氣相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中19種氯代酚及其鈉鹽

鐘惠英， 柳 海， 柴麗月， 鄭 丹， 楊家鋒， 邱紀時， 邱潔瓊

(寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315012)

氯酚類化合物(Chlorophenols,CPs)是芳香族化合物中用途廣、污染較為嚴重的一類化合物，具有慢性毒性、致癌性、致突變性[1]。目前，世界上有近15 000種CPs被用作殺蟲劑、有機溶劑和藥物[2,3]。CPs普遍存在于煉油、煉焦、石化、塑膠、煤氣和紙漿等工業(yè)廢水和生活污水中，常以其鈉鹽形式存在，是一類化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定的化合物，能夠在環(huán)境中相對持久地存在，并可通過食物鏈累積[3]。美國環(huán)保局(US EPA)和中國國家環(huán)保部都將2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚和五氯酚列入優(yōu)先管理的毒性污染物[4,5]。

含有CPs的廢水約占中國工業(yè)廢水總量的16%，生產(chǎn)CPs的化工、石油化工企業(yè)是水環(huán)境CPs污染的主要來源[6]。由于水環(huán)境的污染必然招致生活其中的魚蝦貝等遭受污染，從而影響到人類，因而有必要對水環(huán)境和其中的生物體進行監(jiān)測。氯代酚的檢測方法以對水、土壤的報道較多[7 - 12]，生物體中氯代酚的檢測方法報道的僅見于五氯酚或五氯酚鈉鹽的測定[13 - 15]。

本方法選用H2SO4將樣品消解，通過液-液萃取凈化，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，選擇離子(SIM)方式同時測定水產(chǎn)動物肌肉中2-氯酚(2-CP)、3-氯酚(3-CP)、4-氯酚(4-CP)、2,3-二氯酚(2,3-DCP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,5-二氯酚(2,5-DCP)、2,6-二氯酚(2,6-DCP)、3,4-二氯酚(3,4-DCP)、3,5-二氯酚(3,5-DCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、2,4,5-三氯酚(2,4,5-TCP)、2,3,4-三氯酚(2,3,4-TCP)、2,3,5-三氯酚(2,3,5-TCP)、2,3,6-三氯酚(2,3,6-TCP)、3,4,5-三氯酚(3,4,5-三氯酚)、2,3,5,6-四氯酚(2,3,5,6-TeCP)、2,3,4,6-四氯酚(2,3,4,6-TeCP)、2,3,4,5-四氯酚(2,3,4,5-TeCP)和五氯酚(PCP)。上述19種氯代酚及其鈉鹽，分別用氘代4-氯-3-甲基酚(PCMC-d2)和氘代2,4,6-三溴苯酚(2,4,6-TBP-d2)為內(nèi)標(biāo)準物質(zhì)，標(biāo)準曲線內(nèi)標(biāo)法進行定量。方法準確度和精密度好，19種氯酚檢出限在0.2～0.4 μg/kg之間，加標(biāo)回收率符合污染物分析要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

Trace GC-DSQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Thermo Finnigan)；DL-8M低速冷凍離心機(上海離心機研究所)；SHA-C水浴恒溫搖床(常州國華)；HGC-24A氮吹儀(天津恒奧)；MS3旋渦混合器(德國，IKA)。

單標(biāo)準貯備溶液：100～1 000 mg/L；單標(biāo)準中間液(10.0 mg/L)：氯代酚貯備液的溶劑為甲醇時，選用1∶1正己烷-二氯甲烷溶液配制單標(biāo)準中間液，氯代酚貯備溶液為正己烷或二氯甲烷時用正己烷配成單標(biāo)準中間液；混合標(biāo)準使用液(100 μg/L)：用正己烷配制。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準物質(zhì)PCMC-d2、2,4,6-TBP-d2(純度≥98%，加拿大C/D/N Isotopes)。內(nèi)標(biāo)單標(biāo)貯備液(1.00 g/L)：分別稱取PCMC-d2、2,4,6-TBP-d210.00 mg于10 mL容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度；內(nèi)標(biāo)單標(biāo)中間溶液(10.0 mg/L)：用正己烷配制；PCMC-d2使用液(500 μg/L)：用正己烷配制；2,4,6-TBP-d2使用液(150 μg/L)：用正己烷配制。2,4,6-三氯酚鈉(純度≥95.0%)和2,3,4,6-四氯酚鈉(純度≥89.0%)，購于上海安譜實驗科技股份有限公司。二氯甲烷、正己烷(農(nóng)殘級，美國Tedia)；環(huán)己烷、乙酸乙酯(色譜純，美國Tedia)；H2SO4、NaOH(優(yōu)級純)；H3PO4、無水Na2SO4(分析純)。無水Na2SO4經(jīng)650 ℃灼燒，冷卻后置干燥器中貯存?zhèn)溆?。硅烷化衍生試劑：N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)體積比99∶1(美國Supelco公司)。

標(biāo)準系列：依次吸取100 μg/L的混合標(biāo)準使用溶液10.0、30.0、50.0、100.0、150.0、200.0、350.0 μL于7個2 mL進樣瓶內(nèi)，各加2,4,6-TBP-d2內(nèi)標(biāo)使用液100 μL、PCMC-d2內(nèi)標(biāo)使用溶液10 μL和硅烷化衍生試劑40 μL，正己烷定容至500 μL，密閉搖勻，與樣品溶液一起置40 ℃柱溫箱衍生30 min，冷卻搖勻后上機分析。標(biāo)準系列濃度依次為2.0、6.0、10.0、20.0、30.0、40.0、70.0 ng/mL。

大黃魚、草魚、南美白對蝦、縊蟶取自本地養(yǎng)殖場。大黃魚、草魚去皮取背部肌肉，南美白對蝦取去頭去殼后蝦體，縊蟶取去殼后軟體部，樣品分別用搗碎機絞碎后，裝于聚乙烯塑料袋，-18 ℃冷凍保存，備用。

1.2 樣品處理

稱絞碎均質(zhì)后樣品5.00 g于100 mL聚乙烯塑料離心管中，加入2,4,6-TBP-d2使用溶液100 μL，50%H2SO4溶液30 mL，40 ℃水浴恒溫搖床消解6 h以上或過夜。冷卻后分兩次加入4∶1環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液10 mL，每次振搖1 min，4 000 r/min離心后，上清液(提取液)轉(zhuǎn)移到50 mL聚乙烯塑料離心管中。向提取液中加入4% NaOH溶液5 mL，振搖1 min，4 000 r/min離心。棄去二相間膜狀物，上層有機相轉(zhuǎn)移到另一50 mL聚乙烯塑料離心管中，并用5 mL 4% NaOH溶液重復(fù)提取1次。棄去上層有機相，合并下層稀堿提取液。向稀堿提取液中加入5 mL正己烷，振搖2 min，4 000 r/min離心后除去二相間膜狀物和上層正己烷，用6 mol/L H3PO4溶液調(diào)pH至6.2。分兩次加入正己烷-二氯甲烷(1∶1)溶液10 mL，每次振搖1 min，4 000 r/min離心后，上清液過無水Na2SO4柱后轉(zhuǎn)移到10 mL刻度離心管中。置氮吹儀上60 ℃氮吹至0.8～1.0 mL，轉(zhuǎn)移到2 mL進樣瓶中，60 ℃氮吹至約400 μL。加入10 μL PCMC-d2使用溶液和40 μL硅烷化衍生試劑，定容到500 μL，密閉搖勻，置40 ℃柱溫箱衍生30 min，冷卻后搖勻，上機分析。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為DB-5MS石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；柱箱升溫程序：初始溫度80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至160 ℃，再以3 ℃/min，升至200 ℃，然后以40 ℃/min升至300 ℃，保持3 min；載氣：氦氣(純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min，恒流模式；進樣口：PTV進樣口，恒溫不分流模式，溫度260 ℃；進樣方式：不分流進樣，0.75 min后開閥；進樣量：2.0 μL。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；電離方式：EI；電子能量：70 eV；溶劑延遲：10.5 min；數(shù)據(jù)采集結(jié)束時間：26.0 min；測定方式：選擇離子(SIM)監(jiān)測方式，選擇離子序列見表1。

按上述儀器條件對定容至500 μL的標(biāo)準工作系列和待測試樣溶液上機分析，以標(biāo)準溶液作參照，根據(jù)保留時間和特征離子的豐度進行定性。按照表2中規(guī)定的定量離子(MCP和DCP以PCMC-d2為內(nèi)標(biāo)，其它氯代酚以2,4,6-TBP-d2為內(nèi)標(biāo))，以標(biāo)準溶液中被測組分峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準溶液中被測組分濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，用標(biāo)準曲線對試樣進行內(nèi)標(biāo)法定量。

表1 SIM模式下的選擇離子序列

表2 硅烷化衍生后的19種氯代酚和內(nèi)標(biāo)物的定性、定量離子

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準溶液的總離子流色譜圖

圖1給出了19種CPs標(biāo)準溶液在SIM檢測模式下的總離子流色譜圖。從圖中可見，CPs所有成分的峰形較好，除2,5-DCP和3,5-DCP色譜峰保留時間完全相同，其它組分分離度都很好。所以應(yīng)用本法進行測定時，2,5-DCP和3,5-DCP只能測定二者的總量。

圖1 19種氯代苯酚標(biāo)準溶液的總離子流色譜圖(10.0 ng/mL)Fig.1 The total ions chromatograms of 19 chlorophenol standard solution(10.0 ng/mL)1.2-CP;2.3-CP;3.4-CP;4.PCMC-d2;5.2,5-DCP+3,5-DCP(10.00 ng/mL);6.2,6-DCP;7.2,4-DCP;8.2,3-DCP;9.3,4-DCP;10.2,4,6-TCP;11.2,3,5-TCP;12.2,4,5-TCP;13.2,3,6-TCP;14.3,4,5-TCP;15.2,3,4-TCP;16.2,3,5,6-TeCP;17.2,3,4,6-TeCP;18.2,3,4,5-TeCP;19.2,4,6-TBP-d2;20.PCP.

2.2 線性范圍與檢出限

在實驗選定的儀器條件下，氯代酚含量在2.0～70.0 μg/L范圍內(nèi)，所有氯代酚的濃度(x)與該化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(y)均呈良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均可達到0.999以上。19種氯代酚的線性方程及相關(guān)系數(shù)列于表3。

表3 19種氯代酚濃度與峰面積的線性方程及相關(guān)系數(shù)

(續(xù)表3)

CompoundLinear equation and correlation coefficientCompoundLinear equation and correlation coefficient4-CPy=0.4877x-0.1984,0.99972,3,6-TCPy=0.3194x+0.07013,0.99962,5-DCP+3,5-DCPy=0.1684x-0.05636,0.99933,4,5-TCPy=0.2137x+0.09424,0.99942,6-DCPy=0.1404x-0.02951,0.99972,3,4-TCPy=0.1021x+0.056256,0.99982,4-DCPy=0.1007x-0.03654,0.99962,3,5,6-TeCPy=0.1018x+0.08870,0.99972,3-DCPy=0.09444x-0.01910,0.99932,3,4,6-TeCPy=0.1028x+0.06899,0.99943,4-DCPy=0.1917x-0.08189,0.99942,3,4,5-TeCPy=0.08627x+0.08963,0.99932,4,6-TCPy=0.1832x+0.03801,0.9995PCPy=0.05650x+0.1180,0.9993

實驗檢測的19種氯代酚，以PCP的響應(yīng)值最低，而3-CP/4-CP響應(yīng)值最高。當(dāng)氯代酚的測試量均為0.004 ng 時，PCP的信噪比(S/N) 為4，3-CP的S/N為45。當(dāng)樣品中氯代酚添加量為0.40 μg/kg時PCP的S/N值為5，而當(dāng)氯代酚添加量為0.20 μg/kg時3-CP 的S/N為18。所以應(yīng)用本方法測定19種氯代苯酚，方法檢出限至少可達0.2～0.4 μg/kg。

2.3 回收率和精密度

以南美白對蝦、草魚、大黃魚和縊蟶為實驗材料，標(biāo)準溶液添加濃度為1.00 μg/kg、2.00 μg/kg、3.00 μg/kg和7.00 μg/kg，測試回收率和精密度(RSD)，結(jié)果列于表4。符合污染物檢測分析要求。

表4 水產(chǎn)品中19種氯代酚的回收率和精密度

2.4 樣品處理

2.4.1溶劑的選擇和操作提取氯代酚的溶劑報道有二氯甲烷[8,9]、正己烷[9 - 13]、環(huán)己烷-乙酸乙脂[14]等。由于正己烷在本方法實驗過程中，有的樣品在提取時上層有機層出現(xiàn)了凝膠狀凍結(jié)現(xiàn)象。二氯甲烷作為提取溶劑效果很好，但氯烷類試劑比重大、容易從提取容器口滲漏或移液時不易操作，且二氯甲烷滲透性強，當(dāng)不慎灑到操作者肌膚時會有灼痛感，對人體有傷害。本實驗選用了4∶1環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液，取得了滿意的結(jié)果。比較了正己烷和正己烷-二氯甲烷溶液(1∶1，V/V)從微酸性水溶液中對氯代酚的提取效率，后者好于前者。

2.4.2酸解和酸解溫度酸解能使水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)、脂肪和色素等有機物質(zhì)分解，并且在酸性溶液中其酚鹽以氯代酚形式存在，且由于氯代酚結(jié)構(gòu)中含有羥基，樣品酸解后能提高酚類化合物的回收率[9]。但由于氯代酚類化合物具有揮發(fā)性，會隨水蒸汽一起揮發(fā)，所以酸消解時的溫度不宜太高，本實驗選擇了40 ℃，在此溫度下一般2～3 h左右能將肌肉組織水解，但有的水產(chǎn)樣品酸解不徹底，當(dāng)用有機溶劑提取時，二相間會出現(xiàn)乳化層，而影響提取效果，因此，酸解時間以6 h以上或過夜為好。

2.4.3實驗溫度提取的有機溶劑易揮發(fā)，過高的實驗室溫度會使實驗操作時提取溶劑快速揮發(fā)，從而導(dǎo)致氯代酚一起損失而影響回收率，所以實驗室溫度不應(yīng)高于25 ℃。試樣60 ℃氮吹儀濃縮時，一定要緩緩地充上氮氣，否則會降低回收率。

2.4.4衍生劑和衍生溫度氯代酚分子中含有羥基，極性較大，如果不經(jīng)過衍生化，很容易出現(xiàn)拖尾峰，并且峰形很寬，影響檢測靈敏度和重現(xiàn)性。氯代酚的衍生方法有乙酰化法和硅烷化法，本實驗選用了硅烷化法。試樣中的少量水就會使硅烷化失敗，因而硅烷化前試樣必須脫水完全。關(guān)于衍生劑的用量，比較了40、60、80、100 μL等不同的衍生劑加入量，其效果差異不大，所以本實驗選用了40 μL。衍生時溫度過高會使試樣的溶劑揮發(fā)導(dǎo)致氯酚損失，本實驗選用了40 ℃，在此溫度下衍生，既不會造成溶劑和目標(biāo)物的揮發(fā)，又有較好的衍生效率。

2.5 酚鹽回收率實驗

用2,4,6-三氯酚鈉和2,3,4,6-四氯酚鈉進行了回收率實驗。用水逐級將二種酚鹽稀釋，分別配制成100 ng/mL(以酚計)的使用溶液。以大黃魚為基質(zhì)，二種酚鹽的添加量均為2.00 μg/kg，進行了3平行樣實驗，測定結(jié)果二種鈉鹽的回收率為77.0%～97.8%。

2.6 樣品測定

以2014年7月從寧波余姚臨山海水中捕獲的1份鱸魚為代表按本方法測定。4-CP 0.27 μg/kg、2,5-DCP+3,5-DCP 0.65 μg/kg、2,4-DCP 0.37 μg/kg、2,4,6-TCP 0.78 μg/kg、2,3,4-TCP 0.36 μg/kg、2,3,4,6-TeCP 3.79 μg/kg、PCP1.19 μg/kg，其它氯代酚未檢出，測得的氯代酚總量為7.41 μg/kg。

3 結(jié)論

應(yīng)用本研究建立的方法測定19種氯代酚，方法的準確性和精密度符合污染物分析要求，可作為石油、化工企業(yè)排放的氯代酚及其鈉鹽對水生動物污染的監(jiān)控方法。