液的總蛋白信息,并且有利于后續(xù)質(zhì)譜鑒定工作的開展。

本研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化綿羊卵泡液雙向電泳體系,尋找和鑒定綿羊卵泡發(fā)育過程中的關(guān)鍵蛋白奠定了基礎(chǔ)。未來進(jìn)行家畜體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,還有待于開發(fā)更加高效特異的去除高豐度蛋白的方法。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Comparative Study on Effects of Removing High-abundance Albumin from Sheep Follicular Fluid by Two Different Kits

CHEN Ying1, LI Xiao-lin2, LIN Jia-peng2, WU Yang-sheng2*, HUANG Jun-cheng2*

(1. College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. Key Laboratory of Genetics, Breeding and Reproduction of Grass-feeding Livestock, Ministry of Agriculture / Institute of Biotechnology, Xinjiang Academy of Animal Sciences, Urumqi 830000, China)

We compared the effects of removing high-abundance albumin from sheep follicular fluid by two different kits. The results showed that PierceTMAlbumin Depletion Kit had a high efficiency of removing high-abundance albumin, but its specificity was poor. ProteoExtract? Albumin/IgG Removal Kit had a lower efficiency of removing high-abundance albumin than the former, and it could not effectively remove the IgG from sheep follicular fluid, but it had a better specificity in removing from albumin than the former. The 2-DE electrophoresis patterns showed that the coloration degree and area of albumin district of sheep follicular fluid samples treated with two kits were smaller than those of untreated samples. PierceTMkit had a low recovery efficiency to macromolecular and low-abundance proteins, while ProteoExtract? kit had a low recovery efficiency to small-molecular and low-abundance proteins. In the protein diagram of the samples treated with PierceTMkit, there were more detected points.

Sheep; Follicular fluid; Albumin; Removing method

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1203381);新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2015KL007)。

陳瑩,女,碩士研究生,主要從事家畜繁殖生物技術(shù)的研究。*通訊作者:吳陽升、黃俊成。

S826.89

A

1001-8581(2016)09-0005-04