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    晚期骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨祖細胞的特性研究

    2016-10-17 09:05:46蔣超王以朋邱貴興吳志宏翁習(xí)生
    關(guān)鍵詞:松質(zhì)骨祖細胞成骨

    蔣超 王以朋 邱貴興 吳志宏 翁習(xí)生

    (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科,北京100730)

    ·基礎(chǔ)研究·

    晚期骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨祖細胞的特性研究

    蔣超王以朋邱貴興吳志宏翁習(xí)生*

    (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科,北京100730)

    背景:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)又名退行性骨關(guān)節(jié)病,對其治療目前局限于早期的保守治療和晚期的關(guān)節(jié)置換。晚期OA患者軟骨下是否具有間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstem cells,MSCs)決定了骨髓刺激技術(shù)可否用于晚期軟骨缺損為主要表現(xiàn)的OA患者。但晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨是否具有MSCs仍不明確。目的:探討晚期OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨下是否具有成軟骨分化能力的松質(zhì)骨祖細胞,為晚期膝OA患者軟骨自身修復(fù)的研究奠定基礎(chǔ)。方法:5例因晚期膝OA行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的術(shù)中標本,取其軟骨下松質(zhì)骨,經(jīng)分離培養(yǎng)后得到貼壁細胞,傳代培養(yǎng)后行流式細胞儀分析細胞表面抗原;成骨、成脂、成軟骨分化后分別行堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色、油紅O染色、阿利新藍、Ⅱ型膠原和聚蛋白聚糖組織化學(xué)染色,Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、聚蛋白聚糖及SOX-9基因表達水平實時聚合酶連反應(yīng)(Real-Time PCR,RT-PCR)測定。結(jié)果:從晚期膝OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)獲得的貼壁細胞的細胞表面抗原基本符合MSCs標準,且具有成骨、成脂、成軟骨分化能力。結(jié)論:晚期OA患者軟骨下存在具有干細胞性質(zhì)、可進行體外成軟骨分化的松質(zhì)骨祖細胞。該發(fā)現(xiàn)可為“一步式——微骨折處理-成軟骨誘導(dǎo)材料填充-軟骨修復(fù)”治療理念提供一定依據(jù)。

    骨關(guān)節(jié)炎;間質(zhì)干細胞;軟骨細胞

    【Abstract】Background:Bonemarrow stimulation can be used in end-stage osteoarthritis patients in w hom cartilage defects mainly presents only when there weremesenchymal stem cells(MSCs)in the subchondral zone of the knee.But the existence of MSCs in the end-stage osteoarthritis patients is still unknown.Objective:To analyzemulti-differentiation capacity of cells derived from human subchondral bone in patientsw ith end-stage knee osteoarthritis.Methods:Human progenitor cellsw ere isolated and derived from subchondral cortico-spongious bone chips from 5 patientsundergoing total knee arthroplasty due to end-stage osteoarthritis.Mesenchymalstem cell related cell surface antigenswere analyzed by flow cytometry. A fter in vitro osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation,alkaline phosphatase activity,Alizarin red staining,Oil Red O staining,A lcian blue staining and immunohistochem ical staining for collagenⅡand Aggrecan w ere conducted. Real-time PCRwasperformed to confirm related geneexpression of chondrogenic differentiation,such ascollagenⅠ,collagenⅡ,Aggrecan and SOX-9.Results:Surface antigens of successfully-cultured cells from subchondral cortico-spongious bone chipsw ere almost in accord w ith those of MSCs.And the cells had the ability of osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation.Conclusions:Multi-potential progenitor cells do exist in subchondralbone in the kneeof patientswith end-stageosteoarthritis.

    【Keywords】Osteoarthritis;Mesenchymal Stem Cells;Chondrocytes

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)又名退行性骨關(guān)節(jié)病,是世界范圍內(nèi)的慢性致殘性疾病之一[1]。其具體發(fā)病機制目前尚不清楚,但關(guān)節(jié)面軟骨破壞是其主要病理改變。目前對于晚期OA患者,行關(guān)節(jié)置換術(shù)是緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能的唯一有效治療方案,但存在嚴重不良反應(yīng)等風險。對于早期OA及其他病因?qū)е碌能浌侨睋p,臨床上多采用骨髓刺激技術(shù)比如微創(chuàng)微骨折處理[2,3],該技術(shù)通過打通骨髓和軟骨缺損表面,幫助間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstem cells, MSCs)從骨髓遷移到軟骨缺損區(qū)進行成軟骨分化,從而修復(fù)缺損區(qū)。盡管既往的臨床經(jīng)驗和研究不建議該技術(shù)用于晚期OA患者的治療[4,5],但隨著近些年國內(nèi)外對MSCs的研究越來越深入,各種促軟骨分化誘導(dǎo)因子和材料被發(fā)現(xiàn),使通過細胞組織工程技術(shù)修復(fù)晚期OA患者軟骨缺損成為可能[6-13]。如能證實晚期OA患者關(guān)節(jié)軟骨下存在具有成軟骨分化能力的松質(zhì)骨祖細胞,將為該治療方法提供進一步的基礎(chǔ)和理論依據(jù),從而提供可能的“一步式——微骨折處理-成軟骨誘導(dǎo)材料填充-軟骨修復(fù)”治療方法。所謂“一步式”,即一次關(guān)節(jié)鏡操作下完成軟骨缺損區(qū)的材料填充,而不需要通過骨髓獲取間充質(zhì)干細胞,體外培養(yǎng)后再植入關(guān)節(jié)腔內(nèi)的多次操作。

    1 材料與方法

    1.1實驗研究對象

    選取2013年10月至2013年12月行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的晚期OA患者5例,其中男2例,女3例;年齡54~79歲,平均67歲;OA診斷均符合美國風濕病學(xué)會膝骨關(guān)節(jié)炎臨床診斷標準[14],所有患者除外腫瘤、全身感染、類風濕關(guān)節(jié)炎、血友病性關(guān)節(jié)炎等,術(shù)前12個月未進行過有創(chuàng)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)治療,未長期使用包括激素、免疫抑制劑等藥物,無長期抽煙、酗酒等。本實驗使用手術(shù)廢棄組織,已通過北京協(xié)和醫(yī)院臨床試驗倫理委員會同意。入組患者信息見表1。

    表1 入組患者基本資料

    1.2主要實驗試劑、儀器

    人成脂肪、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(R&D公司,美國);人MSCs專用培養(yǎng)基(Science Cell公司,美國);小鼠抗人CD146、CD45、CD90等熒光標記的流式檢測抗體(BD公司,美國);小鼠抗人聚蛋白聚糖(Aggrecan)抗體、Ⅱ型膠原抗體、Ⅰ型膠原抗體(Abcam公司,美國);茜素紅、阿利新藍、油紅O染色試劑盒(Sigma公司,美國);堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);實時聚合酶連反應(yīng)(Real-Time PCR,RT-PCR)相關(guān)產(chǎn)品(Takara公司,日本);流式細胞儀(BD公司,美國)。

    1.3軟骨下松質(zhì)骨祖細胞分離及培養(yǎng)

    在無菌條件下用咬骨鉗將膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)中所截取脛骨平臺及股骨髁軟骨下松質(zhì)骨處理成2~3mm大小的骨顆粒,經(jīng)PBS反復(fù)清洗除去表面所附脂肪、血液等異物。將松質(zhì)骨顆粒置于25 cm2培養(yǎng)瓶,加入7m l含10%胎牛血清、100U/m l青霉素、100mg/m l鏈霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM-高糖培養(yǎng)基,輕輕晃動使松質(zhì)骨顆粒均勻平鋪。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6 d,期間不換液,直至顯微鏡下可見骨組織周圍出現(xiàn)一定數(shù)量的梭狀貼壁細胞時進行第1次換液,并且用PBS清洗除去松質(zhì)骨顆粒,改用MSCs增殖培養(yǎng)基,每3 d換一次液。7~9 d后原代細胞鋪滿瓶底90%左右,以0.25%胰蛋白酶消化,進行細胞傳代或凍存。取第1代細胞進行細胞表面抗原流式檢測,第3代細胞行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化。

    1.4細胞表面抗原流式細胞儀檢測

    取第1代細胞經(jīng)PBS清洗2次,PBS重懸濃度1×105個/μL,冰上操作,加適量小鼠抗人CD14-FITC、CD19-APC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-APC、CD105-FITC、CD146-PE、CD166-PE、HLA-DR-APC等抗體,4℃孵育30m in,用同種同型非相關(guān)IgG抗體孵育作為陰性對照。孵育完成后用含1%牛血清白蛋白的PBS清洗細胞2次,再將細胞重懸于200μL PBS上機檢測。

    1.5成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化

    1.5.1成骨、成脂誘導(dǎo)分化:取第3代細胞(n=5例),胰酶消化后重懸計數(shù),參考成骨、成脂肪分化培養(yǎng)基說明書,以5×104個/孔的密度接種于含有細胞爬片的24孔板中,MSCs增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞貼壁匯合至70%~80%后改為添加成骨誘導(dǎo)因子的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng),每3 d換液一次,同時設(shè)以干細胞增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為陰性對照,所加培養(yǎng)基量和操作均保持一致。誘導(dǎo)21 d后4%多聚甲醛固定,行茜素紅染色及堿性磷酸酶活性測定。同樣方法消化、計數(shù)、接種細胞與24孔板,MSCs增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞貼壁匯合至90%~100%后改添加成脂誘導(dǎo)因子的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,同時設(shè)以干細胞增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為陰性對照,每3 d換液一次,直至誘導(dǎo)21 d,行油紅O染色檢測。

    1.5.2成軟骨誘導(dǎo)分化:參考微球培養(yǎng)法[15],同上方法將細胞以2.5×105個/孔濃度接種與含0.2m l干細胞增殖培養(yǎng)基的U-型底96孔板中,室溫、200 g離心5m in,隨即置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。24 h后通過200μL移液槍沿著孔壁輕輕吹打U-型底孔板內(nèi)細胞薄膜層使其懸浮(注意勿破壞細胞層完整性),隨后實驗組改用含有成軟骨誘導(dǎo)因子的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,對照組為干細胞增殖培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每3 d換液一次,在此過程中細胞微球逐漸形成。誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后行阿利新藍染色,聚蛋白聚糖(aggrecan)、人Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。同時將同組細胞微球收集后提取總RNA,RT-PCR測定成軟骨相關(guān)基因Ⅱ型膠原、aggrecan、SOX-9和Ⅰ型膠原的表達量。

    2 結(jié)果

    2.1松質(zhì)骨祖細胞形態(tài)及細胞表面抗原檢測

    原代松質(zhì)骨祖細胞在培養(yǎng)4~6 d后逐漸從骨組織遷移至培養(yǎng)瓶,并貼壁生長,細胞呈梭狀、成纖維細胞樣形態(tài)(圖1)。對第1代細胞行流式細胞儀檢測,顯示增殖后的松質(zhì)骨祖細胞基本符合MSCs細胞表面抗原的相關(guān)特征[16],即細胞基本不表達CD14(0.24%)、CD19(0.96%)、CD34(0.47%)、CD45(0.95%)、HLD-DR(0.21%),高表達CD44(98.69%)、CD73(97.94%)、CD90(99.88%)、CD166(91.46%),且CD105(6.13%)、CD146(10.41%)亦呈陽性。

    圖1 A.原代松質(zhì)骨祖細胞從骨組織遷出,貼壁生長(×400);B.第1次傳代之前細胞狀態(tài)為梭形,呈成纖維細胞樣(×100)

    2.2松質(zhì)骨祖細胞成骨、成脂分化研究

    將成骨、成脂肪誘導(dǎo)21 d的細胞及非誘導(dǎo)對照組細胞均分別進行茜素紅染色和堿性磷酸酶活性監(jiān)測以驗證其成骨分化;通過油紅O染色驗證其成脂分化(圖2)。對比分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)分化組茜素紅染色(圖2A)和堿性磷酸酶活性染色均顯示陽性(圖2B),未分化組染色基本為陰性(圖2D和2E);油紅O染色也僅在誘導(dǎo)分化組為陽性(圖2C)。顯示該松質(zhì)骨祖細胞具有明顯的成骨、成脂分化潛能。

    圖2 松質(zhì)骨祖細胞行成骨、成脂分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組予分別行茜素紅染色(A、D)、堿性磷酸酶活性染色(B、E)和油紅O染色(C、F),顯示誘導(dǎo)組染色均呈陽性,而未誘導(dǎo)組為陰性(×100)

    2.3松質(zhì)骨祖細胞成軟骨分化研究

    成軟骨分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組均通過微球培養(yǎng)法培養(yǎng)28 d,隨后收集細胞微球包埋切片,行相關(guān)免疫組化染色和組織染色(圖3)。分化誘導(dǎo)組阿利新藍染色呈陽性(圖3A),未誘導(dǎo)組為陰性(圖3E),提示胞內(nèi)有酸性黏蛋白的出現(xiàn),是干細胞成軟骨分化的可靠指標之一。同時,將組織切片行蛋白聚糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原免疫組化染色,誘導(dǎo)組三者均成陽性(圖3B、C、D);而未誘導(dǎo)組蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫組化染色為陰性(圖3F、H),Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性(圖3G)。

    誘導(dǎo)28 d后將誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組細胞微球分別予以提總RNA,RT-PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrencan、SOX-9基因的mRNA表達水平(圖4),發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組Ⅰ型膠原mRNA的表達較未誘導(dǎo)組下降,前者僅為后者的0.57倍;而Ⅱ型膠原、Aggrecan、SOX-9mRNA的表達較未誘導(dǎo)組顯著升高,其中Ⅱ型膠原表達量前者為后者的88.11倍,Aggrecan表達量前者為后者54.04倍,SOX-9表達量前者是后者41.29倍。上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相關(guān)基因RTPCR引物見表2。

    3 討論

    圖3 松質(zhì)骨祖細胞予成軟骨分化誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d,行免疫組化染色和組織染色

    MSCs的發(fā)現(xiàn)和深入研究[17-19]極大擴展了人們對干細胞的認識,也為臨床上的組織/細胞工程學(xué)開拓了巨大的想象力。目前,在包括骨髓、軟骨、滑膜、脂肪等各個人體組織內(nèi)均已發(fā)現(xiàn)此類細胞的存在。誘導(dǎo)MSCs定向成軟骨分化是目前國內(nèi)外對其研究的熱點之一[10-13]。軟骨缺損亦是OA的主要病理改變,因此誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化來修復(fù)缺損區(qū)可能成為OA治療的新方法。而相比于其他部位獲取MSCs,通過關(guān)節(jié)鏡下微骨折處理,使軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)此類細胞遷移至軟骨缺損區(qū),通過適當方法誘導(dǎo)其高效定向成軟骨分化具有避免二次手術(shù)、簡化治療過程等優(yōu)點。既往研究認為老年和晚期OA患者微骨折處理等方法治療軟骨缺損的效果不理想,不建議在此類人群中使用微骨折治療方法[4,5]。但Scharstuhl等[20]通過對比研究不同人群來源骨髓MSCs分離所得,認為骨髓MSCs的數(shù)量和成軟骨分化能力與年齡、OA嚴重程度無關(guān),進而認為通過MSCs治療OA軟骨缺損是可能的。Neumann等[21]首次報道從健康人腓骨頭松質(zhì)骨內(nèi)分離出具有成軟骨分化能力的間充質(zhì)祖細胞(mesenchymal progenitor cells,MPC),但鮮有文獻報道關(guān)于從老年晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)分離獲得此類細胞。假設(shè)老年晚期OA患者關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)存在具有成軟骨分化能力的祖細胞,可以在臨床上通過微骨折處理,利用此類細胞進行“一步式”軟骨修復(fù),本研究對此進行了驗證。

    圖4 松質(zhì)骨祖細胞經(jīng)28 d成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后,RT-PCR提示Ⅰ型膠原基因表達水平下降;成軟骨相關(guān)基因Ⅱ型膠原、aggrecan、SOX-9的表達水平上升,**P<0.01

    表2 RT-PCR引物

    流式細胞檢測提示該松質(zhì)骨祖細胞表面抗原表達CD73、CD90、CD105,不表達CD14、CD19、CD34、CD45、HLD-DR,符合目前關(guān)于MSCs細胞表面抗原的相關(guān)特性,但此類細胞的CD105表達較低,分析原因如下:①從松質(zhì)骨中遷出的細胞并非單純一個集落群;②可能與細胞培養(yǎng)狀態(tài)和細胞傳代等有關(guān)系。已有文獻表明不同的培養(yǎng)基或者傳代數(shù)的不同可以改變細胞表面抗原表達。本研究為模擬“一步式”微骨折-軟骨修復(fù)治療過程,未將細胞進行表面抗原分選后再誘導(dǎo)分化。此外,有文獻報道CD105、CD166雙陽性的滑膜來源細胞較陰性者具有更加明顯的成軟骨分化能力[22],是否也適用于松質(zhì)骨祖細胞有待后續(xù)研究的進一步驗證。

    本研究將第3代細胞進行成骨、成脂、成軟骨分化研究,通過相應(yīng)的細胞染色、組織染色及免疫組化染色分析其分化結(jié)果。茜素紅染色和堿性磷酸酶活性染色的陽性驗證晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨祖細胞具有成骨分化能力;油紅O染色陽性則證實其成脂分化能力。由于本實驗重點關(guān)注晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨祖細胞成軟骨分化能力,故對多個軟骨分化相關(guān)標記物進行免疫組化染色,結(jié)果表明作為成軟骨分化最主要的標志物Ⅱ型膠原、聚蛋白聚糖均出現(xiàn)在誘導(dǎo)后的細胞微球組織中,而成骨相關(guān)指標Ⅰ型膠原的染色較未分化組弱,提示細胞被成功向軟骨細胞分化誘導(dǎo)。進而通過RT-PCR進一步驗證Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和SOX-9基因mRNA表達水平較未誘導(dǎo)組顯著升高,SOX-9基因被認為與軟骨形成密切相關(guān),是證實細胞成軟骨分化的可靠指標,而Ⅰ型膠原的基因表達量明顯下降,該結(jié)果與免疫組化染色基本一致。由此確認未經(jīng)細胞表面抗原分選的由脛骨平臺下松質(zhì)骨遷移出的祖細胞具有良好的成軟骨分化能力。

    綜上,結(jié)合松質(zhì)骨祖細胞的貼壁生長特性、細胞形態(tài),細胞表面抗原分析,成骨、脂、軟骨分化的多分化潛能,本研究認為晚期OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)仍有具成軟骨分化能力的祖細胞,可為“一步式——微骨折處理-成軟骨誘導(dǎo)材料填充-軟骨修復(fù)”治療理念提供一定依據(jù)。

    [1]Centers for Disease Control and Prevention(CDC).Prevalence of disabilities and associated health conditions among adults--United States,1999.MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2001,50(7):120-125.

    [2]Pridie KH.A method of resurfacing osteoarthritic knee joints.JBone Joint Surg Br,1959,41:618-619.

    [3]Steadman JR,RodkeyWG,Briggs KK,etal.Themicrofracture technic in the management of complete cartilage defects in the knee joint.Orthopade,1999,28(1):26-32.

    [4]Williams RJ 3rd,HarnlyHW.Microfracture:indications,technique,and results.Instr Course Lect,2007,56:419-428.

    [5]Bae DK,Yoon KH,Song SJ.Cartilage healing afterm icrofracture in osteoarthritic knees.Arthroscopy,2006,22(4): 367-374.

    [6]Kulaw ig R,Krüger JP,K lein O,etal.Identification of fibronectin as amajor factor in human serum to recruit subchondral mesenchymal progenitor cells.IntJBiochemCellBiol, 2013,45(7):1410-1418.

    [7]Endres M,Andreas K,Kalw itz G,et al.Chemokine profile of synovial fluid from normal,osteoarthritis and rheumatoid arthritis patients:CCL25,CXCL10 and XCL1 recruit human subchondralmesenchymal progenitor cells.Osteoarthritisand Cartilage,2010,18(11):1458-1466.

    [8]Zhen G,Wen C,Jia X,etal.Inhibition of TGF-βsignaling in mesenchymal stem cells of subchondral bone attenuates osteoarthritis.NatM ed,2013,19(6):704-712.

    [9]Singh P,Schwarzbauer JE.Fibronectin and stem cell differentiation-lessons from chondrogenesis.JCell Sci,2012,125(16):3703-3712.

    [10]Majumdar MK,Wang E,Morris EA.BMP-2 and BMP-9 promoteschondrogenic differentiation of humanmultipotentialmesenchymal cells and overcomes the inhibitory effect of IL-1.JCell Physiol,2001,189(3):275-284.

    [11]Carlberg AL,PucciB,RallapalliR,etal.Efficientchondro-genic differentiation of mesenchymal cells in micromass culture by retroviral gene transfer of BMP-2.Differentiation,2001,67(4-5):128-138.

    [12]van der Kraan PM.TGF-βinduced chrondrogenicdifferentiation of bonemarrow-derived mesenchymal stem cells:role of smadsignalingpathways.//Stem Cells and Cancer Stem Cells.Springer Netherlands,2013:85-91.

    [13]Brady K,Dickinson SC,Guillot PV,etal.Human fetal and adultbonemarrow-derivedmesenchymal stem cells use different signaling pathways for the initiation of chondrogenesis.Stem CellsDev,2013,23(5):541-554.

    [14]Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American Rheumatism Association1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1988,31(3):315-324.

    [15]SolchagaLA,Kitsie JP,WelterJF.Chondrogenic differentiation of bonemarrow-derived mesenchymal stem cells:tips and tricks.MethodsMol Biol,2011,698:253-278.

    [16]Dom inici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.M inimal criteria for definingmultipotentmesenchymalstromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

    [17]Colter DC,Class R,Digirolamo CM,etal.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of p lastic-adherent cells from human bonemarrow.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(9):3213-3218.

    [18]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adultmarrow.Nature,2002,418(6893):41-49.

    [19]Owen M,F(xiàn)riedenstein AJ.Stromal stem cells:marrow-derived osteogenic precursors.Ciba Found Sym p,1988,136: 42-60.

    [20]Scharstuhl A,Schewe B,Benz K,et al.Chondrogenic potential of human adultmesenchymal stem cells is independent of age or osteoarthritis etiology.Stem Cells,2007,25(12):3244-3251.

    [21]Neumann K,Dehne T,EndresM,etal.Chondrogenic differentiation capacity of human mesenchymal progenitor cells derived from subchondral cortico-spongious bone.JOrthopRes,2008,26(11):1449-1456.

    [22]Chang CB,Han SA,K im EM,et al.Chondrogenic potentials of human synovium-derived cells sorted by specific surfacemarkers.OsteoarthritisCartilage,2013,21(1):190-199.

    Characteristicsof progenitor cells derived from subchondralcortico-spongiousbone in end-stageosteoarthritis patients

    JIANG Chao,WANGYipeng,QIU Guixing,WU Zhihong,WENG Xisheng*
    (Departmentof Orthopedics,Peking Union M edical College Hospital,CAMS&PUMC,Beijing 100037,China)

    2095-9958(2016)02-0069-06

    10.3969/j.issn.2095-9958.2016.01-14

    翁習(xí)生,E-mail:xshweng@medmail.com.cn

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