不同采收期枳實(shí)促胃腸動(dòng)力作用及其辛弗林含量的比較研究

鄧敏芝　鄧可眾　陳　虹　吳華強(qiáng)　熊　英

江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西　南昌　330004

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不同采收期枳實(shí)促胃腸動(dòng)力作用及其辛弗林含量的比較研究

鄧敏芝鄧可眾陳虹吳華強(qiáng)熊英*

江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004

目的：比較不同采收期枳實(shí)促胃腸動(dòng)力作用及辛弗林含量的差異。方法：使用不同采收期枳實(shí)的提取物對(duì)正常小鼠連續(xù)灌胃7d，測(cè)定在體小腸碳末推進(jìn)率和胃殘留率；利用HPLC測(cè)定辛弗林的含量。結(jié)果：不同采收期枳實(shí)中辛弗林含量以及對(duì)正常小鼠的小腸推進(jìn)作用均存在一定差異，但辛弗林含量的高低與小腸推進(jìn)作用并不呈線性相關(guān)。結(jié)論：枳實(shí)促胃腸動(dòng)力可能是其中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，枳實(shí)藥材宜增加相關(guān)活性成分分析建立多指標(biāo)質(zhì)量控制方法。

枳實(shí)；辛弗林；胃腸動(dòng)力；不同采收期

枳實(shí)來(lái)源于蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙C.sinesisOsbeck 的干燥幼果[1]，江西是枳實(shí)的道地產(chǎn)區(qū)之一，而江西新干縣、樟樹(shù)等道地產(chǎn)區(qū)資源調(diào)查表明,江枳實(shí)的基源植物主要為酸橙。目前，中國(guó)藥典以辛弗林含量作為枳實(shí)藥材質(zhì)量控制的定量指標(biāo)。文獻(xiàn)分析不同品種如酸橙和甜橙、不同產(chǎn)地如江西、四川、湖南及福建枳實(shí)藥材中的辛弗林含量差異較大[2]，炮制方法和采收時(shí)間也有顯著影響[3]，且隨著果實(shí)的逐步發(fā)育成熟，辛弗林的含量呈降低趨勢(shì)[4-5]。關(guān)于辛弗林含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)研究也屢見(jiàn)報(bào)道，如2D-HPLC[6]、固相萃取-HPLC等[7]。枳實(shí)為常用理氣類中藥，研究表明枳實(shí)水煎液和辛弗林能促進(jìn)正常小鼠小腸推進(jìn)[8-9]，枳實(shí)還可改善功能性消化不良大鼠的胃排空[10]。

采收時(shí)間是影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一，酸橙在每年春季5月初開(kāi)花，5月中下旬至6月下旬自然脫落的幼果作為藥材枳實(shí)，至7月初果皮尚綠時(shí)的未成熟果實(shí)則當(dāng)作枳殼藥用；部分植株在秋季可二次開(kāi)花結(jié)果，其幼果也被當(dāng)作枳實(shí)銷售。不同采收期枳實(shí)藥材的大小較為懸殊，從小到大依次稱為雞眼枳實(shí)、鵝眼枳實(shí)、小片、中片及大片。這些枳實(shí)均在市場(chǎng)上銷售、使用，然在在藥效方面是否存在顯著性差異尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，秋季枳實(shí)中的成分和藥效等各方面亦無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)觀察不同采收期枳實(shí)對(duì)在體小鼠小腸碳末推進(jìn)率和胃殘留率的差異，并結(jié)合HPLC測(cè)定相應(yīng)的辛弗林含量進(jìn)行對(duì)比分析，為制定適宜采收期及完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1藥材2014年采集于江西省樟樹(shù)市昌傅鎮(zhèn)下余村，1～4號(hào)分別為5月下旬、6月中旬、6月下旬及10月中旬采收，經(jīng)鑒定為蕓香科植物酸橙C.aurantiumL.的幼果。

1.2動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠50只，體重 20～25 g，雄性，由江西中醫(yī)藥大學(xué)陽(yáng)明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(贛)2011-0001。1.3儀器Agilent 1260 高效液相色譜儀(G1311C四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B DAD檢測(cè)器、Agilent 1260LC化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent Technologies公司)，METTLER TOLEDO XS3DU百萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

2　小腸推進(jìn)及胃排空作用的實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1藥物的制備分別稱取枳實(shí)藥材適量，粉碎為中粉，加入適量蒸餾水，水煎煮提取2次，每次30min，合并濾液并濃縮，制成每1mL相當(dāng)于1g原藥材的提取液。

2.2給藥及指標(biāo)測(cè)定50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即4個(gè)枳實(shí)樣品組和空白對(duì)照組。樣品組小鼠按4g/Kg分別給予不同產(chǎn)地枳實(shí)提取物，空白組給予等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥7d，每日1次。末次給藥后，動(dòng)物禁食12h，小鼠灌胃給予炭末混懸液0.5mL (2%CMC-Na和5%炭末)，20min后處死動(dòng)物，剖腹取出上端自幽門(mén)、下端至回盲部的腸管，鋪直后測(cè)量幽門(mén)至回盲部全長(zhǎng)(小腸總長(zhǎng)度)及幽門(mén)至炭末前沿的距離(炭末推進(jìn)長(zhǎng)度)，計(jì)算小腸推進(jìn)百分率；結(jié)扎上述小鼠的胃賁門(mén)和幽門(mén)，取濾紙拭干后稱全重,然后沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后用濾紙拭干，稱取胃凈重，胃全重和胃凈重差值為胃內(nèi)殘留物重，并計(jì)算與所灌炭末混懸液質(zhì)量的百分比為胃殘留率。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4結(jié)果由表1可知，樣品組碳末小腸推進(jìn)率均大于空白組，其中1、3號(hào)枳實(shí)組的小腸推進(jìn)率與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。不同采收期枳實(shí)的碳末小腸推進(jìn)率同樣存在一定差異性，1號(hào)和2號(hào)、4號(hào)之間存在存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。所有樣品組的胃殘留率和空白組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1　不同采收期枳實(shí)對(duì)正常小鼠小腸推進(jìn)作用、胃排空的影響　±s)

注：與空白組比較,*P<0.05；與2號(hào)、4號(hào)比較，#P<0.05。

3　HPLC測(cè)定辛弗林的方法與結(jié)果

3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性色譜柱：TSK-GEL ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75，水中加0.1%磷酸和0.1%SDS)；流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；理論塔板數(shù)>15000。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取辛弗林適量，加甲醇溶解于容量瓶中配制成693.00 μg/mL濃度的對(duì)照品溶液。

3.3樣品溶液的制備取藥材中粉適量，精密稱定，按2015版中國(guó)藥典一部枳實(shí)項(xiàng)下含量測(cè)定相同方法進(jìn)行制備[1]。3.4線性關(guān)系的考察將配置好的母液稀釋成693.00、346.50、173.25、86.63、43.31、21.66、10.83、5.41、2.71μg/mL等一系列濃度梯度的對(duì)照品溶液。按照“3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣20μl測(cè)定，計(jì)算峰面積Y與濃度X的線性方程、檢測(cè)限及定量限，得回歸方程：Y=4.2843X+5.2456(r=0.9998)，在2.71～693.00μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為1.31μg/mL，定量限為4.36μg/mL。

3.5精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算辛弗林峰面積的RSD為0.49%，表明精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(2014年5月下旬采集于江西新干縣，批號(hào)：S9)，分別于0、2、4、6、8、24 h時(shí)進(jìn)樣，結(jié)果，辛弗林峰面積的RSD為1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一份樣品適量6份(批號(hào)：S9)，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，辛弗林含量的RSD為1.95%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.8回收率試驗(yàn)稱取枳實(shí)粉末(批號(hào)：S9)0.5g 6份，精密加入一定量的辛弗林對(duì)照品溶液，按“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，同上分析條件測(cè)定含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果　(n=6)

3.9樣品含量測(cè)定取不同采收期枳實(shí)藥材的水提物，按“3.2.2”項(xiàng)下方法平行制備2份供試品溶液，同以上色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果　(%，n=2)

由含量測(cè)定結(jié)果可知，不同采收期包括秋季采集江枳實(shí)中辛弗林含量均符合2015版藥典標(biāo)準(zhǔn)(>0.3%)，其中以5月底收集的樣品辛弗林含量為最高，隨果實(shí)生長(zhǎng)其中所含辛弗林呈逐步下降趨勢(shì)，在采收末期6月下旬下降約為一半；藥理實(shí)驗(yàn)表明枳實(shí)的水提物對(duì)正常小鼠小腸具有明顯的推進(jìn)作用，對(duì)正常小鼠胃排空無(wú)明顯影響，不同采收期枳實(shí)對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用也存在一定的差異性，以5月下旬收集樣品的活性最強(qiáng)，6月中旬、下旬收集樣品和秋季枳實(shí)對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用雖有所減弱，但辛弗林含量最低的6月下旬采集樣品的小腸推進(jìn)作用并非為最弱，二者對(duì)比分析，枳實(shí)對(duì)正常小鼠的小腸推進(jìn)作用與其中辛弗林含量的變化趨勢(shì)并不完全呈線性相關(guān)。

4　討論

不同采收期枳實(shí)中辛弗林的含量以及對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用均有明顯差異，5月下旬收集枳實(shí)中辛弗林含量高且活性強(qiáng)，但此時(shí)果實(shí)極小，直徑僅約0.5 cm左右，6月底采收的枳實(shí)直徑最大，約2～2.5 cm，雖含量最低但活性較好，根據(jù)對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用及藥材大小分析，枳實(shí)在5月下旬或者6月下旬采收較佳。

前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道表明枳實(shí)中化學(xué)成分除辛弗林外，還含有較多的黃酮類如新橙皮苷、柚皮苷以及香豆素類如馬爾敏、水合橙皮內(nèi)酯，其中，新橙皮苷的含量可高達(dá)20%以上[11-12]，而且枳實(shí)黃酮和香豆素均有胃腸動(dòng)力作用[13-14]。因此藥典標(biāo)準(zhǔn)中枳實(shí)藥材僅以辛弗林為定量指標(biāo)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)尚需進(jìn)一步完善，建議建立生物堿、黃酮以及香豆素類多指標(biāo)性成分分析的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

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(編輯：程鵬飛)

Comparative Study of Synephrine and Gastrointestinal Motility of Aurantii Fructus Immaturus in Different Harvesting Stage

DENG MinzhiDENG KezhongCHEN HongWU HaqiangXIONG Ying*

Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004,China

Objective Study on effects of different harvesting stage on synephrine and gastrointestinal motility of Aurantii Fructus Immaturus. Methods The mice were administered with aqueous extract of Aurantii Fructus Immaturus for 7 days, then gastric residue rate and small intestine advancing rate were detected; The content of synephrine were measured by HPLC. Results Aurantii Fructus Immaturus at different collecting times has different amounts of synephrine and the small intestinal propulsive function. Furthermore, the relationship between content of synephrine and the small intestinal propulsive function is not co-linear. Conclusion The pharmacological action possible is the results of many bioactive ingredients together and more bioactive ingredients in Aurantii Fructus Immaturus should be used as the index of quality control.

Aurantii Fructus Immaturus; Synephrine; Gastrointestinal Motility; Different Harvesting Stage

2016-06-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260621)。

鄧敏芝(1990-),女,漢族，碩士研究生，主要從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail:dmzsunflower@163.com

熊英(1975-),女，漢族，副教授，博士，主要從事中藥活性成分研究。E-mail:jzxiongying@126.com

R284.1

A

1007-8517(2016)17-0014-04