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    肝肺同治祛風方治療咳嗽變異性哮喘模型大鼠的療效觀察*

    2016-10-17 07:53:40王文麗李冬梅
    天津中醫(yī)藥 2016年8期
    關鍵詞:同治變異性激素

    王文麗,李冬梅,施 雷

    (1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科,沈陽 110032;2.沈陽市皇姑區(qū)中醫(yī)院,沈陽 110032)

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    ·實驗研究·

    肝肺同治祛風方治療咳嗽變異性哮喘模型大鼠的療效觀察*

    王文麗1,李冬梅1,施雷2

    (1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科,沈陽110032;2.沈陽市皇姑區(qū)中醫(yī)院,沈陽110032)

    [目的]觀察肝肺同治祛風法對咳嗽變異性哮喘(CVA)大鼠模型的療效。[方法]將72只大鼠分為正常對照組、模型對照組、激素吸入組、清肺祛風組、清肝熄風組、肝肺同治組,制備咳嗽變異性哮喘肝郁肺虛病證結合大鼠模型,觀察各組大鼠一般狀態(tài)、肺支氣管病理組織形態(tài)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)嗜酸性粒細胞計數(shù)及測定血清IgE水平的變化。[結果]與正常對照組比較,模型對照組CVA大鼠支氣管管腔狹窄,黏膜增厚,支氣管壁及可見大量嗜酸性粒細胞浸潤,BALF涂片EOS計數(shù)顯著升高,血清中IgE的含量顯著升高,與正常對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。激素治療組及各中藥治療組,各項指標均有顯著改善,與模型組比較有顯著性差異(P<0.01),以激素治療組及肝肺同治組指標改善最為顯著。[結論]肝肺同治法可改善肝郁肺虛的中醫(yī)證候,降低CVA模型大鼠慢性氣道炎癥反應,調整免疫異常。

    咳嗽變異性哮喘;大鼠;肝郁肺虛;肝肺同治;IgE

    咳嗽變異性哮喘(CVA)是以反復發(fā)作的慢性咳嗽為特征的一種特殊類型哮喘,兒童患病率為0.77%~5.0%[1]。由于CVA的臨床表現(xiàn)不典型,缺乏特異性,常被忽視或誤診,可能會給予抗生素長期治療而療效不佳[2]。有研究發(fā)現(xiàn)其復發(fā)率較高達30%,可能與患者經(jīng)常接觸過敏原有關[3]。CVA發(fā)病迅速、陣發(fā)性、易反復發(fā)作等特點與風邪為“百病之長,善行數(shù)變”、“其性輕揚,風盛則攣急”的特點相似。外風責之于肺,內風責之于肝,肝郁肺虛,木火刑金,肝肺同病則發(fā)為咳嗽。中醫(yī)藥在防治兒童CVA方面具有獨到優(yōu)勢,可以彌補西醫(yī)治療的不足[4],本研究通過觀察自擬肝肺同治祛風方對CVA模型大鼠氣道慢性炎癥的作用,觀察其改善氣道慢性變態(tài)反應性炎癥的效應,探討從風論治CVA作用機制。

    1 材料與儀器

    1.1動物4周齡雄性SPF級SD大鼠72只,體質量(100±10)g,遼寧長生生物技術有限公司(許可證編號:[動]SCXK(遼)2010-0001)。

    1.2試劑卵蛋白(ovalbumin OVA):Sigma公司,GradeII;氫氧化鋁的生理鹽水溶液沈陽市試劑三廠(批號:080714);辣椒素溶液:上海紫一試劑公司(批號:20110514);IgE酶聯(lián)免疫試劑盒:(武漢博士德生物工程有限公司)。

    1.3藥物普米克令舒(吸入用布地奈德):葛蘭素史克制藥(重慶)有限公司,國藥準字H20010389,購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院西藥局。清肺祛風方(黃芩、荊芥、蟬蛻、防風、甘草),清肝熄風方(地龍、鉤藤、白芍、五味子、甘草),肝肺同治方(黃芩、荊芥、蟬蛻、防風、地龍、白僵蠶、鉤藤、白芍、五味子、麥門冬、甘草)諸藥材,購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中草藥局,經(jīng)藥師鑒定為道地藥材。常規(guī)水煎煮,濃縮為每毫升1 g生藥溶液,備用。

    1.4儀器透明霧化吸入箱,自制;INQUA NEBplus型壓縮霧化吸入機,INQUA GmbH公司,德國;精密轉輪切片機(LEICA RM2135);系統(tǒng)生物顯微鏡(OLYPUS BX50F4)。

    2 方法

    2.1造模與分組采用隨機數(shù)字表法將72只大鼠分為正常對照組、模型對照組、激素吸入組、清肺祛風組、清肝熄風組、肝肺同治組,每組均12只。清潔動物房內室溫下常規(guī)飼養(yǎng)7 d,自由食水,記錄各組大鼠體質量、呼吸、進食水量、肛溫情況。

    造模方法:卵蛋白氫氧化鋁致敏激發(fā)CVA大鼠,煙熏方法復制肺氣虛大鼠模型[5],長期激怒法建立肝氣郁結、肝火犯肺動物模型[6-7],采用復合因素建立CVA肝郁肺虛病證結合動物模型[8]。

    2.2給藥造模第16日,第1次卵蛋白生理鹽水溶液霧化激發(fā)次日開始給藥,霧化攻擊前30 min灌胃給藥,非霧化日常規(guī)給藥,連續(xù)給藥15 d。中藥治療組每日灌胃等效劑量中藥復方[9],每日每千克體質量12 g生藥量,每日1次,共15 d。正常對照組、模型對照組及激素治療組灌胃等量生理鹽水。激素治療組大鼠放入透明霧化箱中,噴入普米克令舒生理鹽水溶液,吸入量為0.6 mL/kg體質量,濃度為20%,每日1次,共15 d。

    2.3標本處理造模第30天,辣椒素激發(fā)引咳試驗后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,打開胸腔,心臟穿刺取血,置于普通試管,靜置30 min,取上層血清,-80℃保存?zhèn)溆?。結扎右主支氣管,分離右肺上、中、下葉,右肺中葉置于新鮮配制的中性4%多聚甲醛固定液中。

    支氣管肺泡灌洗液(BALF)回收:以眼科剪在氣管上剪一斜口,插管,把針頭和氣管一起固定結扎,左肺肺泡灌洗,分別取0.8、0.8、0.5 mL,0.01 mol/L PBS依次灌洗3次,灌洗液回收率>90%。BALF于1 500 r/min離心10 min,細胞沉淀用1 mL PBS重懸,取約30 μL細胞懸液,甩片晾干,95%的乙醇固定,常規(guī)HE染色,光鏡下進行細胞分類計數(shù)。計數(shù)200個細胞,得出嗜酸性粒細胞數(shù)量。

    2.4觀測指標大鼠一般狀態(tài)觀察、肺支氣管病理組織形態(tài)學觀察、BALF嗜酸性粒細胞計數(shù)、ELISA法檢測血清IgE含量。

    2.5統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行錄入及分析,計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

    3 結果

    3.1大鼠一般狀態(tài)觀察造模前各組大鼠體質量、呼吸、進食水量、肛溫等情況基本一致,無統(tǒng)計學差異。正常對照組大鼠體質量穩(wěn)定增長,呼吸平穩(wěn),行動靈活,反應靈敏,毛色光澤。模型組體質量增長明顯減慢,各治療組體質量較模型組增長明顯,但仍低于正常對照組。模型組及各治療組霧化激發(fā)后出現(xiàn)煩躁不安、拱背蜷縮,皮毛黃濕無光澤,時有脫落,消瘦,呼吸急促、咳嗽喘息等癥狀。

    3.2大鼠肺、支氣管形態(tài)學檢測正常對照組肺內各級支氣管結構正常,支氣管壁及其周圍組織結構清晰,支氣管管壁和平滑肌厚度正常,支氣管上皮細胞完整,管腔內無脫落細胞,間質內無炎癥細胞浸潤。肺泡上皮完整,肺泡壁毛細血管無充血、缺血,肺泡腔內清潔無滲出,可見少量嗜酸性粒細胞。模型對照組支氣管管腔狹窄,黏膜增厚,支氣管上皮纖毛倒伏、缺失,上皮細胞脫落。肺泡腔增大,肺泡間隔及氣道平滑肌明顯增厚,細支氣管管腔擴大,黏液分泌增多,可見大量嗜酸性粒細胞浸潤。與模型組比較,各治療組支氣管組織病理變化明顯減輕,激素治療組、肝肺同治組織病理改善更明顯。見圖1。

    圖1 大鼠肺、支氣管組織病理(HE染色×200)Fig.1 Pathology figure of lung and bronchia in rats(HE×200)

    3.3BALF細胞計數(shù)與正常對照組比較,模型對照組BALF涂片EOS計數(shù)顯著升高(P<0.01);與模型對照組相比,各治療組EOS計數(shù)明顯降低,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),其中以激素治療組、肝肺同治組降低最明顯。見表1。

    表1 BALF嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)(±s)Tab.1 BALF EOS count(±s)

    表1 BALF嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)(±s)Tab.1 BALF EOS count(±s)

    注:與空白對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01。

    組別 動物數(shù) EOS(個/200個細胞)正常對照組 12 1.55±1.23模型對照組 11 32.46±5.62*激素治療組 12 7.58±4.55*#清肺祛風組 12 12.48±2.56*#清肝熄風組 12 15.62±5.74*#肝肺同治組 12 8.32±3.47*#

    3.4ELISA法檢測大鼠血清中IgE含量與正常對照組比較,模型對照組IgE含量顯著升高(P<0.01);與模型對照組相比,各治療組IgE的含量明顯降低,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),其中以激素治療組、肝肺同治組降低最明顯。見表2。

    表2 ELISA法檢測大鼠血清中IgE的含量(±s)Tab.2 Detection IgE of serum in rats by ELISA(±s)

    表2 ELISA法檢測大鼠血清中IgE的含量(±s)Tab.2 Detection IgE of serum in rats by ELISA(±s)

    注:與空白對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01;與激素治療組比較,△P<0.05。

    組別 動物數(shù) IgE(U/mL)正常對照組 12 6.53±1.25模型對照組 11 21.22±2.01*激素治療組 12 9.58±1.46#清肺祛風組 12 15.48±1.95#△清肝熄風組 12 13.45±2.11#△肝肺同治組 12 10.26±1.64#

    4 討論

    CVA傳統(tǒng)中醫(yī)病因病機為為宿痰伏肺、復感外邪,遇外感引觸[10],《景岳全書》[11]指出:“喘有夙根,遇寒即發(fā),或遇勞即發(fā)者,亦名哮喘。”《普濟本事方》[12]中述“此癥有苦至終身者,亦有母子相傳者”。CVA表現(xiàn)為反復發(fā)作的刺激性干咳,具有陣發(fā)性、痙攣性的特點,常伴有鼻塞、流涕、鼻癢等癥狀[13],與中醫(yī)“風”發(fā)病迅速、“善行而數(shù)變”、“風盛則癢”的致病特點相符,提示風邪是本病發(fā)生、發(fā)展和演變過程中主要致病因素[14]。小兒為稚陰稚陽之體,素體肺虛易感外風,CVA病初患兒見鼻塞、咽癢、流涕、鼻癢,為外風襲肺;內風者,乃肝木化風所致,小兒素體肺常不足、肝常有余,既有金行的虛弱不足,又有木行的過于亢盛,則肺金易被肝木反克。素體陰虛,水不涵木,陰虛風動而內風上擾,木叩金鳴而咳。CVA患兒先天稟賦不足,具有特應性體質,易生風化痰。《讀醫(yī)隨筆》[15]曰“凡病之氣結……哮喘,皆肝氣不能舒暢所致也?!崩顝┚龋?6]也認為,一旦感受風寒之邪氣,外風引動內在的伏風,內外之邪相合,導致肺失宣降,發(fā)生CVA。所以,CVA患兒常由于治不得法而外邪不解,邪郁于肺,引動內風,風動上擾,內外風相合則金鐘動搖,宣肅失司,發(fā)為咳嗽[17]。

    本研究以卵蛋白氫氧化鋁致敏激發(fā)CVA大鼠,模型大鼠出現(xiàn)呼吸急促、煩躁、咳嗽、前肢縮抬、腹肌收縮、可聞及哮鳴音等呼吸道痙攣癥狀,符合CVA臨床特點[18]。以中醫(yī)五行生克制化理論為依據(jù),模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因,選擇幼齡大鼠,取其幼齡肺常不足,煙熏致肺氣益虛,易感外風;幼鼠素體陰常不足、陰液虧虛,長期激怒使肝氣郁結,肝木化風,木火刑金,肺虛肝旺。模型大鼠煙熏過程中,逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、體質量增長緩慢、間斷咳嗽,提示肺虛;大鼠煩躁不安,抓咬模具,易激惹,自發(fā)活動增多提示肝氣郁結,肝陽上亢;呼吸急促,無刺激狀態(tài)下咳嗽次數(shù)較正常組增多提示肝氣犯肺,肝陽化風。

    在辨證論治的基礎上,依據(jù)方劑的功效或其組成藥物的功效推測或反證其對應證候的屬性[19-20],即為以方測證。本CVA肝肺通病證候病位在肺,病本在肝,應重在肝肺同治,故用自擬肝肺同治方。以黃芩、荊芥、蟬衣、防風清肺止咳化痰;地龍、僵蠶、鉤藤清肝瀉火、止咳平喘,白芍、五味子、麥冬、甘草養(yǎng)陰柔肝。內外合治,使肝火不刑肺金,則肺宣肅復常,咳嗽自止。研究結果顯示,肝肺同治祛風法可以減輕大鼠氣道嗜酸性粒細胞浸潤、大鼠氣道病理組織變化及降低血清IgE水平。尤其在改善肝火犯肺的中醫(yī)證候方面,明顯優(yōu)于激素治療組,提示中醫(yī)辨證治療即可以有效改善患兒氣道慢性炎癥反應,同時可能改善CVA患兒煩躁、多動等的中醫(yī)證候,提高患兒生存質量。

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    (本文編輯:馬英,于春泉)

    Observation on the curative effect of eliminating wind prescription of treatment lung and liver together in CVA rats

    WANG Wen-li1,LI Dong-mei1,SHI Lei2
    (1.Department of Paediatrics,The Affiliated Hospital of LiaoningUniversity of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;2.Huanggu District Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

    [Objective]To investigate the curative effect of eliminating wind prescription of treatment lung and liver together in CVA rats. [Methods]The combination of disease and syndrome animal model of CVA rats was established by traditional Chinese medicine(TCM)etiology and Western medicine etiology pathology,then they were randomly divided into normal group,model group,hormone inhaling group,clear lung heat and eliminating wind evil method group,clear liver to stop wind group,both lung and Liver treatment group. Observation the rat general state,spontaneous activity,cough response,bronchial lung pathology organization form,bronchoalveolar lavage fluid(BALF)eosinophil count and serum IgE.[Results]Comparison with normal rats,the bronchial lumen of the model group rats were stenosis,mucosal thickening,numerous eosinophils infiltration on bronchial wall,the EOS counting was significant rise in BALF smear,the content of serum IgE was significantly increased(P<0.01).Comparison with model rats,bronchial lung pathology,the EOS counting and serum IgE content of hormone inhaling group and TCM treatment group were significantly increased(P<0.01),especially the hormone inhaling group and treating both lung and liver group.[Conclusion]Treating lung and liver together could significantly improved the TCM syndrome of liver depression and lung deficiency,reduced the chronic airway inflammation of CVA model rats and regulate the immune abnormalities.

    cough variant asthma;rat;liver depression and lung deficiency;treating lung and liver together;IgE

    R562.25

    A

    1672-1519(2016)08-0472-04

    10.11656/j.issn.1672-1519.2016.08.08

    2016-03-30)

    遼寧省教育廳科學技術研究一般項目(L2013368)。

    王文麗(1974-),女,博士研究生,副主任中醫(yī)師,研究方向為中醫(yī)藥防治小兒咳喘病證研究。

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