流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測定亞胺培南的研究

李曉璐，翟 倩，俞宏松，郭 晶，易 鋼

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

亞胺培南是一種既有廣譜抗菌活性，又有β-內(nèi)酰胺酶抑制作用的β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性、陰性的需氧和厭氧菌具有抗菌作用，其中包括對(duì)其他抗生素不敏感或耐藥的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和脆弱擬桿菌[1]。亞胺培南在臨床上應(yīng)用極為廣泛，因此，其質(zhì)量控制對(duì)預(yù)防應(yīng)用過程中不良反應(yīng)事件的發(fā)生具有重要意義。目前,亞胺培南含量的測定方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[2 - 5]、親水相互作用色譜(HILIC)法[6]、分光光度法[7,8]。其中，HPLC法、HILIC法存在操作復(fù)雜、分離條件苛刻、分析成本高等缺點(diǎn)，分光光度法方便易行，但其選擇性和準(zhǔn)確性較低。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法將傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光分析法與流動(dòng)注射技術(shù)相結(jié)合，不僅使該方法具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、儀器設(shè)備簡單[9]等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析法反應(yīng)條件不易控制，試劑消耗大，難以保證樣品與發(fā)光試劑快速、高度、有效混合等缺點(diǎn)，使得許多傳統(tǒng)溶液處理方法的基本操作得以在線、快速、密閉地完成[10]。該方法被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)、氨基酸等多種生命活性物質(zhì)的檢測以及金屬離子、有機(jī)化合物等的分析測定，大大提高了生物、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)分析的檢測水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，在堿性介質(zhì)中，亞胺培南對(duì)魯米諾-K3[Fe(CN)6]化學(xué)發(fā)光體系有很強(qiáng)的增敏作用，據(jù)此建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測定亞胺培南的新方法，并采用該方法對(duì)注射液中亞胺培南含量進(jìn)行測定，回收率為99.4%～101.8%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測試系統(tǒng)(西安邁瑞電子有限公司)；KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器公司)；Millipore-Q純水儀(密理博(中國)公司)。

亞胺培南對(duì)照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；魯米諾、NaOH、 K3[Fe(CN)6]等試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 溶液配制

亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(4.0×10-4g/mL)：準(zhǔn)確稱取0.0200 g亞胺培南對(duì)照品，用水溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋至所需濃度。魯米諾儲(chǔ)備溶液(2.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.0354 g，用0.1 mol/L NaOH溶液逐級(jí)稀釋。K3[Fe(CN)6] 儲(chǔ)備溶液(2.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.0659 g K3[Fe(CN)6]，用水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋至所需濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)裝置如圖1所示。實(shí)驗(yàn)過程中，從反應(yīng)裝置的a、b、c、d四個(gè)流路中泵入的溶液經(jīng)六通閥(V)在流通檢測池(F)中充分混勻并發(fā)生明顯的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)經(jīng)光電倍增管(PMT)進(jìn)行放大檢測。該體系的對(duì)照信號(hào)(流路a為水)記為I0，增敏信號(hào)(流路a為亞胺培南)記為Ia，用相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度△I進(jìn)行定量(△I=Ia-I0)。

1.4 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

精確吸取適量亞胺培南對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用去離子水稀釋，分別制得1.0×10-6、2.0×10-6g/mL的亞胺培南溶液。將這兩個(gè)不同濃度的亞胺培南溶液與空白溶液進(jìn)行測定，研究亞胺培南-Luminol-K3[Fe(CN)6]體系的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明：該體系的反應(yīng)為快速化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，從試劑混合到化學(xué)發(fā)光信號(hào)達(dá)到最大值僅需 7 s，同時(shí)可以看出在亞胺培南存在下化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯著增強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器參數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了5～20 s采樣時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度的變化，結(jié)果表明當(dāng)采樣時(shí)間為5 s時(shí)，體系的信噪比最大?？疾炝?00～800 V范圍內(nèi)的光電倍增管負(fù)高壓對(duì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度和信噪比的影響，結(jié)果表明相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨著負(fù)高壓的增高而增強(qiáng)，但負(fù)高壓過高會(huì)導(dǎo)致信噪比的下降，因此本實(shí)驗(yàn)選擇的負(fù)高壓為600 V。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是快速反應(yīng)，蠕動(dòng)泵泵速對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系有明顯的影響。實(shí)驗(yàn)考察了蠕動(dòng)泵泵速對(duì)該體系的影響，結(jié)果表明靈敏度隨著蠕動(dòng)泵泵速的增加而降低，為了兼顧靈敏度和分析速度，本實(shí)驗(yàn)選擇的蠕動(dòng)泵泵速為30 r/min。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1流路的選擇本實(shí)驗(yàn)研究了3種反應(yīng)物順序：(1)(亞胺培南+魯米諾)+(NaOH+K3[Fe(CN)6])；(2)(亞胺培南+K3[Fe(CN)6])+(NaOH+魯米諾)；(3)(亞胺培南+NaOH)+(魯米諾+K3[Fe(CN)6])，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在第一種進(jìn)樣順序中，亞胺培南的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度△I的測定結(jié)果最大且穩(wěn)定。因此選取第一種進(jìn)樣順序?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的最佳流路。

2.2.2堿性介質(zhì)及其濃度的選擇實(shí)驗(yàn)分別考察了0.06 mol/L的NaOH、NaHCO3和Na2CO3三種堿性介質(zhì)對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系的影響。結(jié)果表明，在NaOH溶液中，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選擇NaOH為堿性介質(zhì)?？疾炝薔aOH溶液濃度在0.01～0.14 mol/L范圍內(nèi)對(duì)△I的影響，結(jié)果表明：相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨著NaOH濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.08 mol/L時(shí)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較大，濃度繼續(xù)增大，△I增大幅度減小。因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.08 mol/L的NaOH作為最佳堿性介質(zhì)。

2.2.3K3[Fe(CN)6]濃度的選擇K3[Fe(CN)6]是該化學(xué)發(fā)光體系中的氧化劑?？疾炝薑3[Fe(CN)6]濃度在1.0×10-5～4.5×10-5mol/L范圍內(nèi)對(duì)體系相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。研究結(jié)果表明：△I隨K3[Fe(CN)6] 濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到3.0×10-5mol/L時(shí)△I較大，濃度繼續(xù)增大后△I趨于穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)選擇的K3[Fe(CN)6]為3.0×10-5mol/L。

2.2.4魯米諾濃度的選擇考察了魯米諾在0.2×10-5～1.6×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：△I隨魯米諾濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.8×10-5mol/L時(shí)，△I最大，之后△I趨于穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)選取的魯米諾濃度為0.8×10-5mol/L。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限及精密度

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，亞胺培南在4.0×10-8～4.0×10-6g/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光的增敏強(qiáng)度△I呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程為：△I=197.88+3.19×109c，相關(guān)系數(shù)為0.9987，對(duì)濃度分別為2.0×10-6g/mL和2.0×10-7g/mL的亞胺培南進(jìn)行11次平行測定得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%和1.4%。按照IUPAC建議，以3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算出方法的檢測限為1.1×10-8g/mL。

2.4 干擾試驗(yàn)

2.5 樣品分析

2.5.1生物樣本分析取健康志愿者抗凝血漿，測定時(shí)，準(zhǔn)確稱取一定量的亞胺培南，加入到100 μL的血漿中，并稀釋至線性范圍內(nèi)，為待測血漿樣品。按上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，用所建立的方法進(jìn)行血漿中亞胺培南的含量測定，回收率為97.3%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.5%(n=9)。本法可用于血漿中亞胺培南含量的測定。

2.5.2亞胺培南注射液的測定及回收試驗(yàn)采用0.9%的生理鹽水溶解亞胺培南將其制成濃度為1.0×10-2g/mL注射液，將注射液稀釋至線性范圍內(nèi)，按上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測定亞胺培南的含量，同時(shí)分別按照高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表1。

表1 亞胺培南注射液測定及回收試驗(yàn)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用亞胺培南對(duì)魯米諾-K3[Fe(CN)6]化學(xué)發(fā)光體系具有的強(qiáng)烈增敏作用，建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測亞胺培南的新方法。該方法的檢測限為1.1×10-8g/mL，加標(biāo)回收率在99.7%～101.8%范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度高、分析速度快、線性范圍寬、檢測限低，可用于亞胺培南含量的測定。