直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定飼料中沙丁胺醇

孫孔飛，曾俊源，劉曙照

(揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127)

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)化學(xué)名稱為1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，它是人工合成的水楊醇類選擇性β2腎上腺素受體激動(dòng)劑[1]，臨床上用于擴(kuò)張氣管，治療哮喘。沙丁胺醇在劑量高時(shí)可促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)化、提高瘦肉率，但易積聚于動(dòng)物體的內(nèi)臟、血液和肌肉等組織中。食用含過量沙丁胺醇的動(dòng)物源食品，會(huì)引發(fā)人體多種不良反應(yīng)，危及人的健康安全[2]，因此中國(guó)已明令禁止該類化合物用于食品動(dòng)物生產(chǎn)。

目前，沙丁胺醇的殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3 - 5]、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)[6 - 8]、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)[9 - 11]、電化學(xué)分析法[12]和免疫分析法。免疫分析法包括酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)[13,14]、放射免疫分析[15]、金標(biāo)免疫層析[16]、熒光偏振免疫分析[17]和化學(xué)發(fā)光免疫分析[18]等。HPLC、GC/MS和LC/MS法對(duì)操作技術(shù)和儀器設(shè)備的要求較高，樣品前處理步驟繁瑣費(fèi)時(shí)，難以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[19]。ELISA法簡(jiǎn)便高效、易普及，可用于大量樣品的快速篩查。ELISA法包括間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法[13]和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法[14]。直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法比間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法操作時(shí)間減少約一半，在實(shí)際運(yùn)用中具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前沙丁胺醇半抗原的合成多采用酸酐與沙丁胺醇的醇羥基或酚羥基反應(yīng)形成酯鍵衍生出含羧基末端的連接臂[13,14]，因此連接臂難以定位，半抗原可能存在不同異構(gòu)體；半抗原中的酯鍵不夠穩(wěn)定[20]，特別是在免疫動(dòng)物制備抗體的過程中，易被動(dòng)物體內(nèi)的酯酶降解，難以得到單一高效的抗沙丁胺醇抗體。

本實(shí)驗(yàn)室采用在沙丁胺醇的酚羥基上通過醚鍵衍生間隔臂，得到的半抗原(圖1)結(jié)構(gòu)單一，穩(wěn)定性好；采用活性酯法將牛血清白蛋白(BSA)和辣根過氧化物酶(HRP)分別與沙丁胺醇半抗原共價(jià)偶聯(lián)合成免疫原和酶標(biāo)半抗原[21]。本研究利用所述免疫原免疫新西蘭大白兔獲得的對(duì)沙丁胺醇有高親和力的多克隆抗體和酶標(biāo)半抗原，建立包被抗體直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，用于測(cè)定飼料中的沙丁胺醇，同時(shí)采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)對(duì)沙丁胺醇進(jìn)行同步分析驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Model 680酶標(biāo)儀(美國(guó),BIO-RAD公司)；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；移液器：5～50、20～200和100～1 000 μL單道手動(dòng)可調(diào)，50～300 μL 8道可調(diào)移液器(Dragon Lab)；8孔酶標(biāo)條(江蘇海門愛苯德實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；Biofuge primo R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó),Heraeus公司)；高效液相色譜儀(美國(guó),Waters公司)。

沙丁胺醇標(biāo)樣(鹽城制藥廠)；抗沙丁胺醇抗體(本實(shí)驗(yàn)室制備，當(dāng)抗原濃度為0.15 μg/mL時(shí)，抗體的ELISA中點(diǎn)效價(jià)為0.3 μg/mL)、HRP標(biāo)記沙丁胺醇半抗原(本實(shí)驗(yàn)制備)；包被液：0.02 mol/L、pH=7.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)；反應(yīng)液：0.02 mol/L、pH=6.8、含0.05 mol/L NaCl的PBS；洗滌液：滅菌蒸餾水；封閉液(本實(shí)驗(yàn)室自制)；顯色液：0.2 mmol過氧化脲溶于1 L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(8.4 g Na2HPO4、5.2 g檸檬酸溶解于無菌蒸餾水中并且定容至1 L作A液，0.1 g TMB溶于10 mL DMF作B液，用前按VA∶VB=100∶1混勻；終止液：2 mol/L H2SO4；乙腈、甲醇為色譜純；乙酸溶液：10 mL冰乙酸用無菌蒸餾水稀釋至500 mL；淋洗液：移取9 mL濃HCl于1 000 mL滅菌蒸餾水中搖勻；洗脫液：10 mL 25%氨水用甲醇定容至100 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法條件優(yōu)化用0.02 mol/L pH=6.8的PBS將抗沙丁胺醇多克隆抗體分別稀釋至3.0、4.0、5.0和6.0 mg/L包被酶標(biāo)板不同列，酶標(biāo)半抗原分別稀釋2 500、5 000、7 500、10 000倍后加入酶標(biāo)板不同行，直接ELISA法測(cè)定。篩選的標(biāo)準(zhǔn)為抗體和酶標(biāo)半抗原用量少、酶促顯色反應(yīng)后OD450≈1.0的組合作為進(jìn)一步建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的包被抗體-酶標(biāo)半抗原工作濃度。

在上述選定的工作濃度下，分別用0.02 mol/L pH值為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0的PBS作為抗體的包被介質(zhì)，用pH=6.8的PBS作為反應(yīng)介質(zhì)稀釋酶標(biāo)半抗原，直接ELISA法測(cè)定，根據(jù)最終酶促顯色反應(yīng)后OD450值最大確定抗體包被介質(zhì)的最適pH。

在抗體包被介質(zhì)最適pH和上述選定的工作濃度下，分別用0.02 mol/L pH為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0的PBS作為反應(yīng)介質(zhì)稀釋酶標(biāo)半抗原，直接ELISA法測(cè)定，根據(jù)酶促顯色反應(yīng)后OD450最大值確定反應(yīng)介質(zhì)最適pH。

在包被介質(zhì)最適pH和反應(yīng)介質(zhì)最適pH及選定工作濃度下，分別用含NaCl濃度為0、0.05、0.15、0.25、0.50、1.0 mol/L 的PBS稀釋酶標(biāo)半抗原，直接ELISA法測(cè)定，選擇酶促反應(yīng)后OD450達(dá)最大值時(shí)的PBS作為直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA最適反應(yīng)介質(zhì)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選包被抗體濃度和酶標(biāo)半抗原稀釋度，作為抗體-酶標(biāo)半抗原最適工作濃度組合。

1.2.2直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的建立將沙丁胺醇標(biāo)樣5.0 mg溶于5 mL甲醇作為儲(chǔ)備液，用最適反應(yīng)介質(zhì)將標(biāo)樣梯度稀釋成濃度為1.0、0.1、0.01、0.001和0.0001 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最適宜ELISA條件下，測(cè)定不同質(zhì)量濃度沙丁胺醇對(duì)抗體-酶標(biāo)半抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制率I[19,21,22]，其計(jì)算公式為:I%=[(OD對(duì)照-OD沙丁胺醇)/(OD對(duì)照-OD空白] ×100%，繪制抑制率I對(duì)沙丁胺醇濃度對(duì)數(shù)(lgc)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程，確定沙丁胺醇對(duì)抗體-酶標(biāo)半抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制中濃度(Ic50)和Ic10，以Ic10為最低定量檢測(cè)濃度。

1.2.3樣品的提取與凈化提?。簩⒇i飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取2.0±0.001 g樣品于50 mL具塞離心管中，加入16 mL水和2 mL 1 mol/L HCl，振蕩混勻。超聲5 min，1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，加水定容至20 mL，混勻，6 000 r/min室溫離心5 min，取上清液直接用于ELISA法測(cè)定。凈化：將混合型陽離子交換小柱固定，依次用5 mL甲醇和5 mL無菌水活化、平衡。移取5 mL上清液于20 mL尖底蒸餾瓶中，55 ℃水浴條件下減壓蒸餾濃縮至近干，加入5 mL 2%冰乙酸溶液，渦旋振蕩至全部溶解后，加入小柱，控制流速不超過1 mL/min，先用5 mL淋洗液淋洗，再用5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL洗脫液洗脫，洗脫液于55 ℃水浴條件下減壓濃縮至近干，色譜流動(dòng)相溶解定容至250 μL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測(cè)定。

1.2.4HPLC條件色譜柱為C18色譜柱；流動(dòng)相為甲酸銨溶液∶乙腈=8∶2(V/V)；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)加入回收試驗(yàn)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA工作曲線的建立：用未經(jīng)凈化處理的空白樣品提取液將沙丁胺醇標(biāo)樣稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、0.2、0.04、0.008、0.0016和0.00032 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按1.2.2步驟建立ELISA工作曲線。在豬飼料中分別按10、50和250 μg/kg 添加沙丁胺醇，混勻后按1.2.3方法提取，提取離心后的上清液不經(jīng)凈化，直接采用ELISA法檢測(cè)各樣品提取液對(duì)抗體-酶標(biāo)半抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制率，根據(jù)工作曲線計(jì)算添加回收率。將添加250 μg/kg的樣品提取液經(jīng)混合型陽離子交換柱凈化，用于HPLC法測(cè)定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法條件的優(yōu)化

2.1.1包被抗體-酶標(biāo)半抗原最適濃度通過兩次方陣實(shí)驗(yàn)法篩選，結(jié)果見圖2。當(dāng)包被抗體濃度為4.0 mg/L、酶標(biāo)半抗原稀釋5 000倍時(shí)，二者用量少并且最終酶促顯色反應(yīng)的OD450≈1.0，確定為直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的包被抗體和酶標(biāo)半抗原最適工作濃度。

2.1.2包被介質(zhì)pH的選擇用0.02 mol/L不同pH的PBS將抗體稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板，酶標(biāo)半抗原亦稀釋至工作濃度，直接ELISA法測(cè)定的OD450見圖3。當(dāng)包被介質(zhì)的pH為7.6時(shí)，OD450最大，說明此條件下最適合抗體包被，因此選擇0.02 mol/L pH=7.6的PBS為抗體的包被介質(zhì)。

2.1.3反應(yīng)介質(zhì)pH的選擇用0.02 mol/L pH=7.6的PBS將抗體稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板，用不同pH的0.02 mol/L PBS將酶標(biāo)半抗原稀釋至工作濃度，直接ELISA法檢測(cè)，最終酶促顯色反應(yīng)OD450見圖4。當(dāng)pH為6.8時(shí)，OD450最大，表明抗體-酶標(biāo)半抗原反應(yīng)活性最強(qiáng)，故選擇pH=6.8。

2.1.4反應(yīng)介質(zhì)鹽濃度的選擇用0.02 mol/L pH=7.6的PBS將抗體稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板，用鹽濃度為0、0.05、0.15、0.25、0.5和1 mol/L的0.02 mol/L pH=6.8的PBS將酶標(biāo)半抗原稀釋至工作濃度，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)，最終酶促顯色反應(yīng)OD450見圖5。當(dāng)鹽濃度為0.05 mol/L時(shí)，抗體與酶標(biāo)半抗原反應(yīng)活性最高，故選擇pH=6.8、鹽濃度為0.05 mol/L的PBS作為直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的最適反應(yīng)介質(zhì)。

2.2 沙丁胺醇直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸分析

以沙丁胺醇濃度對(duì)數(shù)(lgc)為橫坐標(biāo)，沙丁胺醇對(duì)抗體-酶標(biāo)半抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制率(I)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖6。沙丁胺醇在0.1～1.0×103μg/L濃度范圍內(nèi)與抑制率呈線性相關(guān)，其回歸方程為:I=23.86lgc+94.20(r=0.9865)，沙丁胺醇對(duì)抗體-酶標(biāo)半抗原反應(yīng)的抑制中濃度Ic50=14 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為8.6%，Ic10=0.29 μg/L。

2.3 豬飼料中沙丁胺醇的測(cè)定

2.3.1沙丁胺醇測(cè)定的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA工作曲線及回歸分析用空白樣品提取液作溶劑配制沙丁胺醇系列工作溶液，在 0.32～1.0×103μg/L濃度范圍內(nèi)，沙丁胺醇濃度對(duì)數(shù)(lgc)與沙丁胺醇對(duì)抗體-酶標(biāo)半抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制率(I)線性相關(guān)。經(jīng)回歸分析得回歸方程:I=25.629lgc+96.446(r=0.9901)，Ic50=15.4 μg/kg，5次重復(fù)測(cè)定的RSD為8.8%，Ic10=0.423 μg/kg。

2.3.2ELISA法測(cè)定沙丁胺醇?xì)埩舻幕厥章试?0、50和250 μg/kg添加水平下，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定的回收率分別為85%～108%、81%～92%、81%～102%，RSD(n=5)分別為9.1%、5.6%、8.9%。結(jié)果見表1。

表1 豬飼料中沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)添加回收率

2.4 豬飼料中沙丁胺醇?xì)埩舻腍PLC測(cè)定結(jié)果

按1.2.3進(jìn)行樣品的提取與凈化，按1.2.4 HPLC條件檢測(cè)，結(jié)果表明。在250 μg/kg的添加水平下，HPLC-UV法測(cè)定的平均回收率為89%(n=3)，與直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定結(jié)果接近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用對(duì)沙丁胺醇具有高識(shí)別能力的多克隆抗體，建立了一種用于快速檢測(cè)沙丁胺醇的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。ELISA法的樣品前處理簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，檢測(cè)費(fèi)用低，可用于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。與現(xiàn)有間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法相比，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法省去了與二抗反應(yīng)的步驟，方法更加簡(jiǎn)便快捷。而與ELISA法相比，HPLC法對(duì)樣品前處理的要求高，需采用層析凈化步驟，花費(fèi)時(shí)間較多。