分子光譜法研究槲皮苷與DNA的相互作用

喬春玉，張重越，孫艷濤，閆　鵬，肖　雪，朱傳勇

(1.黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150050；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，哈爾濱 150040；3.吉林師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

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分子光譜法研究槲皮苷與DNA的相互作用

喬春玉1，張重越2，孫艷濤3，閆鵬1，肖雪1，朱傳勇1

(1.黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150050；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，哈爾濱 150040；3.吉林師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

以溴化乙錠(EB)做為DNA的熒光探針，研究了黃酮類化合物——槲皮苷與DNA的相互作用。實驗結(jié)果表明，離子強度對槲皮苷與DNA的結(jié)合常數(shù)有一定的影響。在15 ℃、25 ℃、35 ℃和45 ℃時的Stern-Volmer曲線說明了槲皮苷對DNA熒光猝滅的過程。通過計算得到了在不同溫度時二者的結(jié)合常數(shù)，以及相對應(yīng)的熱力學(xué)常數(shù)ΔH、ΔG和ΔS。

槲皮苷；DNA；熒光猝滅；結(jié)合常數(shù)

DNA(脫氧核糖核酸)，是生物體主要的遺傳物質(zhì)。許多小分子能與DNA發(fā)生相互作用，從而傳遞遺傳信息，控制生物體的形態(tài)和生理特性，進而影響DNA的復(fù)制。因此研究小分子藥物與DNA的結(jié)合機理，了解其作用方式，對于DNA靶向藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計具有一定的科學(xué)意義[1]。黃酮類化合物(flavonoids)在自然界分布較廣泛，其分子中具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)，其羥基衍生物多呈現(xiàn)黃色，故又稱黃堿素或黃酮。大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用[2]，其中槲皮苷(quercitrin，分子結(jié)構(gòu)式見圖1(a))具有較好的祛痰、止咳、平喘、抗菌活性和一定的平喘作用，以及抗腫瘤作用和抗血小板聚集作用。利用溴化乙錠(EB，圖1(b))做探針，通過光譜法對槲皮苷與DNA的結(jié)合機制進行了研究。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

鮭魚精DNA(美國Sigma化學(xué)公司)；溴化乙錠(長春寶泰克公司， 5.00 mL/mg)；槲皮苷(中國藥品與生物制品質(zhì)量檢定所)。本實驗用NaCl溶液調(diào)節(jié)溶液的離子強度。

DNA儲備液(4.50×10-4mol/L)；EB儲備液(7.34×10-5mol/L)；槲皮苷(1.00×10-3mol/L的乙醇儲備液)。用pH 7.4的Britton-Robinson 緩沖溶液來控制反應(yīng)體系的pH值。

熒光光度計(日本島津公司，RF-5301 PC)；數(shù)字酸度計(杭州東興儀器廠，pHS-3C)。

1.2實驗方法

1.2.1DNA與EB的結(jié)合

在pH值為7.4的BR緩沖溶液中，對一定量的DNA溶液在有無EB情況下掃描熒光光譜。掃描波長為530～700 nm。

1.2.2熒光性質(zhì)的研究

向一定濃度的EB溶液中依次加入不同量的DNA溶液，并記錄熒光強度值。進而確定DNA與EB在溶液中的最佳比值。

按照DNA與EB的最佳濃度比，在含有一定量DNA-EB溶液的試管中，加入一系列含有不同濃度的槲皮苷溶液，并用緩沖溶液稀釋至5.0 mL，混合均勻并恒溫后，分別測定在15 ℃，25 ℃，35 ℃和45 ℃時的熒光光譜。

1.2.3離子強度的影響

首先保持NaCl的濃度不變，對一系列含有不同濃度的槲皮苷和恒定濃度的DNA-EB的溶液進行熒光測定；然后改變NaCl在溶液中的濃度，其他條件不變，再進行測定。

2　結(jié)果與討論

2.1EB與DNA的結(jié)合性質(zhì)

研究證實，許多小分子都是DNA靈敏的探針[3-5]，溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，具有高選擇性。EB含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團，它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。EB是研究DNA性質(zhì)時比較常用的探針分子，許多文獻也曾報道過EB與DNA的結(jié)合性質(zhì)[6-7]。

EB與DNA反應(yīng)的熒光光譜圖見圖2。由于DNA的內(nèi)源熒光很弱，這就導(dǎo)致直接利用DNA的熒光性質(zhì)進行研究受到限制(圖2(a))[8]。在所選擇的濃度下，曲線EB的熒光強度也很弱(圖2(b))，而將EB加入到DNA溶液中，體系的熒光強度得到顯著增強(圖2(c))。

2.2槲皮苷與DNA的結(jié)合

2.2.1熒光性質(zhì)的研究

實驗首先探討了EB與DNA的濃度比，固定混合溶液中EB的濃度，改變DNA濃度進行熒光測定。結(jié)果見圖3。由圖3可見，熒光強度隨著DNA濃度的增加而逐漸增強。當DNA的濃度高于40.00 μmol/L時，體系的熒光強度趨于平緩，這表明此時EB與DNA的結(jié)合趨于飽和狀態(tài)。根據(jù)此結(jié)果并結(jié)合本實驗所需，對于2.95 μmol/L的EB，選擇DNA的濃度27.00 μmol/L。

圖2　DNA(a)，EB(b)和DNA-EB(c)的熒光譜圖Fig.2　Fluorescence spectrum of DNA (a), EB(b) and DNA-EB(c)

圖3　DNA濃度與EB的熒光光譜Fig.3　Fluorescence intensity of EB with increasing concentration of DNA

在上述實驗條件下，分別測定DNA-EB體系在加入不同量槲皮苷前后的熒光譜圖，結(jié)果見圖4。

圖4　槲皮苷存在時DNA-EB的熒光光譜Fig.4　Fluorescence spectra of DNA-EB in presence of quercitrin

由圖4可見，槲皮苷加入后DNA-EB體系的熒光峰的位置幾乎不變，而熒光強度則有規(guī)律地降低。誘導(dǎo)熒光猝滅的過程通常分為通過碰撞和熒光團與猝滅劑形成復(fù)合物，也就是通常所說的動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[9]。一般情況下，可以根據(jù)猝滅常數(shù)隨溫度的變化來區(qū)別動態(tài)與靜態(tài)猝滅。其中動態(tài)猝滅是由于熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間通過碰撞而產(chǎn)生相互作用的過程，此情況下隨溫度的升高，粒子間有效碰撞的數(shù)目將增加，從而加劇了電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物的猝滅常數(shù)會增大。但靜態(tài)猝滅升高溫度時，復(fù)合物的穩(wěn)定性將會降低，猝滅常數(shù)也會減小。因此可利用改變溫度的方法來判斷猝滅的機理。因此，為了判斷反應(yīng)的猝滅機制，先假設(shè)槲皮苷對DNA-EB體系的猝滅過程是動態(tài)猝滅，其作用過程遵循Stern-Volmer方程[10-11]：

(1)

式中Kq為熒光猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散速率常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)[12]；[Q]為猝滅劑的濃度；F0和F分別為猝滅劑不存在和存在時體系的熒光強度；τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s[13]；KD為動態(tài)猝滅常數(shù)，即Stern-Volmer猝滅常數(shù)，L/mol。

為了避免槲皮苷在激發(fā)波長與發(fā)射波長處產(chǎn)生吸收帶來的影響，測試得到的所有熒光數(shù)據(jù)均按下式進行校正[14]：

(2)

式中F為實驗測得的熒光強度值；FE為校正后的熒光強度值；A和A′分別為在激發(fā)波長與發(fā)射波長處槲皮苷的吸光度。不同溫度下槲皮苷猝滅DNA-EB體系熒光的Stern-Volmer曲線見圖5。

由圖5可見，溫度升高，猝滅常數(shù)K值反而降低了，表明槲皮苷與DNA-EB二者之間的猝滅不是動態(tài)猝滅。此外通過計算還得到，25 ℃時槲皮苷的擴散速率常數(shù)Kq是3.23×1012L/(mol·s)，遠大于擴散控制的最大碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)，綜上所述，槲皮苷對DNA-EB體系的熒光猝滅是源于兩者之間形成了復(fù)合物，即靜態(tài)猝滅過程。

利用靜態(tài)猝滅公式[15]：

(3)

式中KP為熒光體與猝滅劑的解離常數(shù)，與結(jié)合常數(shù)KB互為倒數(shù)，即KB= 1/KP。利用靜態(tài)猝滅公式得到不同溫度時的雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖，斜率KPF0-1與截距F0-1之比為KP，進而得到結(jié)合常數(shù)KB。不同溫度下槲皮苷與DNA-EB體系以1/(F0-F)對[Q]-1做的一元擬合見圖6。得到的相應(yīng)結(jié)合常數(shù)KB見表1。

圖5　在不同溫度時槲皮苷-DNA-EB的Stern-Volme曲線Fig.5　Stern-Volmer curves of quercitrin-DNA-EB, respectively

圖6　不同溫度時槲皮苷的1 / (F0 - F) 對[Q]-1曲線Fig.6　Plots of 1/(F0-F) versus [Q]-1 for quercitrin at various temperatures

Drug15℃KB/(L·mol-1)r25℃KB/(L·mol-1)r35℃KB/(L·mol-1)r45℃KB/(L·mol-1)rquercitrin2.25×1040.99935.96×1040.99966.85×1040.99961.12×1050.9998

由表1可見，槲皮苷與DNA-EB的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增加，這說明他們與DNA的結(jié)合都是吸熱的反應(yīng)。

2.2.2熱力學(xué)參數(shù)的測定

小分子與DNA間的作用屬于分子間的弱相互作用，包括靜電作用、氫鍵、范德華力和疏水作用等幾種?？筛鶕?jù)不同溫度時結(jié)合體系的熱力學(xué)參數(shù)，確定其主要作用力。當ΔH≤0，ΔS>0時，主要為靜電引力；ΔH>0，ΔS>0時，主要是疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0時，主要為范德華力或者氫鍵作用力[16]。實驗測定了不同槲皮苷與DNA-EB體系的結(jié)合常數(shù)。式(5)和式(6)反映了焓變、自由能變和熵變的關(guān)系：

(5)

(6)

計算得到25 ℃時槲皮苷與DNA-EB反應(yīng)的ΔH、ΔG、ΔS見表2。

表2　槲皮苷與DNA-EB結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)(25 ℃)

由表2可見，槲皮苷與DNA-EB體系的焓變大于零，說明該結(jié)合反應(yīng)是吸熱反應(yīng)。這與前面的結(jié)論是一致。此外，槲皮苷與DNA結(jié)合體系的焓變和熵變均大于零，說明槲皮苷與DNA-EB之間的主要作用力是疏水作用。

2.2.3與變性DNA結(jié)合的研究

本實驗還研究了槲皮苷與變性DNA(即單螺旋DNA)的結(jié)合作用。DNA的雙螺旋之間是以氫鍵連接的，DNA變性是指DNA雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使DNA的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等作用下，均可引起DNA分子的變性。本實驗是采用加熱的方法得到變性的DNA，然后在與前面相同實驗條件下，分別測槲皮苷與單螺旋DNA的結(jié)合常數(shù)，比較結(jié)果見表3。

由表3可見，槲皮苷與單螺旋DNA的結(jié)合常數(shù)小于與雙螺旋的結(jié)合常數(shù)。說明槲皮苷與DNA的結(jié)合程度與DNA的結(jié)構(gòu)有關(guān)，DNA經(jīng)過變性處理后，雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，雙鏈打開變成沒有規(guī)律的單鏈。嵌入式結(jié)合的槲皮苷無法再與DNA結(jié)合在一起，從而表現(xiàn)為結(jié)合常數(shù)KB減小了。

表3　25 ℃時槲皮苷與DNA-EB的結(jié)合常數(shù)

2.2.4離子強度的影響

實驗還利用NaCl來調(diào)節(jié)體系中的離子強度，測定了離子強度對槲皮苷與DNA-EB結(jié)合體系的熒光影響，結(jié)果見表4。

表4　NaCl濃度對槲皮苷與和DNA結(jié)合常數(shù)的影響(25 ℃)

由表4可見，隨著NaCl濃度的增加，槲皮苷與DNA的結(jié)合能力逐漸減弱。由于NaCl不是DNA的陰離子猝滅劑，它對DNA的影響來自于離子強度[17]。由此判斷影響槲皮苷與DNA結(jié)合能力的主要是體系中的離子強度。由于DNA骨架是帶負電的，帶正電荷的鈉離子會被DNA分子中的磷酸根所吸引，從而減小了DNA磷酸骨架的靜電斥力，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)就會變得更加緊湊。這樣導(dǎo)致槲皮苷較難再插入到DNA堿基對之間，對DNA-EB體系的熒光猝滅作用也減小。這也說明了槲皮苷與DNA-EB體系的結(jié)合方式是嵌入式結(jié)合。

3　結(jié)　論

選擇溴化乙錠作為DNA的熒光探針，研究了槲皮苷對DNA的熒光猝滅過程的性質(zhì)，計算得到二者的結(jié)合常數(shù)。文章通過探討槲皮苷與DNA的結(jié)合機制，并且通過單螺旋DNA和離子強度的影響等實驗的研究，推測槲皮苷與DNA的主要結(jié)合方式是嵌入式結(jié)合。

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Interactions of quercitrin with DNA by molecular spectrometry

QIAO Chun-Yu1, ZHANG Chong-Yue2, SUN Yan-Tao3, YAN Peng1, XIAO Xue1, ZHU Chun-Yong1

(1.DepartmentofMaterialandChemicalEngineering,HeilongjiangInstituteofTechnology,Harbin150050,China; 2.DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 3.CollegeofChemistry,JilinNormalUniversity,Siping136000,Jilin,China)

Binding of flavonoids, using quercitrin to fish sperm deoxyribonucleic acid (DNA) was studied by using Ethidium Bromide (EB) as a fluorescence probe. The experimental results indicated that the ionic strength had effect on the binding of quercitrin and DNA. Stern-Volmer plots at 15 ℃, 25 ℃, 35 ℃ and 45 ℃ showed that the quenching of fluorescence by quercitrin was a combined quenching process. The apparent binding constantKAat different temperatures and the corresponding thermodynamic parameters ΔH, ΔGand ΔSwere obtained.

Quercitrin; DNA; fluorescence quenching; binding constant

10.13524/j.2095-008x.2016.03.040

2016-06-15

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12541674);國家自然科學(xué)基金資助項目(51102081)；黑龍江工程學(xué)院博士基金項目(2010BJ13)

喬春玉(1980-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，講師，碩士，研究方向：光譜化學(xué)分析，E-mail：jingjing_3939@sina.com。

O657.3

A

2095-008X(2016)03-0047-06