游泳運動對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響

欒海云 李娜王 桂華 許勇

濱州醫(yī)學院（山東煙臺264003）

游泳運動對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響

欒海云 李娜王 桂華 許勇

濱州醫(yī)學院（山東煙臺264003）

目的：探討游泳運動對D-半乳糖所致衰老小鼠學習記憶和膽堿能系統(tǒng)功能的影響。方法：50只昆明種小鼠隨機分成5組：對照組、模型組、15 min/天游泳組、30 min/天游泳組、45 min/天游泳組。除對照組外，所有小鼠連續(xù)8周皮下注射D-半乳糖復制衰老模型。運動組小鼠從第5周開始運動，連續(xù)4周。Morris水迷宮實驗評價小鼠空間學習記憶能力。行為測試結(jié)束后，檢測小鼠腦組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性及皮層和海馬組織中乙酰膽堿酯酶（AChE）和膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（ChAT）的活性。結(jié)果：水迷宮實驗結(jié)果顯示：15 min/天和30 min/天游泳組逃避潛伏期顯著短于模型組，目標象限搜索時間百分比、通過目標區(qū)域次數(shù)均顯著多于模型組。酶活性檢測結(jié)果顯示：15 min/天游泳組小鼠腦組織SOD顯著高于模型組，GSH-Px活性高于模型組但無顯著性，MDA含量顯著低于模型組；30 min/天游泳組小鼠腦組織SOD和GSH-Px活性均顯著高于模型組、MDA含量顯著低于模型組；15 min/天和30 min/天游泳組皮層和海馬組織中AChE、ChAT活性均顯著高于模型組。結(jié)論：15 min/天游泳運動和30 min/天游泳運動均能提高衰老模型小鼠的空間學習記憶能力，其中以30 min/天游泳運動的效果最好，其機制可能與其提高腦組織抗氧化和清除自由基能力，增強中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。

游泳運動；D-半乳糖；學習；記憶；膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)

膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的化學物質(zhì)，它沿著中膈、海馬、基底前腦系統(tǒng)投射到皮質(zhì)，傳導沖動反復出現(xiàn)，使之有可能學習新的知識［1］。研究證實運動能提高機體的認知能力，可預(yù)防和延緩衰老引起的記憶減退［2］，加速腦損傷后的恢復，促進患者心理健康［3，4］。運動鍛煉是人們?nèi)粘＝∩?、健心的主要方式，而運動的質(zhì)量和效果不一，這與運動的強度、方式以及時間有關(guān)。國內(nèi)外關(guān)于運動鍛煉對D-半乳糖動物認知功能干預(yù)的研究甚少。本研究采用D-半乳糖復制衰老模型，通過一系列行為學實驗和一些酶活性的檢測來評價衰老小鼠的學習記憶能力及運動鍛煉能否減輕衰老引起的認知功能障礙。

1　材料與方法

1.1動物分組

昆明種小鼠，50只，雄性，20±2 g，由山東綠葉制藥股份有限公司動物中心提供，使用許可證SCXK（魯）2005-0017。小鼠自由進食飲水，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自然光照。所有小鼠在第1周進行3次適應(yīng)性游泳，隨機分成5組，分別為：對照組、模型組、3個運動組：15 min/天游泳組，30 min/天游泳組和45 min/天游泳組。

1.2實驗方法

1.2.1給藥和運動方式

除對照組外，其他小鼠每日頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，每日1次，連續(xù)8周，對照組頸背部皮下注射等體積生理鹽水。從第5周開始，對照組和模型組不進行任何游泳訓練，將其余游泳組小鼠放入小水箱（80 cm×60 cm×40 cm，水箱四周光滑且高出水面20 cm，無法借力躍出），水溫30±1℃，小鼠在水箱中進行無負重游泳訓練，每周訓練5天，每天1次，分別游泳訓練15 min、30 min和45 min，然后休息2天，連續(xù)訓練4周。游泳結(jié)束將小鼠取出，用毛巾擦干，放回籠中。

1.2.2水迷宮實驗

在第8周開始進行小鼠空間學習記憶能力測試，參照Morris實驗方法［5］進行。實驗分為兩部分：（1）定位航行實驗：測量小鼠對水迷宮空間學習和記憶的獲取能力。實驗歷時5天，第1～4天，每天訓練2次。將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺時所需時間（即逃避潛伏期）。如果小鼠在60s內(nèi)未找到平臺，須將其引至平臺，讓動物在平臺上停留10s，這時潛伏期記為60 s。第5天測試小鼠尋找平臺潛伏期；（2）空間搜索實驗：在第6天撤除水下平臺，在同一入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄動物在原先放置平臺的象限所花的時間（目標象限搜索時間百分比）和進入該象限的次數(shù)（通過目標區(qū)域次數(shù)），作為空間記憶的檢測指標。

1.2.3樣本采集和指標測定

行為學實驗結(jié)束24 h后，所有小鼠眼球取血，隨后頸部脫臼處死，在冰袋上快速分離全腦。其中每組再從取出的全腦中分離5只小鼠的皮層及海馬并稱重，每組剩余的5只，只要全腦。分離出的全腦、皮層以及海馬，用預(yù)冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿，以轉(zhuǎn)速4000 r·min-1，4℃離心10 min，取上清液分裝于離心管中，冷凍保存于-20℃冰箱中待分析。全腦的組織勻漿用于檢測抗氧化酶活性，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）；皮層和海馬的組織勻漿用于檢測乙酰膽堿酯酶（AchE）和膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（ChAT）。GSH-Px、SOD、MDA、AChE和ChAT試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，所有指標測定嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析方法進行差異顯著性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1小鼠一般狀態(tài)觀察

從第7周開始，對照組小鼠行動活躍，反應(yīng)靈敏，毛色光滑；而模型組小鼠行動遲緩、毛發(fā)枯黃無光澤、自主活動明顯降低；游泳運動組與模型組相比有明顯改善。

2.2水迷宮實驗結(jié)果

由表1可見，8周后，模型組小鼠逃避潛伏期顯著長于對照組（P＜0.01），目標象限搜索時間百分比、通過目標區(qū)域次數(shù)顯著少于對照組（P＜0.01），說明衰老模型組小鼠造模成功。15 min/天和30 min/天游泳組逃避潛伏期顯著短于模型組，目標象限搜索時間百分比、通過目標區(qū)域次數(shù)均顯著多于模型組（P＜0.05，P＜0.01），尤以30 min/天游泳組的效果明顯；而45 min/天游泳組小鼠各指標較模型組無顯著差異（P＞0.05）。

表1　各組小鼠水迷宮實驗中定位航行實驗和空間搜索實驗結(jié)果比較（n=10）

2.3游泳運動對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織氧化酶活性的影響

由表2可知，模型組小鼠腦組織中SOD和GSH-Px活性均顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），而MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01）。15 min/天游泳組小鼠腦組織SOD顯著高于模型組（P＜0.05），GSH-Px活性高于模型組但無顯著性，MDA含量顯著低于模型組（P＜0.05）；30 min/天游泳組小鼠腦組織SOD和GSH-Px活性均顯著高于模型組、MDA含量顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），其中尤以30 min/天游泳組的效果明顯；而45 min/天游泳組小鼠各指標與模型組相比差異無顯著性（P＞0.05）。

表2　各組小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量的比較

2.4游泳運動對D-半乳糖致衰老小鼠皮層和海馬組織AChE和ChAT活性的影響

由表3可見，模型組小鼠皮層和海馬組織中AChE和ChAT活性均顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。15 min/天和30 min/天游泳組皮層和海馬組織中AChE、ChAT活性均顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），30 min/天游泳組小鼠酶活性提高更為顯著，而45 min/天游泳組與模型組之間無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3　各組小鼠皮層和海馬AChE和ChAT活性比較

3　討論

機體衰老是個復雜的變化過程，研究認為，各種原因引起的自由基損傷、氧化應(yīng)激和膽堿能神經(jīng)元的退化等是導致衰老的主要原因［6］。研究表明，運動鍛煉有助于延緩人類和動物的腦衰老。Van Praag等的研究證實跑步能促進小鼠海馬齒狀回的神經(jīng)再生和學習的長時程增強［7］。Erickson等的研究表明，有氧運動訓練可以提高老年人的海馬體積，改善記憶功能［8］。長期有規(guī)律的適宜運動可促進小鼠的空間學習記憶能力。

腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損傷及膽堿能神經(jīng)元丟失是老年性癡呆的主要病理改變，由此導致乙酰膽堿減少是造成學習記憶能力下降的直接原因。老年患者腦中膽堿能神經(jīng)元缺失、突觸前乙酰膽堿的合成降低、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性和對膽堿的攝取能力明顯下降，這些變化與患者的認知功能損害程度呈正相關(guān)［9］。AChE和ChAT都是膽堿能神經(jīng)元的標志酶。AChE可水解乙酰膽堿（ACh），生成乙酸和膽堿，終止神經(jīng)沖動傳遞，間接反映ACh代謝；ChAT是合成ACh的關(guān)鍵酶，ChAT活性升高，反映Ach合成、釋放、功能的恢復以及膽堿能神經(jīng)元數(shù)量、功能的恢復。

本實驗采用D-半乳糖連續(xù)8周皮下注射復制衰老模型，小鼠出現(xiàn)行動遲緩、毛發(fā)枯黃無光澤、食欲不振、自主活動明顯降低。行為學水迷宮實驗結(jié)果顯示，衰老模型組小鼠逃避潛伏期延長，目標象限搜索時間百分比下降，通過目標區(qū)域次數(shù)減少，說明本實驗的模型組小鼠的認知功能下降；15 min/天和30 min/天的游泳運動，可明顯改善D-半乳糖致衰老模型小鼠學習記憶功能障礙，同時明顯改善衰老小鼠大腦皮層和海馬組織內(nèi)AChE和ChAT活性。表明游泳運動增強衰老小鼠學習記憶功能的機制，可能與其改善衰老小鼠大腦皮層和海馬AChE和ChAT活性，恢復AChE和ChAT兩者之間的動態(tài)平衡，從而提高Ach含量，進而增強中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關(guān)。

生物體的衰老與自由基代謝失衡有關(guān)，許多學者認為氧化應(yīng)激在衰老發(fā)生過程中具有重要作用。自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類具有氧化活性的帶負電的離子，自由基的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡與人體的生理、病理、生長發(fā)育及疾病、衰老密切相關(guān)［10］。D-半乳糖皮下注射后，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進一步代謝而堆積在細胞內(nèi)，導致細胞腫脹，代謝紊亂，體內(nèi)活性氧水平升高，過量的氧自由基引起神經(jīng)元細胞的損傷，造成動物學習記憶能力下降及機體衰老［11］。

抗氧化結(jié)果顯示，游泳運動可提高衰老模型小鼠空間學習記憶能力，其機制可能與提高腦組織抗氧化和清除自由基的能力，減輕神經(jīng)細胞膜脂質(zhì)過氧化有關(guān)。本實驗結(jié)果表明15 min/天和30 min/天運動組均能不同程度升高小鼠腦組織SOD和GSH-Px活性，降低MDA的含量，提示游泳運動能有效地清除衰老機體過多生成的自由基，減輕自由基的損傷效應(yīng)，進而保護細胞免受氧化損傷，使機體各項生理功能得到明顯改善，起到延緩衰老的作用。

總之，游泳運動能改善衰老小鼠學習記憶能力，其機制與促進膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復、清除自由基、減輕氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)細胞損傷有關(guān)。

［1］楊翠翠，李林，張?zhí)m.常用阿爾茨海默病動物模型制備方法及評價［J］.成都醫(yī)學院學報，2013，8（4）：374-379.

［2］Voss MW，Nagamatsu LS，Liu-Ambrose T，et al．Exercise，brain，and cognition across the life span［J］.J Appl Physiol，2011，111（5）：1505-13．

［3］季瀏．體育鍛煉與心理健康［M］．上海：華東師范大學出版社，2006.

［4］FriedlandRP，F(xiàn)ritschT，SmythKA，etal．Patientswith Alzheimer′sdiseasehavereducedactivitiesinmidlife compared with healthy control-group members［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（6）：3440-5．

［5］Zhang Q，DU X，Xu Y，et al．The effects of Gouqi extracts on Morris maze learning in the APP/PS1 double transgenic mouse model of Alzheimer's disease［J］.Exp Ther Med. 2013，5（5）：1528-1530．

［6］SayreLM，PerryG，SmithMA.Oxidativestressand neurotoxicity［J］.Chem Res Toxicol.2008，21（1）：172-88.

［7］vanPraagH，ChristieBR，SejnowskiTJ，etal.Running enhances neurogenesis，learning，and long-term potentiation in mice［J］.Proc Natl Acad Sci，1996，96（23）：13427-31．

［8］Erickson KI，Voss MW，Prakash RS，et a1．Exercise training increases size of hippocampus and improves memory［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108（7）：3017-22．

［9］ParikhV，BernardCS，NaughtonSX，etal.Interactions between Aβ oligomers and presynaptic cholinergic signaling：Age-dependent effects on attentional capacities［J］.Behav Brain Res.2014，274：30-42.

［10］陳瑾等．衰老的自由基機制［J］.中國老年學雜志，2004，24（7）：677-679．

［11］Cui X，Zuo PP，Zhang Q，et al．Chronic systemic D-galactose exposureinducesmemoryloss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice：protective effects of R-a-Lipoic acid［J］.J Neurosci Res，2006，84（3）：647-654．

The Effects of Swimming Exercise on the Learning，Memory and Cholinergic System in Aging Mice

Luan Haiyun，Li Na，Wang Guihua，Xu Yong
Binzhou Medical College，Shandong，China 264003

Xu Yong，Email：maomx@163.com

Objective To explore the effect of swimming exercise on the learning，memory and cholinergic system in aging mice.Methods 50 mice were randomly assigned to control group，aging control group and 3 aging exercise groups.Except the control group，all mice were injected subcutaneously 150mg/kg of D-galactose once a day for 8 weeks.The mice in the three exercise groups respectively underwent swimming 15 minutes per day，30 minutes per day，and 45 minutes per day for 4 weeks.Morris water maze was used to evaluate the learning and memory ability of the mice.The activities of SOD，AChE，ChAT and GSH-Px，and the level of MDA were determined.Results The escaping latency was longer and the percentage of the time spending in target quadrant and the time going through target quadrant in 15-and 30-minute exercise groups were shorter than the aging control group significantly.The SOD activity was significantly higher and MDA concentration was significantly lower in 15-minute exercise group than in aging control group（P＜0.05）.The SOD and GSH-Px activities were significantly higher and MDA concentration was significantly lower in 30-minute exercise group than in aging control group.Comparing to the aging control group，the activities of AChE and ChAT in the cerebral cortex and hippocampus were significantly improved in exercise group，especially in 30-minute exercise group.Conclusion Exercise 30 minutes per day could significantly improve the learning and memory performances of aging mice induced by D-galactose，probably related to theenhanced ability of brain for against oxidation and for reducing free radicals，and to the improved function of cholinergic nerve system.

swimming，D-galactose，learning，memory，cholinergic system

2014.09.05

許勇，Email：maomx@163.com