半月板纖維軟骨細(xì)胞接種脫鈣松質(zhì)骨支架構(gòu)建組織工程半月板的方法選擇

張正政 王少杰 齊巖松 張繼英 江東 余家闊

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）

半月板纖維軟骨細(xì)胞接種脫鈣松質(zhì)骨支架構(gòu)建組織工程半月板的方法選擇

張正政 王少杰 齊巖松 張繼英 江東 余家闊

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）

目的：探討半月板纖維軟骨細(xì)胞（MFCs）接種脫鈣松質(zhì)骨（DCB）支架的最佳接種方法。方法：實(shí)驗(yàn)分靜滴法、注射法、離心法、負(fù)壓法等4組。取兔MFCs，采用上述4種方法對(duì)孔隙率為80%、平均孔徑為268 μm的DCB支架進(jìn)行細(xì)胞接種。Live/Dead染色檢測(cè)其細(xì)胞活性，并通過(guò)軟件分析其細(xì)胞分布情況。CCK-8法和Hoechst 33258法檢測(cè)支架內(nèi)MFCs增殖情況和支架內(nèi)DNA含量。結(jié)果：通過(guò)Live/Dead染色顯示，離心法接種細(xì)胞后其存活率優(yōu)于其他3組（P＜0.05）；細(xì)胞分布均勻，由淺至深各層細(xì)胞比例無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；1～5天細(xì)胞增殖能力優(yōu)于其他3組（P＜0.05），14～21天支架DNA含量亦優(yōu)于其他3組（P＜0.05）。結(jié)論：離心法可以明顯提高M(jìn)FCs在DCB上的細(xì)胞分布和細(xì)胞增殖能力，是一種簡(jiǎn)單、高效的，利于組織工程半月板（TEM）構(gòu)建的接種方法。

組織工程半月板；接種方法；半月板纖維軟骨細(xì)胞；脫鈣松質(zhì)骨

半月板損傷是運(yùn)動(dòng)損傷的常見(jiàn)病，目前半月板部分切除、縫合修復(fù)或是半月板移植等均無(wú)法達(dá)到非常滿意的療效［1-4］。組織工程半月板（tissue-engineered meniscus，TEM）的出現(xiàn)為修復(fù)或替換損傷半月板開(kāi)辟了新的途徑［5］。細(xì)胞接種是建立支架三維培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)，在TEM構(gòu)建中起重要作用［6］。由于半月板的復(fù)雜結(jié)構(gòu)組成，尤其是構(gòu)建它的支架要求體積較大，而目前各種種植方法不能均勻地、完全地將細(xì)胞種植其中［7］。接種方法一般分為直接接種和間接接種，其中直接接種包括靜滴法和注射法，是直接將細(xì)胞接種于支架表面或是內(nèi)部，結(jié)果不理想［8］。而文獻(xiàn)報(bào)道間接法是通過(guò)動(dòng)態(tài)過(guò)程將細(xì)胞接種于支架內(nèi)部，其接種結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)［9，10］。脫鈣松質(zhì)骨（demineralized cancellous bone，DCB）支架因其良好的生物活性及生物力學(xué)性能等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于組織工程［11-13］。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用半月板纖維軟骨細(xì)胞（meniscal fibrochondrocytes，MFCs）作為種子細(xì)胞，采用靜滴法、注射法、離心法、負(fù)壓法進(jìn)行接種，旨在探索何種方法效率更高，更利于構(gòu)建TEM。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中所用動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均通過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)論證和批準(zhǔn)。3個(gè)月齡新西蘭大白兔10只（體質(zhì)量為3 kg，雄性，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。Live/Dead染料（Invitrogen公司，美國(guó)），鬼筆環(huán)肽（Cytoskeleton公司，美國(guó)），胰蛋白酶、I型膠原酶、Hoechst 33258、小牛胸腺DNA、木瓜蛋白酶（Sigma公司，美國(guó)），CCK-8試劑盒（Dojindo Laboratories公司，日本），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)）等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1半月板纖維軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取新西蘭大白兔雙膝內(nèi)外側(cè)半月板，放入盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用含1%慶大霉素+鏈霉素的PBS沖洗3遍，眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊，然后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，再加入0.2%I型膠原酶37℃恒溫水浴搖床振蕩消化過(guò)夜。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來(lái)后，吹打，1000 rpm離心4 min，棄上清，PBS洗兩次，細(xì)胞按1×106/瓶重懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液1次，待細(xì)胞85%融合后傳代，實(shí)驗(yàn)用第三代細(xì)胞。

1.2.2脫鈣松質(zhì)骨支架制備

獲取成年豬股骨及脛骨干骺端松質(zhì)骨，剔除周圍肌肉、韌帶、肌腱以及骺端組織，用電動(dòng)擺鋸將其制作為1 mm厚骨片，自來(lái)水沖洗干凈，蒸餾水浸泡，用5%的鹽酸脫鈣2～3天，用濃度為1∶1的甲醇/氯仿液中脫脂24小時(shí)，用3%的雙氧水H2O2中浸泡4小時(shí)，以上各步驟間均用蒸餾水浸泡沖洗。用10 mm環(huán)鉆在脫鈣松質(zhì)骨片上卡壓后得圓形支架。冷凍干燥，包裝，Co60進(jìn)行消毒備用。通過(guò)掃描電鏡觀察脫鈣松質(zhì)骨的表面及斷面結(jié)構(gòu)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10幅照片，將掃面電鏡圖片導(dǎo)入Image-pro Plus software 6.0，使用測(cè)量工具進(jìn)行平均孔徑測(cè)定；孔隙率通過(guò)Adobe Photoshop 7.0軟件的直方圖（histogram）功能計(jì)算，以像素（pixel）代表孔隙面積。孔隙率=孔隙所占的像素/整個(gè)照片的像素。經(jīng)計(jì)算后DCB支架孔隙率為80%、平均孔徑為268 μm（圖1）。實(shí)驗(yàn)均采用以上統(tǒng)一表征形狀的支架。

圖1　脫鈣松質(zhì)骨支架大體觀（A）及電鏡掃描圖（B）

1.2.3細(xì)胞接種

靜滴法：MFCs消化，重懸，按0.5×106/支架，25 μl（濃度1×107/ml）緩慢滴注于支架上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 min后，再滴注剩余25 μl細(xì)胞懸液，4小時(shí)后緩慢從支架旁加入培養(yǎng)基，隔天換液；注射法：1 ml注射器取50 μl（濃度1×107/ml）細(xì)胞懸液，25 G針頭分別于支架頂部、底部、側(cè)壁對(duì)稱部位進(jìn)行注射，每次進(jìn)針1 mm，4小時(shí)后緩慢從支架旁加入培養(yǎng)基；離心法：將支架置于1.5 ml EP管底部，在支架上方緩慢滴注50 μl（濃度1×107/ml）細(xì)胞懸液，封口膠封閉管口，將離心管按500 rmp、2 min離心，再倒置EP管再次離心，反復(fù)3次。輕輕取出支架后，放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，4小時(shí)后緩慢從支架旁加入培養(yǎng)基；負(fù)壓法：將15 ml離心管對(duì)半裁剪，兩端用橡皮塞塞緊，并插入25 G針頭，消毒備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)頂端針頭連接1 ml注射器，底端針頭連接5 ml注射器，將支架放入容器中，擰緊橡皮塞形成密閉環(huán)境。先從上方注入50 μl（濃度1×107/ml）細(xì)胞懸液，下方注射器抽取負(fù)壓吸引懸液，再次由上方注入，下方負(fù)壓吸引，反復(fù)3次。輕輕取出支架后，放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，4小時(shí)后緩慢從支架旁加入培養(yǎng)基，隔天換液。

1.2.4支架上MFCs的活性及分布檢測(cè)

細(xì)胞種植24小時(shí)后，用Live/Dead染料進(jìn)行染色30 min，PBS沖洗15 min后，激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)并采集圖像，活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記為綠色（波長(zhǎng)488 nm），死細(xì)胞細(xì)胞核標(biāo)記為紅色（波長(zhǎng)568 nm）。圖像通過(guò)Image-pro Plus軟件計(jì)數(shù)活/死細(xì)胞并計(jì)算出細(xì)胞存活比例；通過(guò)Imaris軟件將圖像轉(zhuǎn)換成三維模型，并定量計(jì)算每層（100 μm）細(xì)胞分布比例。

1.2.5支架上MFCs形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞種植1周后，用鬼筆環(huán)肽作細(xì)胞骨架染色，Hoechest 33258標(biāo)記細(xì)胞核后用激光共聚焦顯微鏡觀察。具體操作：支架用PBS沖洗后4%多聚甲醛固定15 min，1%Triton X-100破膜30 min，鬼筆環(huán)肽作細(xì)胞骨架染色1 h，Hoechest 33258標(biāo)記細(xì)胞核15 min。激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)并采集圖像。

1.2.6支架上MFCs的增殖檢測(cè)

體外培養(yǎng)1、3、5天時(shí)，200 μl培養(yǎng)基中加入20 μl CCK-8工作液，37℃孵育2 h，收集培養(yǎng)液，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定培養(yǎng)基吸光度。

1.2.7支架上DNA含量測(cè)定

體外培養(yǎng)1、7、14、21天后，每個(gè)支架加入木瓜蛋白酶裂解液，60℃過(guò)夜消化裂解，取20 μl裂解液加入200 μl Hoechst33285工作液，37℃孵育20 min后檢測(cè)各孔熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，吸收波長(zhǎng)為460 nm）。以小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)支架內(nèi)DNA含量，然后以支架的濕重進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS l6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，3組及以上數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單或多因素方差分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則再采用LSD-t法進(jìn)行組間兩兩比較。兩組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用Student-t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1支架上MFCs活性檢測(cè)

通過(guò)Live/Dead染料對(duì)體外應(yīng)用4種接種方法接種的支架進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)4種接種方法均能使MFCs存活。如圖2所示，靜滴法（A）細(xì)胞主要分布于支架孔隙表面，且分布不均勻，細(xì)胞團(tuán)聚明顯；注射法（B）由于注射操作的原因?qū)χЪ茉斐善茐?，?xì)胞無(wú)法粘附于支架上，引起死細(xì)胞增多；離心法（C）細(xì)胞在支架孔隙周圍及細(xì)胞內(nèi)部都有分布，且分布均勻，無(wú)明顯重疊團(tuán)聚；而負(fù)壓法（D）由于負(fù)壓吸力將細(xì)胞懸液抽吸出支架，造成細(xì)胞種植數(shù)量下降。通過(guò)Image-pro Plus軟件對(duì)活/死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算出存活率（圖3A），離心法較其它種植方法種子細(xì)胞存活率高（P＜0.05）。

圖2　細(xì)胞活性示意圖

2.2支架上MFCs分布檢測(cè)

通過(guò)Imaris軟件將圖像轉(zhuǎn)換成三維模型（圖4），并定量計(jì)算每層（100 μm）細(xì)胞分布比例（圖3B）?？梢?jiàn)MFCs通過(guò)離心法種植后各層分布均勻，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而靜滴法和注射法，種子細(xì)胞分布于支架表面（200～300 μm），負(fù)壓法種子細(xì)胞數(shù)量較少且主要位于支架深部。

2.3支架上MFCs形態(tài)學(xué)觀察

如圖5所示，離心法（C）種植細(xì)胞細(xì)胞量較多，且細(xì)胞分布均勻呈立體分布，細(xì)胞保持其梭形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間形成橋接。而其他注射方法細(xì)胞數(shù)量少，分布分散，細(xì)胞形態(tài)孤立單一。

圖3　細(xì)胞存活率

圖5　支架上細(xì)胞形態(tài)示意圖

2.4支架上MFCs增殖及DNA含量檢測(cè)

通過(guò)CCK-8和DNA含量檢測(cè)（圖5），離心法接種MFCs在1～5天細(xì)胞增殖能力較其他方法明顯增強(qiáng)（P＜ 0.05）；14～21天支架上DNA含量亦優(yōu)于其他3組（P＜0.05），且隨時(shí)間增長(zhǎng)其有持續(xù)增殖能力。

圖6　支架上MFCs增殖及DNA含量檢測(cè)

3　討論

盡管文獻(xiàn)報(bào)道各種不同材料支架及種子細(xì)胞應(yīng)用于TEM的構(gòu)建，但是如何將種子細(xì)胞種植于支架上仍是首要解決的問(wèn)題［14］。既往文獻(xiàn)報(bào)道，種子細(xì)胞在支架上的分布和增殖等是保證組織工程構(gòu)建體最終生物功能的重要影響因素［15］。TEM由于其特殊的組織學(xué)和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，種子細(xì)胞接種效果多不理想，很難進(jìn)入支架深部且分布不均勻，不利于最終發(fā)揮其部分或完全替代損傷半月板的功能［8］。因此，本研究通過(guò)比較4種不同種植方法，旨在探索一種利于TEM構(gòu)建的合適接種方法。

文獻(xiàn)報(bào)道離心法適于種子細(xì)胞的接種［7，16］，但仍需要在接種的成本、操作的難易度和無(wú)菌程度等方面改進(jìn)。我們通過(guò)總結(jié)并改進(jìn)離心法，使其具有以下特點(diǎn)：（1）所有耗材設(shè)備均為商品化，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。（2）離心管可以根據(jù)支架的尺寸選擇不同大小規(guī)格，整個(gè)離心過(guò)程操作簡(jiǎn)捷并保證無(wú)菌。（3）本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MFCs可均勻一致地接種于DCB并發(fā)揮其生物學(xué)功能，為構(gòu)建TEM提供了一種合適的方法。

由于文獻(xiàn)報(bào)道離心可能影響細(xì)胞的增殖、基因的表達(dá)［17］，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)，結(jié)果表明離心法接種MFCs在細(xì)胞增殖能力等方面優(yōu)于其他方法，并且隨時(shí)間增長(zhǎng)其有持續(xù)增殖能力。離心速度及離心力的選擇同樣有爭(zhēng)議，高速離心可能會(huì)造成細(xì)胞碎裂和支架的破壞，影響最終的離心效果［18］。同時(shí)，不同的支架其孔徑大小、空心率等表征也會(huì)影響離心方法參數(shù)的選擇［18］。通過(guò)總結(jié)文獻(xiàn)及多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用的離心方法為通過(guò)500 rmp、2 min離心，再倒置EP管再次離心，反復(fù)3次。結(jié)果表明離心法MFCs的增殖和分布等優(yōu)于其他接種方法。

DCB具有較好的孔隙率（80%），具有一定的彈性和抗拉強(qiáng)度，多孔的三維結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞附著和增殖，同時(shí)含有細(xì)胞分化和增殖所需要的生物活性物質(zhì)，其體外降解時(shí)間約8～9周，無(wú)明顯組織和細(xì)胞毒性［11，12］。目前已有脫鈣松質(zhì)骨支架修復(fù)軟骨及骨缺損的研究報(bào)道，效果良好［13］。但尚未見(jiàn)到以脫鈣松質(zhì)骨為支架材料構(gòu)建TEM的相關(guān)研究。通過(guò)兔全身骨骼（脛骨平臺(tái)、股骨髁、股骨頭、肱骨髁、骨盆、脊柱）的解剖發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有一處松質(zhì)骨片可達(dá)到兔半月板大?。ㄍ冒朐掳宓那昂髲胶妥笥覐郊s為10 mm，寬度約為1～2 mm），難以滿足體內(nèi)移植的需要。因此，我們選擇用豬脛骨平臺(tái)及股骨遠(yuǎn)端的松質(zhì)骨作為支架材料，首先因?yàn)榻?jīng)過(guò)脫鈣和脫細(xì)胞處理后松質(zhì)骨主要?dú)堄郔型膠原支架，膠原的分子結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的保守性，種屬間差異較小，抗原性較低［19］；其次本課題組應(yīng)用異種異體豬半月板經(jīng)處理后移植到兔膝關(guān)節(jié)體內(nèi)，6周后已無(wú)明顯免疫排斥反應(yīng)，不影響半月板的存活［20］。

本實(shí)驗(yàn)4種接種方法的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下：靜滴法是目前組織工程最普遍應(yīng)用的接種方法，其易于操作，但是本實(shí)驗(yàn)通過(guò)3D建模證實(shí)種子細(xì)胞很少進(jìn)入支架內(nèi)部，多位于支架表層；注射法通過(guò)針頭可以將種子細(xì)胞種植于支架內(nèi)部及特定部位，但是由于其侵入性造成支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，影響種子細(xì)胞的粘附，最終導(dǎo)致其存活率下降；負(fù)壓法可以解決細(xì)胞進(jìn)入支架內(nèi)部的問(wèn)題，但是由于負(fù)壓吸引力，導(dǎo)致種子細(xì)胞分布不均勻，多位于支架深層或是被吸出支架造成滲漏，最終也影響種植的效果。

總之，本研究結(jié)果表明離心法可以明顯提高M(jìn)FCs在DCB上的細(xì)胞分布和細(xì)胞增殖能力，是一種簡(jiǎn)單、高效的，利于組織工程半月板（TEM）構(gòu)建的接種方法。本實(shí)驗(yàn)的主要不足是未能將更多的接種方法和不同的種子細(xì)胞和支架材料納入，下一步將納入更多的方法和材料進(jìn)行比較研究，以進(jìn)一步尋找適合TEM構(gòu)建的細(xì)胞接種技術(shù)。

［1］Holzer LA，Leithner A，Holzer G.Surgery versus physical therapy for meniscal tear and osteoarthritis［J］.N Engl J Med，2013，369（7）：677.

［2］馮華，張輝，洪雷，等.半月板移植的早期臨床療效分析［J］.中華骨科雜志，2010，30（4）：351-356.

［3］章亞?wèn)|，侯樹(shù)勛，張軼超，等.關(guān)節(jié)鏡下同種異體半月板移植的療效分析［J］.中華骨科雜志，2010，30（2）：175-181.

［4］顏斌，敖英芳，龔熹，等.同種異體半月板移植和半月板切除術(shù)后中期臨床效果比較［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2015，34（1）：5-9.

［5］周預(yù)，劉玉杰，黃靖香，等.兔半月板脫細(xì)胞基質(zhì)的制備［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，1：62-65+115-116.

［6］Yang TH，Miyoshi H，Ohshima N.Novel cell immobilization method utilizing centrifugal force to achieve high-density hepatocyte culture in porous scaffold［J］.J Biomed Mater Res，2001，55（3）：379-386.

［7］Roh JD，Nelson GN，Udelsman BV，et al.Centrifugal seeding increases seeding efficiency and cellular distribution of bone marrow stromal cells in porous biodegradable scaffolds［J］. Tissue Eng，2007，13（11）：2743-2749.

［8］Thevenot P，Nair A，Dey J，et al.Method to analyze threedimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds［J］.Tissue Eng Part C Methods，2008，14（4）：319-331.

［9］Kim BS，Putnam AJ，Kulik TJ，et al.Optimizing seeding and culturemethodstoengineersmoothmuscletissueon biodegradable polymer matrices［J］.Biotechnol Bioeng，1998，57（1）：46-54.

［10］Xiao YL，Riesle J，Van Blitterswijk CA.Static and dynamic fibroblast seeding and cultivation in porous peo/pbt scaffolds［J］.J Mater Sci Mater Med，1999，10（12）：773-777.

［11］Fu WL，Zhou CY，Yu JK.A new source of mesenchymal stem cellsforarticularcartilagerepair：Mscsderivedfrom mobilizedperipheralbloodsharesimilarbiological characteristics in vitro and chondrogenesis in vivo as mscs from bone marrow in a rabbit model［J］.Am J Sports Med，2014，42（3）：592-601.

［12］Huang H，Zhang X，Hu X，et al.Directing chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells with a solidsupported chitosan thermogel for cartilage tissue engineering［J］.Biomed Mater，2014，9（3）：035008.

［13］Huang H，Zhang X，Hu X，et al.A functional biphasic biomaterial homing mesenchymal stem cells for in vivo cartilage regeneration［J］.Biomaterials，2014，35（36）：9608-9619.

［14］Rongen JJ，van Tienen TG，van Bochove B，et al.Biomaterials in search of a meniscus substitute［J］.Biomaterials，2014，35（11）：3527-3540.

［15］Baker BM，Mauck RL.The effect of nanofiber alignment on thematurationofengineeredmeniscusconstructs［J］. Biomaterials，2007，28（11）：1967-1977.

［16］Ng R，Gurm JS，Yang ST.Centrifugal seeding of mammalian cells in nonwoven fibrous matrices［J］.Biotechnol Prog，2010，26（1）：239-245.

［17］Li J，Jiang L，Liao G，et al.Centrifugal forces within usuallyused magnitude elicited a transitory and reversible change in proliferation and gene expression of osteoblastic cells umr-106［J］.Mol Biol Rep，2009，36（2）：299-305.

［18］Godbey WT，Hindy SB，Sherman ME，et al.A novel use of centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds［J］. Biomaterials，2004，25（14）：2799-2805.

［19］Goble EM，Kohn D，Verdonk R，et al.Meniscal substitutes--human experience［J］.Scand J Med Sci Sports，1999，9（3）：146-157.

［20］Jiang D，Zhao LH，Tian M，et al.Meniscus transplantation using treated xenogeneic meniscal tissue：Viability and chondroprotection study in rabbits［J］.Arthroscopy，2012，28（8）：1147-1159.

An Optimal Method for Seeding Meniscal Fibrochondrocytes into Demineralized Cancellous Bone Scaffolds

Zhang Zhengzheng，Wang Shaojie，Qi Yansong，Zhang Jiying，Jiang Dong，Yu Jiakuo
Institute of Sports Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing，China 100191

Jiang Dong，Email：bysyjiangdong@126.com；Yu Jiakuo，Email：yujiakuo@126.com

Objective The purpose of the study is to explore an optimal method for seeding meniscal fibrochondrocytes（MFCs）into demineralized cancellous bone（DCB）scaffolds.Methods Statics，injection，centrifugation and vacuum methods of inoculation were used to seed the MFCs into the DCB scaffolds（composed of 80%porosity and 268 μm pore size）.Cell viability was assessed by fluorescence staining and its distribution by a softwear of reconstructed three-dimensional image.The Cell Counting Kit-8 assay and DNA assay were employed to assess the cell proliferation.Results The survival rate of the MFCs were significantly improved via centrifugal seeding as compared to the other three seeding methods（P＜0.05）. Seeded MFCs using centrifugation revealed more homogeneous distribution throughout the scaffold as compared to the other three seeding methods.There was no significant differences in the penetration depth in the scaffold of seeded MFCs by the three seeding methods（P＞0.05）.The reproductive activity of MFCs in day 1 to 5 and the level of DNA in the scaffold in the day 14 to day 21 of the centrifugal group surpassed the other three groups（P＜0.05）.Conclusion The centrifugal seeding method could significantly improve MFCs distribution and proliferation on the DCB scaffolds，providing a simple and effective cell-seeding procedure for tissue-engineered meniscus.

seedingmethod，meniscalfibrochondrocytes，demineralizedcancellousbone，tissueengineered meniscus

2015.10.28

863主題項(xiàng)目（2012AA020502）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31200725）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（51273004）

江東，Email：bysyjiangdong@126.com；余家闊，Email：yujiakuo@126.com